מאמר שיטה

חיטוט Microarrays חלבון פונקציונלי בצפיפות גבוהה לזיהוי חלבונים אינטראקציות

7.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/51872

⸱

2 באוגוסט 2015

 ,  , 
1Department of Genetics, Stanford University, 2Stanford Center for Genomics and Personalized Medicine, Stanford University

במאמר זה

סיכום

באמצעות מערכי חלבון המכיל כמעט את כל ס proteome cerevisiae הוא חקר לחקירה משוחדת מהירה של אלפי אינטראקציות חלבון-חלבון במקביל. שיטה זו יכולה להיות מנוצלת למולקולת חלבון קטן, שינוי posttranslational, ומבחנים אחרים בתפוקה גבוהה.

תקציר

microarrays חלבון הפונקציונלי בצפיפות גבוהה המכיל ~ 4,200 חלבוני שמרי רקומביננטי נבחנים לאינטראקציות חלבון-חלבון קינאז באמצעות חלבון היתוך הזיקה מטוהרת השמרים קינאז המכיל תג V5-epitope לקריאה החוצה. קינאז המטוהר מתקבל באמצעות התרבות של זן שמרים מותאמים לייצור חלבון גבוה עותק מחסה פלסמיד המכיל היתוך קינאז-V5 לבנות תחת אמרגן מושרה GAL. השמרים הוא גדלו בתקשורת כובל עם מקור פחמן ניטראלי עבור 6 שעות אחרי אינדוקציה עם גלקטוז 2%. בשלב הבא, התרבות שנקטפו וקינאז הוא מטוהר באמצעות טכניקות chromatographic זיקה סטנדרטית להשיג קינאז חלבון נקי במיוחד לשימוש בassay. קינאז המטוהר מדולל עם חיץ קינאז לטווח מתאים עבור assay וmicroarrays החלבון חסום לפני הכלאה עם microarray החלבון. לאחר ההכלאה, המערכים מששו עם antib V5 חד שבטיody לזהות חלבונים מחויבים לחלבון קינאז-V5. לבסוף, המערכים נסרקים באמצעות סורק microarray סטנדרטי, והנתונים מופק לניתוח אינפורמטיקה במורד הזרם 1,2 לקבוע אמון גבוה שנקבע של אינטראקציות חלבון לאימות במורד הזרם in vivo.

מבוא

הצורך לבצע ניתוחים הגלובליים של ביוכימיה של חלבונים ומחייבים פעילות בvivo הביא לפיתוח שיטות החדשות לאפיון אינטראקציות בין חלבונים (PPIs) ולאחר translational השינויים של proteomes כל 1,3-8. microarrays חלבון מיוצרים כmicroarrays פונקציונלי חלבון באמצעות חלבונים פונקציונליים באורך מלא 4-6,8,9, או microarrays חלבון אנליטיים המכיל נוגדני 10,11. הם מתוכננים להכיל בצפיפות גבוהה של חלבונים ערוכים על גבי שקופיות מיקרוסקופ עם מגוון רחב של chemistries משטח כדי להקל על מגוון של תנאי ניסוי הנדרשים לביצוע ביוכימיים רחבים מנתחת 12. chemistries Nitrocellulose ומשטח אלדהיד לקובץ מצורף כימי באמצעות שיטות ליזין או קובץ מצורף זיקה כגון מגלשות chelated ניקל לחיבור חלבונים וגלוטתיון מתויג לקובץ מצורף זיקה בין יתר 13.

השימוש בmicroarrays חלבון הפונקציונלי כדי לזהות אינטראקציות חלבון-חלבון דורש גישה לספריית חלבון פונקציונלי באיכות גבוהה 14. ס cerevisiae ניתנים להפקת ספרייה כגון דרך הזיווג של גבוה עותק זיקה מתויג מבני חלבון עם טכניקות טיהור chromatographic תפוקה גבוהה. הרוב המכריע של שמרי הגנום כבר רצף וכמעט כל proteome יכולה לבוא לידי ביטוי מגבוה עותק פלסמיד לטיהור וביוכימיים מנתחים 12. ברגע שהחלבונים מתקבלים וערוכים בפורמט 384 גם, הם מודפסים על גבי שקופית מיקרוסקופ המאפשרת ניתוח מהיר מקביל רב פרמטרית ביוכימיים וחקירה bioinformatic 8,14-16. microarrays החלבון שימש עבור מבחני האנזימטית ואינטראקציות עם חלבונים, שומנים, מולקולות קטנות, וחומצות גרעין בין יישומים רבים אחרים. הנגישות של חלבונים על פני השטח של proteomeמערכים להפוך אותם נוחים לסוגים שונים של זיהוי אנליטיים כוללים, חיסון-זיקה, משטח Plasmon תהודה, הקרינה ורבים טכניקות אחרות. יתר על כן, היא מאפשרת לבקרה טובה של תנאי הניסוי שבו זה יכול להיות קשה לעשות in vivo.

המטרה של פרוטוקול זה היא להדגים את השימוש המתאים של microarrays חלבון הפונקציונלי כדי לזהות אינטראקציות חלבון-חלבון. יישום זה מאפשר הניתוח ביוכימי המקביל תפוקה גבוהה של פעילות חלבון מחייב שימוש אנליטי נקי במיוחד (חלבון) של עניין. C-מסוף (carboxy מסוף) מתויג חלבון פיתיון V5-היתוך של העניין מופק מפלסמיד גבוה עותק בזן שמרים מותאמים לטיהור חלבונים. תיוג C-המסוף מבטיח כי החלבון באורך מלא תורגם. החלבון השתמש במחקר זה הוא קינאז חלבון היתוך Tda1-V5, אשר מטוהר באמצעות שרף זיקת ניקל באמצעות תג His6X. CONSTRUC היתוך Tda1-V5לא מטוהר באמצעות elution הסידורי באמצעות שיפוע imidazole לelute שבריר ביותר המועשר לשימוש בassay.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. בדיקה הכנה

  1. תרבות ולטהר את בדיקות קינאז V5-היתוך משמשות לבחינת אינטראקציות עם חלבונים אחרים כדלקמן:
    1. השתמש Y258 זן שמרים טריים מפוספס (מאטה pep4-3, his4-580, ura3-53, leu2-3,112) המכיל חלבון V5-היתוך (הביע מפאי-DEST52 GATEWAY הווקטור). השתמש בחלבון המבודד כבדיקה על microarrays. צלחת השמרים על שלם-אורציל הסינתטי (SC-Ura) / 2% דקסטרוז / אגר ולגדול על 30 מעלות צלזיוס במשך 3 ימים מתרבות קפוא (° גליצרול מניית -80 מעלות).
    2. לחסן תרבויות המתנע (5-20 מיליליטר) ממושבה אחת ולגדול בין לילה בSC-Ura / 2% דקסטרוז על רועד פלטפורמה (220-250 סל"ד) או גלגל על ​​30 מעלות צלזיוס.
    3. למחרת בבוקר, לחסן 400 מיליליטר של SC-Ura 2% raffinose התרבות / עם תרבות המתנע מספיק כדי OD סופי 600 של 0.1.
    4. לגדול inoculums לOD 600 של 0.6 ואחריו האינדוקציה גלקטוז של פו V5-קינאזשיאון לבנות ביטוי על ידי הוספת פתרון של תמצית שמרי 3x / Peptone (כן) בתוספת 6% גלקטוז, על ידי הוספה מספיק כדי לדלל את תקשורת האינדוקציה בפקטור של 3, כך שהריכוז הסופי של גלקטוז הוא 2%.
    5. לגרום לתאים על 30 מעלות צלזיוס במשך 6 שעות על פלטפורמה רועדת. השתמש בבקבוק ליטר Erlenmeyer 2 כדי להבטיח אוורור מתאים.
    6. קציר תאים באמצעות JA-10 (או דומה) הרוטור על ידי ספינינג 400 מיליליטר של השעיה תא XG ב 1000 במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס.
    7. לשטוף את התאים פעם אחת עם 50 מיליליטר של קרח הקר PBS חיץ ולהעביר צינור חרוטי 50 מיליליטר. שטוף את הכדור שוב במאגר PBS קר כקרח (ללא חומרי ניקוי או תוספים אחרים) המשמשים לתמוגה והעברת 2 מיליליטר snap-כובע צינורות לתמוגה.
    8. ספין התאים ב 20,000 XG דקות 1 ב 4 ° C לגלולה ופיפטה משם למאגר.
    9. מניחים צינורות על קרח ולהמשיך בשלב תמוגה.
    10. Lyse התאים (גלולה 250-350 μl) עם 0.5 מ"מ חרוזים zirconia ב1: 1: 1 נפח תא גלולה, חרוזים, ונאגר מלוח פוספט (PBS) תמוגה חיץ ומערבולת התערובת באמצעות פלטפורמת תסיסה 3 פעמים ב 2 מרווחי דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
    11. צנטריפוגה lysate ב -20,000 XG בmicrofuge שולחן במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
    12. supernatant פיפטה לתוך צינור צנטריפוגות במהירות גבוהה פוליקרבונט ולהבהיר ידי ulracentrufugation למשך 30 דקות ב 150,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס.
    13. העבר את lysate הבהיר לצינור המכיל שרף prewashed Ni 2 + זיקה (~ 100 μl) דגירה על nutator לשעה 2 ב 4 ° C כדי ללכוד היסטידין 6X (שלו) מתויג חלבון V5-היתוך.
    14. לשטוף את השרף שלוש פעמים במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס עם הצפת לשטוף. גלולה השרף באמצעות צנטריפוגות בראש טבלה במשך 5 דקות XG ב 1000 ב 4 מעלות צלזיוס ולשאוב supernatant. הוסף חוצץ לשטוף טרי לכל אחד לשטוף ולהחזיר את הצינור לnutator תסיסה במהלך השטיפה.
    15. לאחר STE לשטוףנ.ב. שלמים, להחיל את השרף שטף לעמודת G-25 טרי לelution.
    16. החל 25 μl של חיץ elution באופן צעד חכם מתחיל עם 100 מ"מ Imidazole 500 מ"מ imidazole במרווחים של 50 מ"מ עבור הסכום כולל של 9 שברים.
    17. Assay השברים שנאספו באמצעות ג'ל polyacrylamide סולפט dodecyl נתרן (SDS-עמוד) וצביעת coomassie לזהות את השבר (ים) המועשר הגבוהה ביותר לשימוש בassay ולהוסיף גליצרול 30% ולאחסן ב -80 ° C עד שימוש ב assay.

2. גשוש מערכים

הערה: אנא ראה שלב 2.6 סעיף זה כדי להכין את פתרון הנוגדנים לפני תחילת assay.

  1. כדי לזהות אינטראקציות, לדלל את הנוגדן מצומדות V5-fluorophore (כלומר AlexaFluor 647) 260 / מיליליטר ng במאגר בדיקה ומערבבים היטב על ידי רועד.
    הערה: הכן פתרון 30 דקות לפני שימוש ומניח את הצינור על nutat זה נוגדןאו או גלגל כדי להבטיח ערבוב מלא והשעיה הומוגנית של נוגדן.
  2. לדלל את הבדיקה חלבון V5-היתוך על פני טווח ריכוז של 5-500 מיקרוגרם / מיליליטר.
    הערה: אופטימלי עבור כל assay אינטראקציה בין חלבונים, באמצעות חיץ בדיקה. אופטימיזציה כוללת הוספה עוד בדיקות כדי לבחון חיץ. בדרך כלל 10 מיקרוגרם / מיליליטר משמש כנקודת התחלה ומותאמת בהתאם מבוסס על עוצמת האות.
  3. הסר את microarrays החלבון מהמקפיא (-20 ° C) ומביא ל4 מעלות צלזיוס במקרר רק לפני השימוש.
  4. להוסיף חיץ חסימה ישירות לבעל השקופית המכיל את חלבון micorarrays ולכסות את החלק העליון עם parafilm כדי למנוע דליפה. לחסום את מערכי חסימת חיץ במשך שעה 1 על ידי רועד ב 50 סל"ד בשלב ב 4 ° C.
  5. לאחר החסימה, להעביר את המערכים לתא humidified המקורר עד 4 ° C, ולהוסיף 90 μl של בדיקה דילול ישירות על פני המערך. כיסוי ARRays עם תלוש מרים גדל ודגירת סטטי (לא רועד) בתא humidified ב 4 מעלות צלזיוס במשך 1.5 שעות.
  6. שטוף את המערכים 3 פעמים 1 דקות כל אחד בחיץ בדיקה בשלושה צינורות 50 מיליליטר חרוטי. הוסף את השקופיות לצינורות חרוטי המכילים מאגר בדיקה טרום צונן מספיק כדי המעטפה השקופית לחלוטין. לאפשר להחליק המרים להחליק בעדינות את של microarray החלבון (לא מכריח אותו כמו זה יכול לגרום נזק למשטח המערך).
  7. החל פתרון הנוגדן ישירות למערך מייד לאחר שסיים את השטיפה (שלב 2.5) והשכבה עם תלוש מרים גדל כמו קודם. דגירה המערכים למשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס בתא humidified.
  8. לבצע את אותה שלב לשטוף כמו קודם (דקות 3 פעמים 1 בחיץ בדיקה), וספין בצינור חרוטי 50 מיליליטר ב 800 XG בצנטריפוגה שולחן במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. אוויר יבש המערכים בהחזיק שקופיות בחושך במשך 30 דקות לפני סריקת המערך ב647 ננומטר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

פעילות האינטראקציה בין חלבונים נצפתה באמצעות קורא שבבים סטנדרטי על מנת להעריך את היתוך החלבון kinase Tda1-V5 לבנות כחלבון פיתיון נגד microarray חלבון פונקציונלי שמרים המכיל כ -4,200 ס הייחודי חלבוני GST-היתוך cerevisiae. חקירה נוספת עם תוכנת GenePix גילתה שפע של אירועים מחייבים של עוצמות משתנות. הזיקה הייתה ללמוד מהעוצמת המדורגת של האות נגזרת מנוגדנים מצומדות V5-Fluorophore חד שבטיים חייבים היעד שלה (V5-קינאז). אלגוריתם ניקוד ProCat 2 שימש לזהות אינטרא...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הפרוטוקול שהוצג במקור מבוצע באמצעות 85 חלבוני היתוך קינאז-V5 שמרי חלבון ייחודיים כדי להשוות פעילות מחייבת בין משפחות שונות וקשורות של קינאזות שמרי חלבון וכתוצאה מכך ההזדהות של רשתות האינטראקציה קינאז החדשות in vivo 1. כטכנולוגית פרופיל proteomic מתעוררים, הפיתוח של תפוקה גבוהה (HTP) הקרנת proteomes באמצעות מערכי חלבון הסתמך על ספריות פפטיד, ואורגניזמים מודל אוקריוטים ופרוקריוטים 8,17; מאוחר יותר, פלטפורמת assay זה הייתה מוחלת על אאוקריוטים גבוהים יות...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מענק מה-NIH. הבדיקות המוצגות באיור 1 בוצעו על ידי ד"ר ג'וזף פאסולו. אנו מודים לד"ר רועי חן על הערותיו המועילות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צלחות פטריVWRNC-10747או תמצית
שמרים בקטוDifco0217-17
Bacto peptoneDifco0118-17
Bacto agarDifco0140-01
DextroseSigmaD9434
RaffinoseSigmaR0514
GalactoseSigmaG0750
Sc-Ura נשירה מדיהMP Bio114410622
צינורות תרבית קטניםVWR/Fisher
בקבוק גדול ErlenmeyerVWR/Fisher
צנטריפוגה רוטור
צינורות צנטריפוגה (500 מ"ל)
צינור בז (50 מ"ל)VWR/Fisher21008-951
טבליות PBSSigmaP4417
צינורות FastPrep (צינור
מכונת FastPrep MPBiomedicals116004500
חרוזי זירקוןBioSpec11079105
Triton X100SigmaP4417
DTTSigmaD9779
MgCl2SigmaM8266 
NaClSigmaS3014 
אימידזול (pH = 7.4)SigmaI5513 
PMSFSigma93482
קוקטייל מעכב שלם (ללא EDTA)קוקטייל מעכב פוספטאז Roche
1סיגמאP2850
BSAסיגמאA2153 
Tween-20SigmaP1379 
ATP סיגמאA1852 
אינקובטור טלטול (30 מעלות; C)
Nickel Affinity ResinLife TechnologiesR901-01
G25 עמודהGE מדעי החיים27-5325-01 
NutatorVWR/Fisher
SDS-PAGE ג'ל (NuPage)Life Technologies
Coomassie Blue StainLife Technologies
מונוקלונלי V5 נוגדןLife TechnologiesR960-25
Alexa647 מתויג מונוקלונלי V5 נוגדןחיים טכנולוגיות451098
מיקרו-מערכי חלבון KitLife TechnologiesPAH0525013
Genepix סורקמכשירים
מרים החלקותתומאס סיינטיפיקhttp://www.thomassci.com/Supplies/Microscope-Cover-Glass/_/LIFTER-SLIPS/
מאגר ליזה: 0.1% טריטון X-100, 0.5 מ"מ DTT,
2 מ"מ MgCl2, 500 מ"מ NaCl, 50 מ"מ אימידזול (pH 7.4), קוקטייל מעכב פרוטאז שלם – ללא EDTA, קוקטייל מעכב פוספטאז 1, 1 מ"מ PMSF  (הוסף ממש לפני השימוש)		הוסף את הריאגנטים ל-1x PBS (0.01 M מאגר פוספט, 0.0027 M אשלגן כלורי, 0.137 M נתרן כלורי; pH 7.4) כדי להשיג את הנפח הרצוי של תמיסת ליזה
מאגר חוסם: 1% אלבומין בסרום בקר (BSA), 0.1% Tween-20הוסף את הריאגנטים ל-1x PBS כדי להשיג את הנפח הרצוי של מאגר
חסימהמאגר בדיקה: 2 מ"מ MgCl2, 0.5 מ"מ DTT, 0.05% טריטון X-100, 50 מ"מ NaCl, 500 μ M ATP (עבור קינאזות), 1% BSAהוסף את המגיב ל-1x PBS כדי להשיג את הנפח הרצוי של מאגר הבדיקה
מאגר כביסה: 0.1% טריטון X-100, 500 מ"מ NaCl, 0.5 מ"מ DTT, 50 מ"מ אימידזול (pH 7.4), 2 מ"מ MgCl2הוסף את המגיב ל-1x PBS כדי להשיג את הנפח הרצוי של מאגר
הבדיקהמאגר פליטה: 0.1% Triton X-100, 0.5 mM DTT, 2 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 50 – 500 מ"מ אימידזול (pH 7.4), קוקטייל מעכב פרוטאז מלא – קוקטייל מעכב פוספטאז ללא EDTA, 1 מ"מ PMSF (הוסף ממש לפני השימוש)לפני שמתחילים, חשוב לשים לב לשיפוע הריכוז של אימידזול (50 – 500 מ"מ) וליצור צינורות נפרדים לכל ריכוז (רצוי ליצור את המרווח במרווחים של 50 מ"מ). הוסף את המגיב ל-1x PBS כדי להשיג את הנפח הרצוי של מאגר בדיקה
3x YEP +6% גלקטוז: ממיסים 30 גרם תמצית שמרים ו-  60 גרם פפטון ב-700 מ"ל של H2O, וחיטוי. יש להוסיף 300 מ"ל גלקטוז 20% גלקטוז מעוקר במסנן (משקל/נפח)  אין לבצע חיטוי גלקטוז
דומות JA-10 מכסה בורג 2 מ"ל) 11873580001 מולקולריים

מקורות

  1. Fasolo, J., et al. Diverse protein kinase interactions identified by protein microarrays reveal novel connections between cellular processes. Genes. 25, 767-778 (2011).
  2. Zhu, X., Gerstein, M., Snyder, M. ProCAT: a data analysis approach for protein microarrays. Genome biology. 7, R110(2006).
  3. Breitkreutz, A., et al. A global protein kinase and phosphatase interaction network in yeast. Science. 328, 1043-1046 (2010).
  4. Gavin, A. C., et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature. 415, 141-147 (2002).
  5. Jeong, J. S., et al. Rapid identification of monospecific monoclonal antibodies using a human proteome microarray. Mol Cell Proteomics. 11 (6), (2012).
  6. Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440, 637-643 (2006).
  7. Popescu, S. C., et al. Differential binding of calmodulin-related proteins to their targets revealed through high-density Arabidopsis protein microarrays. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 4730-4735 (2007).
  8. Zhu, H., et al. Global analysis of protein activities using proteome chips. Science. 293, 2101-2105 (2001).
  9. Ptacek, J., et al. Global analysis of protein phosphorylation in yeast. Nature. 438, 679-684 (2005).
  10. Haab, B. B. Antibody arrays in cancer research. Molecular & cellular proteomics. Mol Cell Proteomics. 4 (4), 377-383 (2005).
  11. Kopf, E., Zharhary, D. Antibody arrays--an emerging tool in cancer proteomics. The international journal of biochemistry & cell biology. 39, 1305-1317 (2007).
  12. Berrade, L., Garcia, A. E., Camarero, J. A. Protein microarrays: novel developments and applications. Pharmaceutical research. 28, 1480-1499 (2011).
  13. Balboni, I., Limb, C., Tenenbaum, J. D., Utz, P. J. Evaluation of microarray surfaces and arraying parameters for autoantibody profiling. Proteomics. 8, 3443-3449 (2008).
  14. Gelperin, D. M., et al. Biochemical and genetic analysis of the yeast proteome with a movable ORF collection. Genes & development. 19, 2816-2826 (2005).
  15. Fasolo, J., Snyder, M. Protein microarrays. Methods Mol. Biol. 548, 209-222 (2009).
  16. Im, H., Snyder, M., et al. Preparation of recombinant protein spotted arrays for proteome-wide identification of kinase targets. Current protocols in protein science. Coligan, J. E. 27, Unit 27 24(2013).
  17. MacBeath, G., Schreiber, S. L. Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination. Science. 289, 1760-1763 (2000).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

V5

מאמרים קשורים