מאמר שיטה

Immunodetection של החלבונים בממברנה חיצוניים על ידי cytometry הזרימה של מיטוכונדריה מבודדת

DOI:

10.3791/51887

⸱

18 בספטמבר 2014

 ,  , 
1Department of Biochemistry, Université de Montréal, CRCHUM, 2Department of Neurosciences, Université de Montréal, CRCHUM

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שתואר כאן הוא שיטה לאיתור וללכמת חלבוני קרום חיצוני של המיטוכונדריה ידי immunolabeling של מיטוכונדריה מבודדת מרקמת מכרסמים וניתוח על ידי cytometry זרימה. שיטה זו ניתנת להארכה על מנת להעריך היבטים פונקציונליים של אוכלוסיות המיטוכונדריה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיטות לאיתור ולמעקב אחר רכיבי חלבון קרום חיצוניים של המיטוכונדריה ברקמות של בעלי חיים הן חיוניות כדי ללמוד פיזיולוגיה ופתופיזיולוגיה של המיטוכונדריה. פרוטוקול זה מתאר טכניקה שבה מיטוכונדריה מבודדת מרקמת מכרסם הם immunolabeled ונותחה על ידי cytometry זרימה. המיטוכונדריה הוא מבודד מחוט השדרה של מכרסמים ונתונים לצעד העשרה מהיר כדי להסיר מיאלין, חומר מזהם ביותר של שברים במיטוכונדריה הוכנו מרקמת עצבים. אז מיטוכונדריה המבודדת מסומנות עם נוגדן של בחירה ונוגדנים משני מצומדות fluorescently. ניתוח על ידי cytometry זרימה מאמת את טוהר היחסי של הכנות המיטוכונדריה על ידי צביעה עם צבע ספציפי של המיטוכונדריה, ואחריו איתור וכימות של חלבון immunolabeled. טכניקה זו היא מהירה, לכימות ותפוקה גבוהה, המאפשר לניתוח של מאות אלפי מיטוכונדריה לדגימה. זה ישים להערכת p רומןroteins על פני השטח של המיטוכונדריה בתנאים פיסיולוגיים נורמלים, כמו גם חלבונים שעשויות להפוך mislocalized לאברון זה בפתולוגיה. חשוב לציין, בשיטה זו ניתן מצמידים את צבעי מחוון ניאון כדי לדווח על פעילויות מסוימות של אוכלוסיות המיטוכונדריה ואינה ריאלי למיטוכונדריה ממערכת העצבים המרכזית (מוח וחוט השדרה), כמו גם בכבד.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המיטוכונדריה הם אברונים מאוד דינמיים שעוברים סבבים רבים של ביקוע והיתוך, מועברים לאתרים של ביקוש לאנרגיה גבוהה ולהגיב במהירות לגירויים פיסיולוגיים 1. מאז הוא מוכר מיטוכונדריה שיותר ויותר בתוך רקמות שונות, תאים סלולריים שונים אפילו, יש לי פרופילים תפקודיים שונים, יש צורך בשיטות חדשות לזיהוי תת המיטוכונדריה השונה אלה.

מיקרוסקופית מספקת אמצעי לפיו ניתן דמיין המיטוכונדריה פרט ואת הנוכחות של חלבון באו במיטוכונדריה יכול להיקבע על ידי immunofluorescence 2. עם זאת, ניתוח כמותי בשיטה זו הוא עבודה אינטנסיבית ומתאים יותר לניסויים באמצעות שורות תאים הונצחו או עיקריות. המחקר של המיטוכונדריה פרט נגזרת מרקמות הוא באופן משמעותי יותר קשה ורוב השיטות אינן מאפשרות זיהוי קל של תת המיטוכונדריה במקביל לevaluני של פונקציה של המיטוכונדריה 3.

כדי להתמודד עם המשוכה הזאת, שיטה חדשנית לimmunolabel מיטוכונדריה מבודדת מרקמות מכרסמים ולאחר מכן נותחה על ידי cytometry זרימה פותח. זה מאפשר לאיתור והכימות של חלבונים מקומיים לקרום החיצוני של המיטוכונדריה, אשר בהשוואה לניתוח על ידי מיקרוסקופ המהיר, היא הרבה פחות עבודה אינטנסיבית ומאפשרת הניתוח של אלפי מיטוכונדריה במדגם יחיד. assay זה יכול להיות מיושם כדי לפקח על הגורל וכמות היחסית של חלבוני קרום החיצוניים של המיטוכונדריה שנחשבים לconstitutively נוכח במיטוכונדריה, הגיוס של חלבונים על פני השטח של המיטוכונדריה, או זיהוי של חלבוני mislocalized למיטוכונדריה במצבים פתולוגיים. יתר על כן, השילוב של צבעי מחוון ניאון קונבנציונליים מאפשר ההערכה בו זמנית של היבטים מסוימים של תפקוד המיטוכונדריה בהמיטוכונדריה שונהאוכלוסיות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעלי חיים המשמשים במחקר זה, טופלו לפי קפדן לפרוטוקול (N08001CVsr) שאושר על ידי de l'אוניברסיטת מונטריאול ועדת מרכז דה המשוכללת והנדירה מרכז du Hospitalier (CRCHUM) המוסדית להגנה על בעלי חיים העוקב תקנים לאומיים כפי שתואר על ידי הקנדי מועצה על טיפול בבעלי חיים (CCAC).

הכן את כל חומרים כימיים הנדרשים לביצוע פרוטוקול זה (טבלת 1). ניתן למצוא את כל הפרטים נוספים בנוגע לציוד, אספקה ​​וספקים ברשימה של חומרים.

figure-protocol-1
טבלת 1 יצירות הצפת.

1 אוסף של חוט השדרה עכברוש

  1. עמוק לטשטש את העכברוש (ספראג Dawley) עם isoflorane 4%. ודא הרדמה על ידי היעדר רפלקס על צביטה של ​​הבכפו דואר. להרדים את העכברוש על ידי עריפת ראש באמצעות הגיליוטינה. שיטה זו של המתת חסד עדיפה על פני שעלול לעוות את חוט השדרה, אחרים.
  2. חותך את העור של הגב לחשוף את עמוד השדרה. חותך את עמוד השדרה במספריים עצם בדיוק מעל עצם האגן. דמיין את הפתיחה של עמוד השדרה.
  3. הכנס מזרק 10 מ"ל, עם טיפ 200 μl פיפטה (מצורף באמצעות המסת מעט מעל להבה), מלא בופר פוספט (PBS), לעמוד השדרה.
  4. לשטוף את חוט השדרה על ידי מריחת כמות בינונית של לחץ לבוכנה.
  5. אם כל דם נמצא על חוט השדרה, לשטוף עם PBS לפני שתמשיך לשלב הבא.
    הערה: שיטה זו גם אומתה למוח ובכבד. אם כולל רקמות אלה, לאסוף מחצית המוח מהחולדה מורדמים וחתיכת כבד במשקל שווה לחוט השדרה. כל הצעדים אחרים יישארו זהים.

.2 בידוד של חוט השדרה Mitochondria (מעובד מתוך אל ונדת ולד ואח. 4)

  1. לאסוף את כל חוט השדרה שלם ומקום בhomogenizer זכוכית 5 מ"ל עם 5 כרכים (~ 3.25 מ"ל) Homogenization חוצץ (HB). להתאוששות אופטימלית של המיטוכונדריה המבודדת, לבצע את כל הצעדים על קרח או בחדר קר. Homogenize רקמה ביד עד שלא חתיכות גדולות של רקמה תישאר, שמונה כ שבץ. הנח homogenate בשני (2 מ"ל) או שלושה (1.7 מ"ל) microcentrifuge צינורות. צנטריפוגה XG 1,300 10 דקות ב 4 ° C בmicrocentrifuge המעבדתיים.
  2. להתאושש supernatant ומקום בצינור ultracentrifuge 5 מ"ל. הוספת HB 750 μl (~ 0.5 כרכים) לצינור microcentrifuge המכיל גלולה ובעדינות resuspend גלולה. צנטריפוגה וresuspension חזור על השלבים עוד פעמיים. בריכה כל supernatants (S1A וS1b) לתוך צינור ultracentrifuge 5 מ"ל מעל. צעד זה משמש להסרת קטנה פסולת.
  3. צנטריפוגה נקוותה S1 באמצעות ultracentrifuge מצויד בריקבון דלי מתנדנדאו ו צנטריפוגות ב XG 17,000 עבור 15 דקות ב 4 ° C.
  4. שמור supernatant (S2) לעיבוד נוסף אם חלק cytosolic הוא עניין (לדוגמא לניתוח כתם מערבי). Resuspend גלולה (P2), את החלק היחסי של המיטוכונדריה הגולמי, בHB מ"ל 4 + 50 מ"מ KCl. צנטריפוגה XG 17,000 עבור 15 דקות ב 4 ° C בהרוטור דלי מתנדנד. בטל supernatant ועדינות resuspend גלולה (P3) ב800 HB μl.
    הערה: המיטוכונדריה נשטפים עם HB + 50 מ"מ KCl כדי להסיר כל מזהמי mitochondrially הקשורים שאינם ספציפיים.
  5. בצינור ultracentrifuge 5 מ"ל חדש, להוסיף μl בדיוק 800 של גלולה מושעה (P3).
  6. לצינור הזה להוסיף, 200 μl של iodixanol (בינוני שיפוע צפיפות), ובכך ליצור ריכוז סופי של 12% iodixanol. מערבבים את התוכן של הצינור בעדינות, אך ביסודיות באמצעות pipetting עם P1000. תוספת של iodixanol הראשון, ולאחר מכן גלולה resuspended (P3) עשויות להיות עדיפות כדי להקל על ערבוב יסודי. צנטריפוגה בultracentrifuge מצויד בהרוטור דלי מתנדנד ב17,000 XG במשך 15 דקות ב 4 ° C.
  7. הערה: הכבד אינו מכיל מיאלין ולכן בשלב זה הוא לא הכרחי אם רק הכבד נמצא בתהליך עיבוד. עם זאת, אם כבד נמצא בתהליך עיבוד במקביל למיטוכונדריה CNS, מומלץ לטפל בכל הרקמות באופן שווה.
  8. לשאוב את שכבת המיאלין בחלק העליון של הצינור ובזהירות להסיר ולסלק supernatant. גלולה עשויה להיות רופפת. Resuspend גלולה ב4 HB מ"ל. צנטריפוגה שוב ב17,000 XG 10 דקות ב 4 ° C.. בטל supernatant וresuspend גלולה ב4 HB מ"ל. חזור על צנטריפוגה ולהסיר את supernatant.
  9. Resuspend גלולה הסופי (P7) ב100-200 HB μl ולהעביר לצינור 1.7 מ"ל microcentrifuge. מדגם זה מכיל מיטוכונדריה המבודדת.
  10. המשך לכימות חלבון. לדלל דגימות והעקומה סטנדרטית ב2% סולפט dodecyl נתרן (SDS), כדי להבטיח solubilization נאות של duri מיטוכונדריהכימות חלבון ng.

.3 Immunolabeling של מיטוכונדריה מבודדת לcytometry הזרימה

  1. עבור כל תערובת כתמים להיבדק, פיפטה 25 מיקרוגרם של מיטוכונדריה המבודדת לתוך צינור 1.7 מ"ל microcentrifuge. כולל מדגם בלא כתם בכל ניסוי; ועבור כל נוגדן, הקפד לכלול מדגם לשליטת אלוטיפ המתאים.
  2. צנטריפוגה ב XG 17,000 עבור 2 דקות ב 4 ° C בmicrocentrifuge ספסל העליון.
  3. הסר supernatant וresuspend מיטוכונדריה המבודדת ב50 μl המיטוכונדריה חוצץ (M Buffer) בתוספת 10% BSA חופשי חומצות שומן ל15 דקות ב 4 ° C (צעד חסימה).
    הערה: במהלך תיוג, לבצע incubations במקרר ב 4 מעלות צלזיוס.
  4. הוספת נוגדן ראשוני (ארנב נגד Mfn2, 20 מיקרוגרם למ"ל) לצינור ודגירה של 30 דקות ב 4 ° C..
    הערה: קביעת ריכוז אופטימלי של כל נוגדן באופן אמפירי על ידי טיטרציה. בשל שונות בריכוז ו / או purity, הרבה שונה של אותו הנוגדן מאותו היצרן עלול להוביל לתוצאות שונות; לכן טיטרציה נחוצה לכל מגרש חדש של נוגדן.
  5. לשטוף את הנוגדן מאוגד עיקרי: צנטריפוגה ב 17,000 XG למשך 2 דקות ב 4 ° C. הסר את supernatant ועדינות resuspend גלולה ב200 μl M הצפת. צנטריפוגה ב XG 17,000 עבור 2 דקות ב 4 ° C.. הסר supernatant וresuspend גלולה ב50 μl M הצפת.
  6. הוספת נוגדנים משני (נגד הארנב IgG החמור Phycoerythrin (PE), 0.5 מיקרוגרם למ"ל) לצינור ודגירת דגימות ל30 דקות ב 4 ° C, מוגן מפני אור.
  7. לשטוף את הנוגדנים משני מאוגדים: צנטריפוגה ב 17,000 XG למשך 2 דקות ב 4 ° C. הסר את supernatant וresuspend גלולה ב200 μl M הצפת. צנטריפוגה ב XG 17,000 עבור 2 דקות ב 4 ° C.. הסר supernatant וresuspend גלולה ב500 μl M הצפת.
  8. כדי להבטיח אירועים נמצאים במיטוכונדריה עובדה, מיטוכונדריה כתם מבודד עםצבע מיטוכונדריה ספציפי ניאון ל15 דקות ב RT, המוגן מפני אור. אם הכתמה של פרמטרים אחרים תפקודיים (פוטנציאל הטרנסממברני המיטוכונדריה או ייצור סופראוקסיד) היא רצויה, המשך לשלב .4 אם לא, המשיכו לשלב 5 לרכישה.
    הערה: חשוב לוודא שספקטרום הפליטה של ​​הנוגדנים משני בקנה אחד עם זו של הצבעים הפונקציונליים. לדוגמא, אם אימות טוהר המיטוכונדריה עם צבע מסחרי עם תכונות ספקטרליות דומות לפוטנציאל FITC והטרנסממברני עם תיל אסטר Tetramethylrhodamine (TMRM), נוגדנים משני קיימא יהיה allophycocyanin (APC: ננומטר אקס 650 / Em 660 ננומטר). להוסיף בקרות פיצויים, כלומר, מדגם immunolabeled או מוכתם עם fluorophore יחיד, כאשר החלים.
  9. מעבירים צינור מתאים לזרימת טעינת cytometer. (כדי להקל על גודל המדגם הקטן, צינור microtiter ממוקם בתוך 3 מ"ל לזרום cytometer צינור.) שמור על דגימות קרח ולפנות מייד ללזרום cytometer לרכישה.

.4 Assaying מיטוכונדריאלי הטרנסממברני פוטנציאלי ומיטוכונדריאלי Superoxide ייצור על ידי cytometry הזרימה

  1. ודא שיש לי מיטוכונדריה המבודדת פוטנציאל הטרנסממברני שלם על ידי צביעה עם 100 ננומטר TMRM (548 ננומטר / ננומטר 574 Em Ex) 5, בשלב 3.8, ל15 דקות ב RT, מוגנות מפני אור. לשם השוואה של פוטנציאל הטרנסממברני בין דגימות ואוכלוסיות, שימוש בריכוזים שאינן מרווה / תחתונה של TMRM (1 עד 30 ננומטר), עשוי להיות מתאים יותר 6.
    1. כביקורת מכתים TMRM, מיטוכונדריה המבודדת כתם עם 100 ננומטר TMRM בנוכחות של הידרזין פניל ​​מ-כלורו ציאניד קרבוניל 100 מיקרומטר (CCCP), uncoupler המיטוכונדריה שdepolarize מיטוכונדריה. הריכוז של CCCP נדרש depolarize מיטוכונדריה עשוי להיות פחות אם ריכוזים נמוכים יותר של צבע משמשים.
  2. ודא שמיטוכונדריה המבודדת לייצר סופראוקסיד המיטוכונדריה ידי staining עם מחוון סופראוקסיד המיטוכונדריה מתאים 7, גם בשלב 3.8, ל15 דקות ב RT, מוגנות מפני אור.
    1. כביקורת לייצור סופראוקסיד המיטוכונדריה, מיטוכונדריה המבודדת כתם עם צבע בנוכחות 10 מיקרומטר Antimycin, מעכב של הקומפלקס III של שרשרת הנשימה שתגביר את ייצור סופראוקסיד המיטוכונדריה.

.5 רכישה וניתוח של Immunolabeled מבודד המיטוכונדריה על ידי cytometry הזרימה

  1. מכשיר להגדיר: מתחי החלף ליניארי כדי להיכנס למצב כדי להקל על ניתוח של מיטוכונדריה המבודדת ומתחים שנקבעו (FSC: 450; SSC: 250). להבטיח כי אירועים נאספים בFSC-מצב (אזור), כמו גם FSC-W (רוחב) וFSC-H (גובה), כדי להיות מסוגל להוציא כפילויות (כלומר, שני אירועים, שעוברים דרך גלאים באותו הזמן ) באוסף של הודעה נתונים ניתוח. הגדר את מספר האירועים שייגבה ל100,000. לרכוש בקרות פיצוי, אם ישים.
  2. רכישת נתונים: לפני רכישת נתונים, להימנע vortexing דגימות. במקום לערבב בעדינות על ידי הקשה על צינור. בתחילה לאסוף אירועים בלחץ נמוך, בgating. שער באוכלוסייה. התאם מתחים של היסטוגרמות בהתאם, בדרך כלל השיא של המדגם בלא כתם יהיה מתאים לעשור השני (10 2). ברגע שהשערים הוקמו, ודגימות שנמצאות בעיבוד, הלחץ יכול להיות מופעל עד גבוה.
  3. ניתוח: דמיין כפילויות על ידי התוויית FSC-W לעומת FSC. לזהות singlets וכפילויות. השער בsinglets. בחר את אוכלוסיית המיטוכונדריה על ידי gating על אירועים שהם מוכתמים חיובי עם צבע המיטוכונדריה סלקטיבי.
  4. לקבוע תיוג רקע משליטת אלוטיפ. שימוש במדגם שליטת אלוטיפ, לקבוע את אחוז תיוג אוכלוסיית המיטוכונדריה החיובי לנוגדני Mfn2.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיטוכונדריה נובעת ממייתרי השדרה עכברוש ניתן immunolabeled עם נוגדן הממוקד לMitofusin2 (Mfn2), חלבון מעורב באיחוי של הקרום החיצוני של המיטוכונדריה 8. בעקבות בידוד ותיוג עם נוגדן ספציפי Mfn2 ונוגדנים משני מצומדות fluorescently, מיטוכונדריה מעובדות על ידי cytometry זרימה (איור 1). בעקבות רכישת נתונים, דגימות מנותחות באמצעות cytometry זרימת תוכנה לניתוח, על ידי לדמיין את כל האירועים שנאספו על מגרש נקודה (איור 2 א) הראשון. כפילויות וsinglets...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זה בא לידי ביטוי יותר ויותר כי המיטוכונדריה הן שחקני מפתח בשני פיזיולוגיה ומחלות נורמליות. בעוד immunoblotting יכול לקבוע אילו חלבונים נמצאים בתוך המיטוכונדריה או על פני השטח של המיטוכונדריה במצב מסוים, דיווחים בשיטה זו בממוצע של האוכלוסייה כולה. שיטה זו לא יכולה להניב מידע על שכיחותם היחסית של תת אוכלוסיות או תת המיטוכונדריה. למרות שזה היה בעבר הניח כי כל מיטוכונדריה נוצרו באותה מידה, השדה הוא הכרת המיטוכונדריה שבתוך תא יותר ויותר יש לי שונות רבות במונחים של מורפולוגיה ו / או פונ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יש לי המחברים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לורי Destroismaisons ושרה Peyrard לתמיכה טכנית יוצאת מן הכלל וDr.Alexandre פרת לגישה לcytometer הזרימה. אנחנו רוצים גם להודות ד"ר טימותי מילר על תרומתו בעניין הסרת המיאלין מההכנות. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הקנדי לבריאות מחקר (CIHR) Neuromuscular מחקר שותפות, קרן הקנדית לחדשנות, חברת ALS של קנדה, הקרן פריק לחקר ALS, צ'אם קרן וFonds דה לה המשוכלל והנדיר en סנטה du קוויבק (CVV). CVV וNA שניהם מחקר חוקרים של Fonds דה לה משוכלל ונדיר en סנטה du קוויבק וCIHR חדשים חוקרים. SP נתמך על ידי טים הנואלים Studentship מהחברה ALS של קנדה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
חולדותקוד זן נהר צ'ארלס400ניתן להשתמש בחולדות זכר או נקבה בוגרות (9 שבועות עד 18 שבועות) לפרוטוקול הבידוד. משקל החולדות תלוי במין ובגיל (זכרים בין 300 ל-500 גרם ונקבות בין 200 ל-350 גרם משמשים בדרך כלל).
הומוגנייזר DounceKontes Glass Co. 885450-0022דואל 22
מיקרוצנטריפוגהתרמו מדעיSorvall Legend Micro 17 R
צינורות אולטרה-צנטריפוגה אולטרה-ברוריםבקמן קולטר344057שקוף, דק דופן 
Sorvall UltracentrifugeThermo ScientificSorvall WX UltraSeries
AH-650 רוטור ודליים   Thermo Scientific
Opti-prepAxis-Shield1114542יודיקסאנול, שיפוע צפיפות בינוני
סרום בקר ללא חומצות שומן אלבומיןסיגמאA8806חייב להיות נטול חומצות שומן למיטוכונדריה
נתרן סוקסינט דו-בסיסי הקסהידרט   SigmaS9637
ארנב נוגדן נגד Mitofusin2SigmaM6319
ארנב IgGJackson Immuno Research 011-000-003
Anti-Rabbit IgG PEeBioscience12-4739-81
צינור מיקרו טיטרBio-Rad223-9391לרכישת דגימה על ידי ציטומטריית זרימה 
MitoTrackerGreen (MTG)InvitrogenM7514100 ננומטר: Ex 490 ננומטר/EM 516 ננומטר
TMRMInvitrogenT668100 ננומטר: Ex 548 ננומטר/EM 574 ננומטר
CCCPSigmaC2759
MitoSOX אדוםInvitrogenM360085 ומיקרו; M: Ex 540 ננומטר/EM 600 ננומטר
אנטימיצין ASigmaA8874
LSR II זרימה ציטומטרBD
BD FACSDiva תוכנהBD
FlowJoTreeStar Inc. תוכנה המשמשת לניתוח
ערכת בדיקת חלבון BCA   Pierce/Thermo Scientific23225Bradford אינה מומלצת מכיוון שהיא אינה תואמת לריכוזים גבוהים של SDS
בדיקת

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Itoh, K., Nakamura, K., Iijima, M., Sesaki, H. Mitochondrial dynamics in neurodegeneration. Trends Cell Biol. 23, 64-71 (2013).
  2. Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy. J Cell Biol. 183, 795-803 (2008).
  3. Zorov, D. B., Kobrinsky, E., Juhaszova, M., Sollott, S. J. Examining intracellular organelle function using fluorescent probes: from animalcules to quantum dots. Circ Res. 95, 239-252 (2004).
  4. Vande Velde, C., Miller, T., Cashman, N. R., Cleveland, D. W. Selective association of misfolded ALS-linked mutant SOD1 with the cytoplasmic face of mitochondria. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 4022-4027 (2008).
  5. Loew, L. M., Tuft, R. A., Carrington, W., Fay, F. S. Imaging in five dimensions: time-dependent membrane potentials in individual mitochondria. Biophys J. 65, 2396-2407 (1993).
  6. Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide. Biotechniques. 50, 98-115 (2011).
  7. Xu, X., Arriaga, E. A. Qualitative determination of superoxide release at both sides of the mitochondrial inner membrane by capillary electrophoretic analysis of the oxidation products of triphenylphosphonium hydroethidine. Free Radic Biol Med. 46, 905-913 (2009).
  8. Otera, H., Ishihara, N., Mihara, K. New insights into the function and regulation of mitochondrial fission. Biochim Biophys Acta. 1833, 1256-1268 (2013).
  9. de Brito, O. M., Scorrano, L. Mitofusin 2 tethers endoplasmic reticulum to mitochondria. Nature. 456, 605-610 (2008).
  10. Wikstrom, J. D., Twig, G., Shirihai, O. S. What can mitochondrial heterogeneity tell us about mitochondrial dynamics and autophagy. Int J Biochem Cell Biol. 41, 1914-1927 (2009).
  11. Pickles, S., Destroismaisons, L., Peyrard, S. L., Cadot, S., Rouleau, G. A., Brown, R. H. Jr, Julien, J. P., Arbour, N., Vande Velde, C. Mitochondrial damage revealed by immunoselection for ALS-linked misfolded SOD1. Hum Mol Genet. 22, 3947-3959 (2013).
  12. Frank, S., Gaume, B., Bergmann-Leitner, E. S., Leitner, W. W., Robert, E. G., Catez, F., Smith, C. L., Youle, R. J. The role of dynamin-related protein 1, a mediator of mitochondrial fission, in apoptosis. Dev Cell. 1, 515-525 (2001).
  13. West, A. P., Brodsky, I. E., Rahner, C., Woo, D. K., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Walsh, M. C., Choi, Y., Shadel, G. S., Ghosh, S. TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS. Nature. 472, 476-480 (2011).
  14. Abad, M. F., Di Benedetto, G., Magalhães, P. J., Filippin, L., Pozzan, T. Mitochondrial pH monitored by a new engineered green fluorescent protein mutant. J Biol Chem. 279, 11521-11529 (2004).
  15. Murphy, A. N., Bredesen, D., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 9893-9898 (1996).
  16. Tantama, M., Martinez-François, J. R., Mongeon, R., Yellen, G. Imaging energy status in live cells with a fluorescent biosensor of the intracellular ATP-to-ADP ratio. Nat Commun. 4, 2550(2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Mitochondrial IsolationFlow CytometryImmunodetectionOuter Membrane ProteinsMitochondria PurificationAntibody LabelingFluorescent StainingMitochondrial FunctionSpinal Cord TissueMyelin Removal

מאמרים קשורים