ביטוי חלבון רקומביננטי לביולוגיה מבנית בתאי ההשעיה HEK 293F: רומן וגישה נגישה

סיכום

ביטוי חלבונים רקומביננטיים על ידי מערכות יונקים הופך לשיטה אטרקטיבית לייצור קומפלקסים של חלבונים לביולוגיה מבנית. כאן אנו מציגים מערכת ביטוי פשוטה אך יעילה ביותר המשתמשת בתאי יונקים שגדלו בתרחיף לטיהור קומפלקסים של חלבונים למחקרים מבניים.

תקציר

ביטוי וטיהור של כמויות גדולות של קומפלקסים של חלבונים רקומביננטיים הוא דרישה חיונית למחקרי ביולוגיה מבנית. במשך למעלה משני עשורים, מערכות ביטוי פרוקריוטיות כגון E. coli שלטו בספרות המדעית על פני קווי תאים אוקריוטיים יקרים ופחות יעילים. למרות היתרון הברור מבחינת היבול והעלויות של ביטוי חלבונים רקומביננטיים בחיידקים, היעדר גורמים משלימים ספציפיים, צ'פרונים ושינויים לאחר התרגום עלול לגרום לאובדן תפקוד, קיפול שגוי ויכול לשבש אינטראקציות חלבון-חלבון של קומפלקסים אוקריוטיים מרובי יחידות מסוימות, קולטנים על פני השטח וחלבונים מופרשים. השימוש במערכות ביטוי תאי יונקים יכול לטפל בחסרונות אלה מכיוון שהן מספקות סביבת ביטוי אוקריוטית. עם זאת, תפוקות חלבון נמוכות ועלויות גבוהות של שיטות כאלה הגבילו עד לאחרונה את השימוש בהן לביולוגיה מבנית. כאן אנו מתארים שיטה פשוטה ונגישה לביטוי וטיהור כמויות מיליגרם של חלבון על ידי ביצוע טרנספקציות חולפות של תאי HEK (כליה עוברית אנושית) 293F שגדלו בתרחיף.

מבוא

ההתקדמות המהירה של ביולוגיה מולקולרית של תא והצורך התמידי בתרופות השתפרו ברפואה יצרו צורך בביולוגים מבניים להסתכל על מבנים חלבוניים יותר ויותר מורכבים. אלה לעתים קרובות יכולים לדרוש שינויים מסוימים שלאחר translational, מלווים מולקולריים ושיתוף גורמים לתמוך מתקפלים המשוכלל שלהם ופעילות האנזימטית. בעוד הרוב המכריע של מבנים קיימים בחלבון נתוני הבנק התקבלו תוך שימוש במערכות ביטוי בקטריאלי, פרוקריוטים אינכם מצליחין לבצע מספר רב של שינויים אלה וחוסר שיתוף גורמים אוקריוטים חיוניים רבים. זה יכול להיות נושא למחקר של מתחמים רב למקטע גדולים שמופעלים על ידי מולקולות איתות קטנות, כמו גם לגרעין, פני תא וחלבונים מופרשים הדורשים מנגנונים קיפול משוכללים. מספר א ' זני coli כבר מהונדסים כדי להתגבר על חלק מהמגבלות אלה ^1. בשנים האחרונות, עם זאת, השימוש במ 'מערכות ביטוי ammalian כבר גדלו, כי הם אמינים לייצר חלבונים האיקריוטים כי הם בעייתיים מבחינה אחרת להביע במערכות אחרות ^2. כיום ניתן להשיג שורות תאי יונקים ביטוי יציבים וחולפות באמצעות מגוון רחב של טכניקות שנעות בין התמרה ויראלית לtransfection בתיווך כימי, גן העברה פיזית כגון electroporation והזרקה ישירה ^3. בעוד שכל השיטות האלה יש קבוצה של יתרונות וחסרונות משלהם, רק מעטים מהם מתאימים ללימודים מבניים להיות גם רב יקר ו / או גם הפעם.

כאן אנו מתארים שיטה פשוטה מאוד, מהירה, זולה עדיין יעילה ביותר לביטוי קומפלקסי חלבונים לביולוגיה מבנית בתאי יונקים השעיה גדלה. הגישה משתמשת בשיתוף transfection החולף של קו הכליה העוברית אנושי (HEK) תא (לדוגמא, תאי Freestyle HEK 293F). תאים אלה כבר נגזרו מce HEK 293שורת ll, מותאמת לגדול בתרבויות השעיה, הגיעה צפיפות גבוהה באמצעות סרום ללא מדיה (כגון FreeStyle 293 ביטוי בינוני). תאים אז זמני transfected משתמשים בגרסת קנים של polyethylenimine (PEI), מגיב פולימרים זולים שכבר דווח לתפקד לטווח גדול של תאי יונקים ⁴ על ידי יצירת דנ"א / מתחמי PEI שלהיכנס לתא המארח על ידי אנדוציטוזה ^5. שיטה זו מתאימה לשניהם בקנה מידה קטן (30 מ"ל) ובקנה מידה גדול (עד 300 מ"ל) ניסויים ויכולה לייצר רמות גבוהות של קומפלקסי חלבונים מטוהרים. זה שימושי במיוחד ללימוד חלבונים הדורשים מנגנונים מורכבים מתקפלים, שיתוף גורמים או לאחר translational שינויים מסוימים שלא יכול להתבצע על ידי חיידקים, שמרים ותאי חרקים.

בפרוטוקול זה אנו מציגים את הביטוי והטיהור של הפיגום המרכזי שלושת חלבון ממתחם דיכוי תעתיק Sin3A. זה מורכב מהיסטוןDeacetylase 1 (HDAC1), מדכאי לקויים השתקת 3 (SDS3) והמתג עצמאי 3 (Sin3A). המורכב המטוהר משמש לניסויי התגבשות תפוקה גבוהה.

פרוטוקול

הערה: הפרוטוקול מתאים לכל קנה מידה של ביטוי, ולכן היקפים וכמויות של חומרים כימיים צריכים להיות מדורגים באופן יחסי. וקטור ביטוי יונקים מתאים יש להשתמש בפרוטוקול זה. כאן השתמשנו בוקטור ביטוי pcDNA 3.1 שונה כי בנוחות מאפשר הכללה או אי הכללת תג זיקה בהתאם לבחירה של אנזימי הגבלה בשימוש בשיבוט (איור 1). הפרוטוקול הבא מתאר transfection בקנה מידה גדול.

.1 תרבות בקנה מידה גדולה / Transfection בבקבוקי רולר 1 ליטר

לגדול ולשמור על תאים מותאמים השעיה HEK293F על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. בדרך כלל תרבויות המתנע של בין 30 100 מ"ל גדלים ב250 מ"ל צלוחיות תרבית תאי חרוטי.

1. תאי זרע ב0.5 x 10 ⁶ תאים / מ"ל בנפח סופי של 300 מ"ל בבקבוק אחד הרים L 1.
   הערה: בקבוקי רולר להכיל מינימום של 150 מ"ל עד למקסימום של300 מ"ל של תרבות השעיה. לtransfections קנה מידה הגדול יותר להשתמש בבקבוקים רבים.
2. דגירה של 24 שעות באינקובטור שייקר מסלולית ב 37 מעלות צלזיוס, 120 סל"ד, ו 5% CO ₂ עד תאים להגיע לצפיפות של 1.0 x 10 ⁶ תאים / מ"ל (תאים צריכים לחלק בערך כל שעה 24).
3. פיפטה כוללת של 300 מיקרוגרם של DNA-מעוקר מסנן (ראה שיטה נוספת) ל30 מ"ל של PBS ומערבולת במרץ במשך 3 שניות.
   הערה: השתמש בסכום כולל של 1 מיקרוגרם של DNA למיליון תאי transfected. אם שניים או יותר פלסמידים יש שיתוף transfected-להפחית את הכמות של כל אחד, כך שהיחס של DNA לתאים נשאר קבוע.
4. הוספת 1.2 מ"ל של 0.5 מ"ג / מיליליטר מסנן מעוקר PEI לפתרון PBS / DNA והמערבולת במרץ במשך 3 שניות.
5. דגירה את התערובת על RT עבור 20 דקות.
6. הוסף את DNA / PEI לערבב לתאים - שאמור להיות בצפיפות של 1 x 10 ⁶ מ"ל תאים / (שלב 1.3).
7. בעקבות שיתוף transfection, דגירה התאיםבחממת ייקר מסלולית ל48 שעות נוספות על 37 מעלות צלזיוס, 120 סל"ד, ו 5% CO _2.
8. חלבונים תאיים קציר על ידי צנטריפוגה תאים ב3,000 XG למשך 5 דקות ולאחסן את גלולה ב -80 מעלות צלזיוס.
   הערה: לחלופין, להשתמש סטנדרטי (לא CO ₂₎ רועד חממה, אם האטמוספרה מעל התרבות מוחלפת עם 5% CO ₂ ואת מכסה הבקבוק אטום. האווירה צריכה להיות מוחלפת בכל קטע (בדרך כלל כל 2 ימים).

.2 טיהור חלבון מורכב מתמצית תא כל

פרוטוקול זה הוא מותאם לטיהור מתחמים גרעיניים באמצעות חלבונים מתויג דגל.

1. להפשיר תא גלולה ל~ 40 מ"ל של חיץ תמוגה טרום צונן (100 אצטט מ"מ אשלגן, 50 מ"מ טריס pH 7.5, גליצרול 5%, 0.3% טריטון X-100, מעכבי פרוטאז) לכל ליטר של התרבות.
2. Re-להשעות את גלולה ידי pipetting מעלה ומטה מספר פעמים (כדי למנוע הקצפה, לא מערבולת).
3. ביסודיות מחדש להשעות תאים באמצעות homogenizer זכוכית. Sonicate ל3 מחזורים (15 שניות על, 15 שניות כבויות). צנטריפוגה ב30,000 XG ל25 דקות ב 4 מעלות ולשמור supernatant.
4. לאזן 1.25 מ"ל של אנטי הדגל ארוז שרף agarose לליטר של תרבות על ידי שטיפת שלוש פעמים עם חיץ איזון שרף (אצטט אשלגן 100 מ"מ, 50 מ"מ טריס pH 7.5).
5. דגירה כל תמצית התא מצעד 2.3 עם שרף הזיקה ב50 מ"ל צינורות צנטריפוגה אחת או יותר ובעדינות לסובב את המדגם עבור 30-120 דקות ב 4 ° C.
6. צנטריפוגה ב 3,000 XG 1 דקות ב 4 ° C, supernatant קלפים שנזרקו.
7. שטוף את השרף עם 45 מ"ל של חיץ מראש צונן 1 (100 אצטט מ"מ אשלגן, 50 מ"מ טריס pH 7.5, גליצרול 5%, 0.3% טריטון X-100). צנטריפוגה ב3,000 XG 1 דקות וזורקי supernatant.
8. חזור על שלב 2.7 באמצעות חיץ מלח גבוה (300 אצטט מ"מ אשלגן, 50 מ"מ טריס pH 7.5, גליצרול 5%), ואחריו חיץ נמוך מלח (אצטט אשלגן 50 מ"מ, 50 מ"מ טריס 7 pH.5, 5% גליצרול) וTEV מחשוף חוצץ (אצטט אשלגן 50 מ"מ, 50 מ"מ טריס pH 7.5, 0.5 מ"מ TCEP).
   הערה: ודא כל שטיפה הוא כלומר קצר, מספיק באופן מלא מחדש להשעות את השרף ועוד.
9. לאסוף דגימת 10 μl של שרף ולדלל לתוך הנפח של 1 חיץ 2x טעינת חלבון לניתוח (שליטת חלבון קשורה). אין להשתמש בסוכני הפחתה על מנת להימנע משחרור הנוגדן מהשרף.
10. להשעות Re השרף לתוך 8-10 מ"ל של חיץ מחשוף TEV טרום צונן והעברה לצינור צנטריפוגות 15 מ"ל.
11. להוסיף ~ 40 מיקרוגרם של פרוטאז TEV (מהמלאי ב1 מ"ג / מ"ל) לכל ליטר של תרבות המקורית ומערבבים היטב על ידי pipetting מעלה ומטה מספר פעמים.
12. להחליף אווירת צינור עם גז N ₂ 100% על מנת למנוע חמצון חלבון.
13. בעדינות לסובב O / N ב4 מעלות.
14. צנטריפוגה ב3,000 XG עבור 10 דקות. מעבירים את supernatant לתוך מסנן צנטריפוגלי במיוחד עם ניתוק משקל מולקולרי מתאים ולהתרכזעד 500 μl.
15. לאסוף דגימת 10 μl של החלבון המרוכז ולדלל לתוך הנפח של 1 חיץ טעינת חלבון 2x לניתוח. (TEV eluate שליטה).
16. לאסוף דגימת 10 μl של השרף ולדלל לתוך הנפח של 1 חיץ טעינת חלבון 2x לניתוח. אל תשתמש צמצום סוכנים על מנת להימנע משחרור כמויות הגדולות של נוגדנים מהשרף. (שליטת שרף Post-TEV).
17. לאזן את העמודה כרומטוגרפיה הדרת גודל עם חיץ סינון ג'ל (אצטט אשלגן 50 מ"מ, 50 מ"מ טריס pH 7.5, 0.5 מ"מ TCEP).
18. סנן את החלבון דרך מסנן 0.22 מיקרומטר
19. טען את המדגם לתוך הטור ולאסוף את השברים.
20. דגימות לרוץ מצעדים 2.9, 2.15 ו2.16 ושברי סינון ג'ל מצעד 2.19 על SDS-PAGE וכתם Coomassie לניתוח.
    הערה: מומלץ לרוץ SDS-PAGE של דגימות מצעדים 2.9, 2.15 ו2.16 לפני ג'ל סינון כדי לאשר ביטוי של חלבון המטרה.

תוצאות

כאן אנו מראים L 2 (8 x 250 תרבויות מ"ל) שיתוף transfection החולף וטיהור של HDAC1, SDS3, מורכב משולש Sin3A. HDAC1 וSDS3 אינטראקציה עם Sin3A דרך תחום HDAC-האינטראקציה (HID) של Sin3A. תשואות טיהור טיפוסיות עד 1 מ"ג של מתחם לליטר של התרבות.

איור 1 סכמטי של וקטור pcDNA 3.1 ביטוי שונה. פלסמיד היה מתעכל עם EcoRV וEcoRI לכלול זיקת תג ואתר מחשוף TEV בתחנה הסופית אמינו של Sin3A. לשבט גרסאות לא מתויגות של HDAC1 וSDS3, הווקטור היה מתעכל עם KpnI וEcoRI.

איור 2 SDS-PAG E מראה את הצעד הראשון של הטיהור. הנתיב "החלבון קשור" מציג את המורכבות קשורות לשרף הזיקה. בעקבות עיכול TEV, הווה התג על Sin3A-HID הוא ביקע את ומורכב הוא eluted מהשרף כפי שמוצג בנתיבים השניה והשלישי של ג'ל.

איור 3 chromatogram של כרומטוגרפיה מטוהרת חלבונים מורכבים באמצעות הדרת גודל. שים לב שמורכב הטהור eluted בחלל הנפח כי זה יוצר דימר בפתרון.

איור 4 SDS-PAGE מראה את השברים של סינון ג'ל שמוצג באיור 3.

r.within-page = "תמיד">
תאי איור 5 Trypan המוכתם כחולים HEK 293F ב2.3x10 ⁶ תאים / מ"ל מוכן להיות transfected. תאים צריכים להיות רק בהווה כתאים בודדים או החלוקה, ואילו אשכולות גדולים עשויים להיות שבורים על ידי vortexing הנמרץ במשך כ 25 שניות.

בעיה	סיבות אפשריות	פעולה
תשואת חלבון נמוכה.	מספר נמוך של תאי transfected.	הפוך צפיפות תאים בטוחה היא כ 1.0 x 10 6 לפני הוספת תערובת תגובת transfection לתרבות.
	תאים שאולי היו subcultured יותר מדי פעמים.	להשתמש בתאי המניה טריים לאחר כ 90 לעבורגילים.
	DNA יכול להיות מושפל או יש כמות גבוהה של זיהומים.	יש ודא בשימוש פלסמיד דנ"א יחס 260/280 בין 1.8 ו2.0. ריצת DNA על ג'ל agarose מומלץ להעריך את איכותה.
	חלבון (ים) שהביע אינו יציב או מסיס מספיק.	בחן את המבנים שונים בקנה מידה קטנה לפני הגמלון-transfections. הפוך תגים בטוחים לא מפריעים למבנה של החלבון (ים) של עניין.
תאים נראים מעונן ויש לי צבע ו / או ריח מוזר.	תאים נגועים בחיידקים או שמרים.	טכניקה סטרילית טובה חייבת להיות בשימוש בכל העת. לאוורור זרימת הברדסים למינרית וUV-חיטוי חדר תרבית תאים במקרה של זיהום מסייע המכיל את הבעיה.
יש לי תאים כדאיות נמוכה.	pH שגוי בתקשורת.	ודא תרבויות בטוחים גדלים ב5-8% CO 2בכל העת.
	תאים היו בתרבית עד צפיפות מעל 3.0x10 6 תאים / מ"ל.	לא צריכים להיות מבוגרים תאים עד צפיפויות מעל 2.5 x 10 6 תאים / מ"ל מייד לפני transfection ולא x מעל 3.0 10 6 / תאים למ"ל.
טיהור זיקה לא עבדה	חלבון (ים) לא בא לידי ביטוי.	ראה לעיל.
	תנאי טיהור עשויים להיות שגויים.	התאם תנאי חיץ (למשל, מלח גבוה, נמוך מלח, pH.)

טבלת 1 פתרון בעיות.

מערכת	יתרונות	חסרונות
חיידק	מהירמערכת ביטוי תשואות גבוהה של חלבון זול מתאים לייצור במחיר סביר של חלבונים שכותרתו isotopically	חוסר מלווים חשובים שעשויות להידרש לקיפול חלבונים חוסר שינויים שלאחר translational רבים ייתכן חוסר שיתוף גורמים החשובים לתפקוד חלבון ו / או הרכבה מורכבת.
פ pastoris	ניתן לבצע את רוב שינויי translational הודעה זול	חסר כמה שינויים שלאחר translational ייתכן חוסר שיתוף גורמים החשובים לתפקוד חלבון ו / או הרכבה מורכבת.
ביטוי baculovirus בתאי חרקים	יכול לבצע את כל השינויים שלאחר translational Baculovirus הוא פחות רעיל לתאים מאשר זנים נגיפיים אחרים	הכנת הווירוס לתמרה היא זמן רב הווירוס הוא לא יציב ולא יכול להיות מאוחסן במשך פרקי זמן ארוכים תאי חרקים עשויים חוסר שיתוף גורמים החשובים לתפקוד חלבון ו / או הרכבה מורכבת.
ריאקטורים עם מערכות יונקים	יכול לבצע את כל השינויים שלאחר translational יכול לספק את כל שיתוף הגורמים נחוצים לתפקוד חלבון והרכבה מורכבת יכול תאי תרבות בצפיפויות גבוהות מאוד יכול לבטא את כל החלבונים של היונקים הדורשים מנגנונים קיפול מורכבים תשואות חלבון גבוהות מאוד	דורש צוות מיוחד כדי להשתמש bioreactor. ציוד יקר הנדרש. מצב ביטוי אופטימיזציהים עשוי להיות זמן רב.
תאי השעיה HEK 293F	יכול לבצע את כל השינויים שלאחר translational יכול לספק את כל שיתוף הגורמים נחוצים לתפקוד חלבון והרכבה מורכבת יכול לבטא את כל החלבונים של היונקים הדורשים מכונות קיפול מורכבות פרוטוקול transfection מהיר ואינטואיטיבי זול יחסית בהשוואה לbioreactors ו / או חומרים כימיים transfection זמינים מסחרי אחרים.	למרות מחיר סביר, לא זול כמו ביטוי בחיידקים

יתרונות טבלה 2 וחסרונות של מערכות ביטוי עיקריות.

דיון

פיתחנו שיטה יעילה פשוטה ועלות (PEI עולה הרבה פחות מאשר ריאגנטים transfection lipophilic זמינים מסחרי) לביטוי וטיהור כמויות גדולות של חלבונים רקומביננטי ומתחמים רב למקטע מתאי יונקים. ניתן להגיע transfection האופטימלי ויעילות ביטוי אם DNA הטהור ביותר פלסמיד (260/280 בין 1.8 ו2.0) משמש בשילוב עם PEI כפי שתואר בסעיף הפרוטוקול. תאים חייבים להיות מתורבת בתקשורת סרום ואנטיביוטיקה ללא, לכן, טכניקה סטרילית נדרש אך ורק לpassaging ותאי transfecting על מנת למנוע זיהומים יקרים וגוזל זמן. כדאיות תא צריכים להיות 90% או גבוהים יותר ותרבויות לא צריכים להיות מבוגרות כדי צפיפויות גדולות יותר מ2.5 x 10 ⁶ תאים / מ"ל מייד לפני transfection, כשעושה זאת תפחית תשואת חלבון. לtransfection מוצלח, תרבויות צריכים להכיל רק תאים בודדים או החלוקה. אשכולות יכולים להיות שבורים על ידי מרץvortexing היחידות הארגוניות 20 עד 30 שניות (איור 5). היחס של כל פלסמיד המשמש בשיתוף transfection יכול להיות מגוון על ידי המשתמש בהתאם להרכב של ההוויה המורכבת למדה. יעילות ביטוי יכולה להיות מותאמת לחלבון של עניין, כדי שניתן יהיה הוקם זמן ביטוי מתאים. טיהור יש לבצע שמירה הקרה מדגם חלבון בכל העת כדי להפחית את הסיכון של השפלה פרוטאוליטים לא רצויה. הבחירה של תגים ומאגרי טיהור היא קריטית, שכן הם עלולים להפריע לאלמנטים מבניים או אתרים פעילים של חלבונים מסוימים, ופעמים רבות תוצאה מסיסות ו / או אובדן של פעילות האנזימטית מופחתים. transfections בקנה מידה הקטן הם שימושי במיוחד לבדיקת מבנים שונים לטיהור של קומפלקסי חלבונים גדולים.

היום, מגוון רחב של שיטות חלופיות זמין לביטוי של חלבונים רקומביננטי אוקריוטים (טבלה 2). לדוגמא, Baculoviביטוי rus בתאי חרקים נעשה שימוש נרחב בשל יעילותה הגבוהה התמרה וחוסרה של cytotoxicity בהשוואה למינים נגיפיים אחרים ^6. עם זאת, התהליך של קבלת הווירוס הוא זמן רב וחוסר היציבות שלה אינו מאפשר לנגיף להיות מאוחסן במשך תקופות ארוכות. מצד השני, מערכות שמרי ביטוי להציע את האפשרות של גידול תאי צפיפויות גבוהה מאוד בתרבויות פרמנטור, וכתוצאה מכך התשואות גבוהות של חלבון ^7. אבל הם עדיין חסרים את המגוון המלא של שינויים שלאחר translational נדרשים לחלבונים אוקריוטים לקפל בצורה נכונה וליצור אינטראקציה עם שותפי החלבון שלהם. HDAC3, למשל, בא לידי הביטוי, אך לא לקפל בE. coli. עם זאת, כאשר באו לידי ביטוי ב293F תאים, היינו יכול לטהר את האנזים פעיל בקומפלקס עם העמיתים למדכאים שלה (SMRT) ומולקולה של tetraphosphate אינוסיטול (IP4) ^8, שלא נמצא בתאים פרוקריוטים. שיטה זו גם אפשרה לנו לטהר ולפתור את הגביש structure של HDAC1 אינטראקציה עם MTA1 במתחם NuRD, אשר מופעל באופן דומה על ידי ⁹ IP4. באופן אידיאלי, היינו תמיד רוצים להביע את החלבונים אוקריוטים בסביבה הטבעית, הפיזיולוגית שלהם. מערכות ביטוי של יונקים העסקת תאי 293-EBNA1 HEK בbioreactors ^10-12 תוארו ותנבנה רמות גבוהות מאוד של חלבון, אבל אלה יכולים להיות מורכבים לשימוש.

השיטה שלנו היא חלופה פשוטה ונגישה לביטוי במערכות חיידקים, שמרים וbioreactor. שיטת הביטוי היא מהירה ואינה דורשת שימוש בציוד יקר, במיוחד אם אווירת בקבוק רולר או בקבוק מוחלפת עם 5% CO ₂ וחממות רועדות סטנדרטיים משמשות. יש לנו בשימוש בפרוטוקולים אלה לשיתוף transfect פלסמידים מרובים ולטהר מתחמים עם עד חמישה חלבונים עם תשואות של> 1 מ"ג / L של התרבות. מעניין לציין, כי המערכת מסייעת בזיהוי של קומפלקסים מחונכים יציבים. לדוגמא, לשעברpression של המתחם בינארי של HDAC1 וSin3A נתן תשואות מוגבלות של חלבון, אך תוספת של SDS3 הביאה 5 פי סכומים גבוהים יותר, ולכן מנחה את הביולוג המבני בבחירה של מבנים מתאימים ומתחמים יציבים לגיבוש.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
תאי פריסטייל HEK 293F	LifeTechnologies	R790-07
FreeStyle 293 Expression Medium	LifeTechnologies	12338-018
Anti-FLAG M2 Affinity Gel	SIGMA	A220
250 מ"ל בקבוק ארלנמאייר עם כובע מאוורר	רולר 431144
עם פקקים מאווררים	קורנינג	01836-02
פוליאתילנימין, 25 kDa, מסועף	Sigma-Aldrich	408727	הכינו מלאי של 0.5 מ"ג/מ"ל ב-H2O, התאימו את ה-pH ל-7.0 עם HCl מדולל ואחסנו ב-20 - 4º C
			ביטוי יונקים
Dulbecco' s פוספט חוצץ מלח (DPBS)	סיגמא-אולדריץ'	D8537
0.22 ומיקרו; m יחידות סינון צנטריפוגליות	Amicon	UFC30GV00
15 מ"ל מסננים אולטרה צנטריפוגליים (חתך 10 kDa)	Amicon	UFC901008
Superdex  10/300 GL	GE Healthcare Life Sciences	17-5175-01