דור של הטרנסגניים הידרה על ידי Microinjection העובר

סיכום

הידרה טרנסגנית יציבה מיוצרת על ידי הזרקת מיקרו של DNA פלסמיד לעוברים ואחריה אינטגרציה גנומית אקראית והתפשטות א-מינית כדי ליצור קו אחיד. הידרה טרנסגנית משמשת למעקב אחר תנועות תאים, ביטוי יתר של גנים, חקר תפקוד המקדם או הפלת ביטוי גנים באמצעות RNAi.

תקציר

כחברה בפילום Cnidaria, הקבוצה האחות לכל הדו-תאיים, הידרה יכולה לשפוך אור על תהליכים ביולוגיים בסיסיים המשותפים לבעלי חיים רב-תאיים. הידרה משמשת כמודל לחקר התחדשות, היווצרות דפוסים ותאי גזע. עם זאת, מאמצי המחקר נפגעו בשל היעדר שיטה אמינה להפרעות גנים לחקר תפקוד מולקולרי. התפתחות השיטות הטרנסגניות החיתה את חקר הביולוגיה של הידרה ¹. הידרה טרנסגנית מאפשרת מעקב אחר תאים חיים, מיון כדי להניב אוכלוסיות תאים טהורות לניתוח ביוכימי, מניפולציה של תפקוד הגנים על ידי נוקדאון וביטוי יתר, וניתוח תפקוד המקדם. DNA פלסמיד המוזרק לעוברים בשלב מוקדם משתלב באופן אקראי בגנום בשלב מוקדם של ההתפתחות. התוצאה היא אבקועים המבטאים טרנסגנים בכתמי רקמה באחת או יותר משלוש השושלות (אפיתל אקטודרמלי, אפיתל אנדודרמלי או אינטרסטיציאלי). שיעור ההצלחה של השגת אבקוע עם רקמה טרנסגנית הוא בין 10% ל-20%. ריבוי א-מיני של האבקוע הטרנסגני משמש להקמת קו טרנסגני אחיד בשושלת מסוימת. יצירת הידרה טרנסגנית היא פשוטה וחזקה באופן מפתיע, וכאן אנו מתארים פרוטוקול שניתן ליישם בקלות בעלות נמוכה.

מבוא

הידרה נעשתה שימוש כדי ללמוד התחדשות, היווצרות דפוס, ותאי גזע עבור כ 250 שנים ² יש הידרה תכנית גוף פשוטה המורכבת של שושלות שלושה תאים:. אפיתל ectodermal, אפיתל endodermal, וביניים. הגוף צינורי נוצר על ידי ectodermal ושושלות אפיתל endodermal, כל אחד מהם הוא שכבת תא בודדת. כל תאי האפיתל בעמודת הגוף הם mitotic. כאשר תאי האפיתל הם עקורים לגפיים ^3, הראש (פה וזרועות) בסוף הפה או ברגל (הדיסק הבסיסי) בסוף aboral, הם יעצרו בשלב G2 של מחזור התא ולשנות תא גורל ^4. התאים של שושלת ביניים מתגוררים בתוך החללים שבין תאי האפיתל. שושלת זו נתמכת על ידי תאי גזע multipotent הנמצאים בשכבת האפיתל ectodermal של העמודה גוף ^5. תאי גזע ביניים מעוררים שלושה cel סומטייםסוגי l (עצבים, תאי בלוטה, וnematocytes) ותאי הנבט ^6,7.

כחבר המיון הצמחי Cnidaria, קבוצת האחות לכל bilaterians, הידרה יכולה לשפוך אור על תהליכים ביולוגיים בסיסיים המשותפים בין בעלי חיים רב תאיים. עד לאחרונה, מאמצים אלה הקשו על ידי החוסר של שיטות אמינות להפרעות של תפקוד גן. עם זאת, עם התפתחותה של המתודולוגיה מהונדס ^1, אנו יכולים לנצל את מלוא יתרונות של הידרה כדי להשיג הבנה טובה יותר של המנגנונים הבסיסיים המשותפים לבעלי חיים רב תאיים, כגון תפקוד תאי גזע, התחדשות, ודפוסים עכשיו. קווים המהונדס הידרה נקבעים על ידי הזרקה של DNA פלסמיד לעוברי, מה שגורם אינטגרציה אקראית וביטוי chimeric בתדירות משמעותית של גוזלים. קו עם ביטוי אחיד בשושלת מסוימת יכול להיות שהוקם על ידי התפשטות מינית. היכולת להפיץ transg clonallyenic הידרה קווים היא יתרון על רוב המודלים של בעלי חיים, אשר יכול להיות מופץ רק על ידי רבייה מינית. בנוסף, ניתן לעקוב אחר תאים מהונדסים בקלות in vivo בשל השקיפות של בעלי החיים והעדר חלבוני ניאון אנדוגני ^8.

בשבע השנים שחלפה מאז קווי הידרה מהונדסים הראשונים נעשו ^1, קווים כאלה היו בשימוש עבור מגוון רחב של יישומים. ביטוי של חלבוני ניאון בתאים מסוגים שונים, הפך אותו ניתן לעקוב אחר תנועת תא, לצפות בשינויים בצורת תא, ולעקוב אחר גורל תא הן בתנאים מסוג בר ולאחר ההפרעות כימיות ^1,5,9-12. בנוסף, ביטוי של חלבוני ניאון שונים בשושלות השונות מאפשר לבידוד FACS של אוכלוסיות תאים ספציפיות. טכניקה זו הייתה בשימוש כבר הרצף של mRNAs הספציפי בתאי הגזע וRNA הקטן השושלת הספציפית ^13,14. בעוד האמרגן שלאחד משני הגנים אקטין הידרה כבר בשימוש נרחב ביותר, יזמים מסוימים כמה תאים מסוג זוהו ולהשתמש בכונן ביטוי של GFP בהידרה המהונדס ^9,11,15,16. בעתיד, יזמים ספציפיים תא מהסוג יאפשר לתצפית והאיסוף של כל סוג תא מסוים. בנוסף, גישה מהונדס הייתה בהצלחה המשמשת להגדרת האלמנטים רגולטוריים cis-בפועל של אמרגן Wnt3 ^17.

פיתוח שיטות מהונדסים בהידרה מספק גישה חזקה לבדיקת תפקודם של גנים על ידי ביטוי מחוץ לרחם, ביטוי יתר, ומציאה. בעלי חיים מהונדסים נעשו שמבטאים חלבוני fluorescently- מתוייגים על מנת לבחון שתי פונקציה ולוקליזציה סלולרית ^18-20. בנוסף, הביטוי של סיכות ראש RNA ב3'UTR של transgene GFP מוביל למציאה של גני המטרה ^21,22. בגישות אלה נדרש GFP לזהותולעקוב אחר הרקמות מהונדסים במהלך היצירה של הקו המהונדס. עם זאת, סביר להניח כי במקרים מסוימים מולקולת GFP הייתה מפריעה לתפקוד של החלבון מתויג. מחקר שנערך לאחרונה מוכיח כי ניתן לארגן גני הידרה בתצורת אופרון, כלומר, תעתיקי polycistronic נעשים, אשר לאחר מכן הם מופרדים על ידי בנוסף, מנהיג שחבור טרנס ותורגמו בנפרד ^23. על ידי הצבת גן קידוד חלבון או סיכת ראש RNA במצב במעלה הזרם של אופרון וגן חלבון פלואורסצנטי בעמדה במורד הזרם, אחד יכול לעקוב אחר רקמות מהונדסים מבלי לתייג את הגן המקודד את חלבון סיכת הראש או RNA. שיטה זו נעשתה שימוש כדי להביע את סיכת ראש RNA בתצורת אופרון עם DsRed2 על מנת להשיג גן מציאה ^14.

פרוטוקול

.1 הכנת פלסמיד דנ"א, מחטים, וכלי הזרקה

1. הכן את פלסמיד דנ"א באמצעות ערכת High Speed ​​מקסי או מידי ולהתרכז DNA ל2.5 מ"ג / מ"ל ​​באמצעות משקעים אתנול. גלולה DNA צריכה להיות מומסת במים ללא יוני nuclease חינם. אחסן את הדנ"א ב10-20 aliquots μl ב -20 מעלות צלזיוס. (ראה טבלת משלים 1 לרשימה של וקטורים זמינים)
2. תן מנה הזרקה באמצעות agarose לבנות שוקת להחזקת עוברים בצלחת פטרי 100 x 15 מ"מ.
   1. מקום שקופית מיקרוסקופ 75 x 50 זכוכית לתוך 100 x 15 מ"מ צלחת פטרי בזווית. יוצקים כ 50 מ"ל של 2% מומס agarose במדיום הידרה ²⁴ לתוך צלחת פטרי. , לחלופין לשפוך agarose לתוך הצלחת הראשונה ולצוף "עובש Microinjection דגים" על גבי.
   2. לאחר agarose יש הקרושה, להסיר את שקופית הזכוכית או העובש. אם שקופיות זכוכית שימשה, לחתוך agarose העודף עם bla גילוחדה ליצירת קיר. יוצקים בינוני הידרה לתוך הצלחת ולהשתמש בו באופן מיידי או לשמור אותו על 4 מעלות צלזיוס עד צורך. ניתן לעשות שימוש חוזר מנות הזרקה אם מאוחסנים על 4 מעלות צלזיוס בין שימושים: הערה.
3. משוך מחטים מנימי זכוכית בורוסיליקט עם נימה על חולץ micropipette באמצעות התנאים הבאים: לחמם 525, למשוך 75, מהירות 100, זמן 50. חנות המחטים על ידי לחיצה על אותם לתוך רצועה צרה של חימר בצלחת פטרי באופן שהם במקביל מוחזק לתחתית הצלחת.
4. כדי להכין את פתרון ההזרקה, לשלב 3 μl של 2.5 מ"ג / פתרון פלסמיד דנ"א מ"ל עם 2 μl של 10% פנול אדומים. מערבולת הפתרון לזמן קצר ולאחר מכן לסובב אותו עבור 10 דקות במהירות המרבית בmicrocentrifuge כדי להסיר כל חלקיקים שעלולות לסתום את המחט.
5. תחת מיקרוסקופ לנתח, קליפ המחט כמה מילימטרים מהקצה עם מלקחיים כדי ליצור פתח קטן. הערה: יש גמישות מסוימת בגודל המתאים של פתוחing כי הלחץ יכול להיות מותאם בשלב 3.3 ליתאים למגוון הזה.
6. מניחים את צלחת פטרי, כך שהוא מחזיק את המחט במצב אנכי עם את הקצה. טען את המחט עם כ 0.5 μl של פתרון הזרקה ידי pipetting את הנוזל לתוך הקצה האחורי של המחט. לאפשר פעולת נימים למשוך את הפתרון לקצה המחט.

2 הכנת עוברים להזרקה

1. על בסיס יומי לסרוק תרבות זן הידרה AEP לפוליפים בייצור ביצים. לאסוף פוליפים אלה ולהגדיר אותם בצד בצלחת תרבות נפרדת. שים לב פוליפים אלה כל כמה שעות במהלך היום כדי לעקוב אחר ההתקדמות של היווצרות ביצה. כאשר ביצים לפרוץ את האאקטודרם ולשבת על טבעת של תאי ectodermal חזרו בו הם מוכנים להזרקה ^25. הנח פוליפים אלה בצלחת עם כמה הידרה שיש לי אשכים במשך שעה לפחות 1 לפני ההזרקה כדי לאפשר הפריה. הידרה </ Em> זכרים ישחררו זרע ללא כל מניפולציה מיוחדת.
2. אם נשים נמצאות במושבה AEP עם ביצים בנויות באופן מלא, שהם כ 400 מיקרומטר בקוטר ^25, או 1 לעוברי שלב 8 תאים, גם לאסוף אלה להזרקה. מייד להזריק עוברים שנכתבו על דבקות. הערה: לא ניתן להבחין בהבדל בין ביצים בנויות באופן מלא וzygotes חד תאי, ובכך אלה צריכים להיות מודגרות עם זכרים לפני ההזרקה.
3. לפני ההזרקה, להסיר את רוב רקמת ההורים מעל ומתחת לעובר באמצעות אזמל עם להב # 15. השאר רק את העובר עם חתיכה קטנה של טור גוף המצורף, כדי לשמש כדי לתפעל את העובר עם מלקחיים במידת צורך. הערה: הרקמה שגזורה מאת העובר יהיה להתחדש וצריך להישמר כדי להבטיח שנשים יישארו במושבה הידרה.
4. בעזרת פיפטה פסטר, להעביר עוברים למנת ההזרקה, סידר אותם במקביל לקיר שלשוקת agarose.

.3 Microinjection של פלסמיד דנ"א

1. הר microinjector על דוכן מגנטי שיושב על צלחת ברזל. הר בעל ההזרקה, המהווה את החלק של microinjector שמחזיק את המחט, על micromanipulator ג'ויסטיק. הר מניפולטור ג'ויסטיק לצלחת הברזל, עם דוכן מגנטי. מניחים כל המכלול הזה בצד ימין של מיקרוסקופ לנתח ומקם את בעל ההזרקה כך שזה נראה לעין בתחום התצפית.
2. מניחים את צלחת ההזרקה עם עוברים מתחת למיקרוסקופ לנתח, אוריינטציה כך שהקיר האנכי של שוקת agarose הוא בצד השמאל. הכנס את המחט לתוך מחזיק ההזרקה ולהוריד את קצה המחט לתוך מדיום הידרה בצלחת.
3. לאט לאט לסובב את הידית של המזרק בכיוון השעון עד ששמן מינרלים ממלא את החלק העליון של המחט וזרם קבוע של פתרון הזרקה הוא ציין יציאת המחט לתוך hydrבינוני. אם הזרם חזק מדי, צריך להוריד את הלחץ על ידי סיבוב הידית נגד כיוון השעון. לתרגל את הצעד הזה כדי להשיג לחץ מתאים, אשר תלוי בגודל של פתיחת המחט (כלומר, איך המחט הייתה מוצמדת בשלב 1.5) באופן שיגרתי. הערה: אם הזרם חזק מדי, העובר לא ישרוד את הזריקה.
4. בעת הצפייה באמצעות מיקרוסקופ לנתח, להעביר את צלחת ההזרקה כך שהעובר הראשון הוא במרכז השדה. להזיז את המחט כך שהוא נוגע בעובר ש. השתמש micromanipulator כדי לחדור את העובר עם המחט. הערה: הקיר האנכי של שוקת agarose ישמור את העובר מהדחיפה הצידה על ידי המחט.
5. אפשר פתרון ההזרקה לזרום אל תוך שניות 1 או 2 עובר ולאחר מכן הסר את המחט במהירות. אם העובר יש תא אחד או יותר, להזריק כל תא בנפרד. שימוש במלקחיים לארגון מחדש של העובר כדי ליישר את התא הבא עם קצה המחט.
6. לאחר אמברי הראשוןo מוזרקת, להזיז את הצלחת כדי שהעובר הבא הוא בעמדת הזריקה ולחזור על התהליך; תמשיך עד שכל העוברים כבר הזריק.

.4 Culturing ובקיעה של עוברים

1. להעביר את כל העוברים הוחדרו לתוך צלחת עם כמה הידרה שיש לי אשכים (זה הוא להבטיח כי כל העוברים הם מופרה). דגירה עובר בחממת C ° 18 בעוד הם ממשיכים עובר.
2. ברגע שהוא הגיע לשלב שהציפורן, לעבור כל עובר מוזרק ולבודד של צלחת 24 גם מלאה בינוני הידרה.
3. דגירה עובר המוזרקת ל2 שבועות בחושך ב18 ° C.
4. לאחר תקופת הדגירה 2 בשבוע, לבדוק כל עובר מוזרק מתחת למיקרוסקופ לנתח. שים לב כל המקרים שבהם עובר ציפורן בשלב ניתק מהפיסה הקטנה של רקמת הורים ורקמת ההורים כבר התאחתה. הסר פוליפ מחדש זה מייד, כך שהוא לא מילstaken לגוזל חדש.
5. הזז את הצלחת של עוברים מוזרקים תחת אור אקווריום ב RT. בדוק את הצלחות בכל יום ולאסוף גוזלים. גוזלים חדשים יהיו לבנים כי הצבע הוורוד האופייני לפוליף הידרה מגיע מהארטמיה שהם אוכלים.
6. שים לב לגוזלים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לזהות ביטוי transgene.

תוצאות

הקמת קווי הידרה מהונדסים

להאכיל את הגוזלים מהונדסים כל 2-3 ימים עם Nauplii הארטמיה. גוזלים לפעמים לא אוכלים ליום או ימים לאחר הבקיעה. כמה גוזלים חדשים לעולם לא לאכול, ולכן לא ישרדו. אם הגוזל הוא מהונדס באו ectodermal (איור 1 א) או רקמת האפיתל endodermal, לאפשר את בעל החיים לניצן ולאסוף את הניצנים שיש לי הרקמה המהונדס ביותר (איור 1 ב, ג). תמשיך לעשות את זה עם הניצני...

דיון

הידרה מתרבה באופן שגרתי לא מינית, אבל דורשת גירויים סביבתיים כדי להתחיל תאי מין הפקה. גירויים אלה אינם מוגדרים היטב עבור רוב מיני הידרה ועשויים להיות שונה מזן לזן. המשוכה משמעותית לייצור של הידרה המהונדס היא קבלת עוברים על בסיס קבוע, כי זה יכול להיות קשה בסביבת מעבדה כדי לגרום להידרה להפוך מיני. זן AEP ^25, לעומת זאת, מייצר תאי מין בקלות במעבדה וזה המתח היחיד שהיה בשימוש עד כה לביצוע קווים מהונדסים. השיטה הנפוצה ביותר לגרימת ייצור תא מ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
AEP Hydra Strain			דוא"ל: סלינה ג'וליאנו ב-celina.juliano@yale.edu או Hiroshi Shimizu bubuchin2006@yahoo.co.jp
ערכת מקסי במהירות גבוהה	Qiagen	12662
100 x 15 מ"מ צלחות פטרי	BD פלקון	351029
75 x 50 מ"מ זכוכית מיקרוסקופ שקופית	סיגמא	CLS294775X50
מיקרוהזרקת דגים עובש	IBI מדעי	FM-600
בורוסיליקט זכוכית עם נימה	סאטר	BF100-50-10	OD: 1.0 מ"מ, תעודת זהות: 0.50 מ"מ, אורך 10 ס"מ
מכשיר סאטר מיקרופיפטה בוער/חום		P-97
פנול אדום	סיגמא	P3532
מלקחיים תכשיטנים, דורמונט #5	סיגמא	F6521
להב אזמל #15	פישר	50-822-421
שמן מינרלי	Sigma	M8410-500ML
מיקרו-מזרק	Narishige	IM-9B
מעמד מגנטי	Narishige	GJ-1
צלחת ברזל	Narishige	IP
ג'ויסטיק מיקרומניפולטור	Narishige	MN-151

מכשיר