הפרעות מטבוליות הן בין אחת המחלות הנפוצות ביותר בבני אדם. אורגניזם המודל גנטי הצייתן ד melanogaster יכול לשמש כדי לזהות גנים רומן שמווסתים את חילוף חומרים. מאמר זה מתאר שיטה פשוטה יחסית המאפשרת ללמוד את קצב חילוף חומרים בזבובים על ידי מדידת ייצור CO 2 שלהם.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
הפרעות מטבוליות הן בעיה שכיחה המשפיעה על בריאות אדם. לכן, הבנת המנגנונים המווסתים את חילוף חומרים היא משימה מדעית חשובה. יש גנים מחלה גורמת רבים בבני האדם homologue לטוס, מה שהופך את דרוזופילה מודל טוב ללמוד מסלולי איתות מעורבים בהתפתחות של הפרעות שונות. בנוסף, העקיבות של דרוזופילה מפשטת מסכי גנטיים כדי לסייע בזיהוי מטרות טיפוליות חדשניות שעשויים לווסת את חילוף החומרים. על מנת לבצע מסך כזה שיטה פשוטה ומהירה לזיהוי שינויים במצב מטבולים של זבובים היא הכרחית. באופן כללי, ייצור פחמן דו חמצני הוא אינדיקטור טוב של הוצאה חמצון המצע והאנרגיה מתן מידע על מצב מטבולים. בפרוטוקול זה אנו מציגים שיטה פשוטה למדידת CO 2 פלט מזבובים. טכניקה זו יכולה באופן פוטנציאלי לסייע בזיהוי של הפרעות גנטיות המשפיעות על קצב חילוף חומרים.
מבוא
המחזור של Kreb יוכימיים מייצר ATP באמצעות החמצון של אצטט נגזרים מפחמימות, שומנים, חלבונים וייצור CO 2. בדרוזופילה, O 2 קלט בקורלציה ישירה עם CO 2 פלט ומשקף את רמת חילוף החומרים 1. לכן, מדידה של CO פלט 2 בהצלחה נעשתה שימוש במחקרים הקשורים להזדקנות ואת חילוף חומרים של 2-5. הנה המעבדה שלנו שינתה הגדרות ניסיוניות תוכננו בעבר, המאפשרת מדידה של 2 CO בייצור עד שמונה עשר דגימות ללא צורך בציוד מיוחד. אחרים ויש לנו השתמשנו בעבר בשיטה זו כדי להראות הבדלים בקצב חילוף חומרים בזבובים שחסרים בחלבון ניוון השרירים קשור, Dystroglycan (DG) 6-8.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הכנת Respirometers
- חותכים את קצה פיפטה 1,000 μl בסכין גילוח כדי לאפשר החדרה של micropipette נימי 50 μl, לנסות להשיג את קצה פיפטה ישרה ככל האפשר.
- מניחים פיסת הקצף לתוך פיפטה ולדחוף אותו בקצה פיפטה.
- להוסיף כמות קטנה של CO 2 סופגים ולהכיל אותו על ידי פיסת הקצף שנייה.
- החל דבק במקום שבו micropipette מוכנס לתוך קצה פיפטה.
- השאר א....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
על מנת להראות כי השיטה היא רגישה מדדנו CO 2 ייצור מסוג בר (אורגון R) זכר עף ב18, 25, ו29 מעלות צלזיוס וזבובים שעברו מוטציה לDG. זבובים הועלו ב ° C25 ולאחר מכן עברו לטמפרטורה הניסיונית במשך 5 ימים לפני המדידה. כצפוי למיני ectothermic זה, כמות ה-CO 2 המיוצרת גדל עם טמפרטורה (איור 2). בעבר הראינו כי דיאטה ללא סוכר מפחיתה את קצב חילוף החומרים של שניהם סוג בר המוטציה Dg עפה 7. אובדן Dg מוביל לרמות חיל.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה זולה ואמינה למדידת 2 ייצור CO בזבובים. מצאנו כי ניסוי זה הוא קל, מהיר לביצוע ומייצר נתונים לשחזור כי הוא בהסכם עם מחקרים אחרים 1, 6, 9. הפרוטוקול המתואר כאן ניתן לשנות בקלות כדי להתאים את חומרי התקציב וזמין של כל מעבדה. הבנייה של כל respirometer הבודד ניתן להתאים כל עוד התא נשאר אטום. עם זאת, ארוך יותר, דק יותר micropipettes מציע יותר דיוק מעל קצר יותר. השימוש בתא החיצוני יכול להיות אופציונלי כל עוד אין שינויי טמפרטורה ולחץ סביבה.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
יש לנו מה למסור.
תודות
ברצוננו להודות לאגודת מקס פלנק למימון המחקר שלנו.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| BlauBrand IntraMark 50 ומיקרו; l מיקרופיפטות | VWR | 612-1413 | |
| סודה ליים | וואקו | CDN6847 | |
| Eosine | סיגמא | 031M4359 | ניתן להשתמש בכל צבע שיכול ליצור צבעוניות גלויה של נוזל |
| פיתוח שכבה דקה Chromatorgaphy (TLC) VWR | 21432-761 | כל תא זכוכית שקוף שניתן לסגור עם המכסה | |
| חומר הרדמה, ערכת Lull-A-Fly Flinn | FB1438 | ||
| Power Gel Glue | Pritt | ||
| 1 מ"ל קצות פיפט | כל | ||
| קצף | כל | ||
| שפכטל פלסטיצ'ין | כל | ||
| אזמל | כל | ||
| פינצטה |
מקורות
- Van Voorhies, W. A., Khazaeli, A. A., Curtsinger, J. W. Testing the "rate of living" model: further evidence that longevity and metabolic rate are not inversely correlated in Drosophila melanogaster. J Appl Physiol. 97, 1915-1922 (2004).
- Ross, R. E.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
