בידוד חלבון מהעכבר עוברי שסתום לב אזור פיתוח

סיכום

ניתוח ביטוי החלבון במסתמי עכברים עובריים צעירים נפגע על ידי הרקמה המוגבלת הזמינה. כתב יד זה מספק פרוטוקול להכנת חלבון מאזורי שסתום עכבר עובריים מתפתחים לניתוח כתמים מערביים.

תקציר

ניתוח כתמים מערביים הוא טכניקה נפוצה לאיתור וכימות רמות חלבון. עם זאת, עבור דגימות רקמה קטנות, ייתכן ששיטת ניתוח זו לא תהיה רגישה מספיק כדי לזהות חלבון מעניין. כדי להתגבר על קשיים אלה, בדקנו פרוטוקולים להשגת חלבון ממסתמי לב אנושיים בוגרים ושינינו פרוטוקולים אלה עבור עמיתיהם העובריים המתפתחים. בקצרה, אזורי המסתם האאורטלי העוברי של העכבר, כולל המסתם האאורטלי ודופן אבי העורקים שמסביב, נאספים בנפח המינימלי האפשרי של מאגר ליזה מבוסס טריס עם מעכבי פרוטאז. במידת הצורך על סמך אסטרטגיית הרבייה, העוברים עוברים גנוטיפ לפני איגום ארבעה אזורי מסתם אבי העורקים העוברי להומוגניזציה. לאחר הומוגניזציה, נעשה שימוש במאגר דגימה מבוסס SDS כדי לפרק את הדגימה להפעלה על ג'ל SDS-PAGE וניתוח כתמים מערביים לאחר מכן. למרות שריכוז החלבון נותר נמוך מכדי לכמת באמצעות מבחני כימות חלבון ספקטרופוטומטריים ונותרה דגימה לניתוחים הבאים, ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לזהות בהצלחה ולכמת למחצה חלבונים זרחניים באמצעות כתם מערבי מדגימות מאוגדות של ארבעה אזורי שסתום אבי העורקים של העכבר ביום 13.5 עוברי, שכל אחד מהם מניב כ-1 מיקרוגרם חלבון. טכניקה זו תועיל לחקר הפעלת מסלול איתות התאים ורמות ביטוי החלבון במהלך התפתחות מוקדמת של מסתם עכבר עוברי.

מבוא

יכולת לזהות ולכמת רמות ביטוי חלבון היא טכניקה סטנדרטית לבהמה וניסויים מבוססי תאים. עם זאת, למרות ארוך שנתי עניין בפיתוח שסתום לב עוברי מוקדם, הערכת ביטוי חלבון ברקמה הספציפית הזה במהלך ההתפתחות כיום מוגבלת לאימונוהיסטוכימיה בשני האפרוח ^ו1,2 עכבר. חלק מהקושי של כימות ביטוי חלבון בשסתומי הפיתוח של רוב האורגניזמים מודל (למשל, אפרוח ועכבר) הוא בגודל הקטן של השסתומים, אשר מגביל את כמות החלבון שניתן להשיג. לפיכך, לניתוחים כמותיים, חוקרים בדרך כלל מסתמכים על מיצוי RNA והגברה לPCR כמו שלאחר מכן או ניתוח microarray ^2-5. עם זאת, רמות ביטוי RNA והחלבון אינן מלא גומלות ^6, כל כך מתמקדות בביטוי RNA אינו יכולות לספק חשבון קפדני של שינויים הרבים המתרחשים בכל איתות שניתנהמסלול בזמנים שונים במהלך התפתחות. בהתבסס על מגבלה זו במתודולוגיה זמינה כרגע, המטרה של הליך זה הייתה לפתח פרוטוקול למהימן קבלת כמות מספקת של חלבון מאזורי שסתום לב העכבר עוברי מתפתחים לניתוח כמותי של שינויים המתרחשים במסלולי איתות שונים שחשובים ב ההבשלה של רקמה זו.

שסתומים עובריים כבר הם גזורים בדרך כלל מעכברים לבידוד RNA וניתוח ביטוי גנים לאחר ^2-5. עם זאת, מחקרים אלו היו מוגבלים לשימוש בביטוי גנים כקריאה מתוך איתות הפעלת מסלול, שאינו מאפשר זיהוי של לאתר שינויי חלבון לאחר translational שעשוי להשפיע על איתות במורד הזרם. תוך שימוש בטכניקות בידוד RNA כנקודת התחלה, התחלנו עם לנתח האזורים של עניין. בגלל האינטרס שלנו היה גילוי חלבוני phosphorylated שהיו מעיד על טפיחת איתותפעילות hway במהלך תקופה מסוימת של התפתחות שסתום אב העורקים (E13.5-14.5), ביצענו את כל הניתוחים במאגר טריס נטול פוספט ואספתי את השסתומים במאגר תמוגה מבוססת טריס עם מעכבי phosphatase ופרוטאז. במקרה הספציפי שלנו, רק אזורי שסתום אב העורקים נאספו, אבל יכול בקלות להיות מושגת אזור שסתום ריאתי באותו הזמן. אזורי שסתום היו אז הומוגני ושילוב עם מאגר מדגם המשמש כיום ללמוד ביטוי חלבון בשסתומי לב מבוגר ^7. על ידי שימוש בכמויות קטנות מדגם (למשל, 2 μl) ואיגום אזורי שסתום מעוברים עם גנוטיפ זהה, שהיינו מסוגל לזהות חלבונים עוברים פוספורילציה וnonphosphorylated ביום עוברי 13.5 ^8. מאחר שניתן להקפיא את אזורי שסתום ומאוחסנים במאגר תמוגה, ניתן genotyped עוברים במידת צורך לפני איגום.

טכניקה זו מרחיבה את הסט של כלים הזמינים להערכת סיגנליזטורי תאמסלולים גרם במהלך פיתוח ומספק מחמאה כמותי לאימונוהיסטוכימיה, במיוחד עבור שסתומי לב מתפתחים. טכניקה זו צריכה להיות בעל ערך לא רק לקרדיולוגים התפתחותיים, אלא גם לכל הביולוגים התפתחותיים שעובדים עם עוברים בראשית התפתחות מעוניינים באזורים המכילים רקמה מוגבלת.

פרוטוקול

הערה: כל הניסויים אושרו על ידי הוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטת צפון קרוליינה בצ'אפל היל.

.1 בלו מסתם אאורטלי

1. שימוש בטכניקת המתת חסד אושרה לשלב העוברי של עניין, להרדים עכבר בהריון עם גורים ביום הרצוי העוברי (E) של פיתוח.
2. השתמש 70% אתנול לעקר הבטן של הנשים בהריון. הרם את העור ושרירים של הבטן התחתונה ומן האיברים הפנימיים, ולנתח חלל הבטן התחתונה של פתוחה הנקבה כדי לאפשר גישה לקרן הרחם.
3. כדי לאחזר את קרן הרחם, להחזיק את צוואר הרחם עם מלקחיים וזנב לחתוך בזהירות למלקחיים. הרם את קרן הרחם, חיתוך כל רקמת חיבור שמחזיקה את הקרן במקום, ולהשלים את ההסרה על ידי חיתוך הצומת של קרן הרחם עם oviduct.
4. הנח את קרן הרחם גזור בcol צלחת פטרי המכילד 0.1 חיץ M טריס (pH 7.6) ולשטוף לפי צורך. לאחר מכן, חותך את קרן הרחם פתוח אורך חכם לחשוף את שקים העובריים.
5. כדי לחשוף את העובר, לחתוך לפתוח שק עוברי בצומת של השליה והעוברת ולחתוך את כלי הטבור לשחרר את העובר. מניחים את העובר גזור בצלחת פטרי שנייה עם חיץ M טריס קר 0.1. להחזיר את צלחת פטרי הראשונה עם עוברי undissected נותרים לקרח עד מוכן לעובר הבא.
6. כדי לשפר את קיר גישת חזה בתוך העובר, לערוף את העובר. אם גנוטיפ יש צורך, להסיר ולשמור חתיכת רקמה נוספת בצינור Eppendorf הניח על קרח.
7. מניחים את העובר על הגב שלה, וחתך את קיר החזה בצורה אנכית בצד של כלוב הצלעות, ליד forelimb, ואופקית מעל הסרעפת לדמיין את הלב. לאחר מכן, לפתוח את בית החזה כדי לחשוף את הלב.
8. בעזרת מלקחיים להחזיק גבוה לאורך כלי הגדול, להרים את הלב באמצעות מלקחיים ולחתוך את כלי להלן.n, לחתוך מעל המלקחיים כדי לשחרר את הלב. אם כלי ריאתי להישאר נימול, הריאות ניתן להסיר עם הלב, ויש להסיר לפני שתמשיך.
9. לחתוך ולהסיר את עורק הריאה מעל לרמה של השסתום; בשלבים העובריים שתוארו במסמך זה, עורק הריאה הוא מעט אטום, אשר מסייע באפליה שלה מאזור שסתום. לחתוך ממש מתחת לשסתום ריאתי, הימנעות שריר הלב של חדר trabeculated ולאסוף כפי שמתואר בשלב 1.10 אם אזור זה גם הוא עניין. כאן ובשלב הבא, להשתמש בפעולת נימים לצייר חיץ טריס עודף מהאזור של עניין לפני האיסוף במאגר תמוגה.
10. מוציא בזהירות את דיסטלי אב העורקים לשסתום אב העורקים, ממש מעל הרמה של השסתום; כמו עורק הריאה, אב העורקים נשארים אטומים מעט בשלבים העובריים אלה, בסיוע בהסרתה. לחתוך ממש מתחת לשסתום אב העורקים, שוב הימנעות שריר הלב של חדר trabeculated, ולהעביר אתשסתום באמצעות מלקחיים לצינור Eppendorf עם חיץ תמוגה 2 μl (שמתואר בטבלת חומרים) המכיל מעכבי פרוטאז וphosphatase על קרח.
11. חזור על שלבים 1.6-1.10 עד שסתומים כבר נכרת מכל העוברים, איסוף כל שסתום בצינור Eppendorf נפרד. אם יש לי כל העוברים גנוטיפ זהה, כל השסתומים עשויים להיות שנאספו בצינור Eppendorf יחיד.
12. אם גנוטיפ הוא שיש לבצע כדי לקבוע אילו שסתומי לחבור יחדיו, להציב מייד דגימות במאגר תמוגה ב -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף. אז יכולות להיות ונקוו דגימות לאחר genotyping (צעד 2.1.1).

הפקת .2 חלבון

1. להפשיר רקמות שנאספו על קרח ו צנטריפוגות ב XG 13,100 עבור 1 דקות כדי לאסוף את הרקמות במאגר תמוגה בחלק התחתון של הצינור.
   1. אם עוברים עברו מיפוי, להשתמש פיפטה לאסוף בעדינות ובמאגר תמוגה בריכה המכיל את אזורי שסתום מעוברים עם גנוטיפים דומים. כדי להבטיח ב חזקו, איגום 3-4 אזורים שסתום מעוברי E13.5 לדגימה מומלצת.
   2. אם כל העוברים היו של אותו גנוטיפ וכל אזורי שסתום נאספו יחד בשלב 1.10, lyse המדגם כולו, כפי שמתואר בשלב 2.2.
2. בדוק את עוצמת הקול של המדגם נקווה כתוצאה ולהוסיף למאגר תמוגה להיקף כולל של 40 μl; לאחר מכן, לשבש וhomogenize דגימות באמצעות חרוזים נירוסטה 5 מ"מ בצינורות אפנדורף. פועל lyser ל2-4 דק 'ב 50 הרץ, לפי הוראות היצרן. צינורות ספין בקצרה, (~ 13,100 XG 1 דקות), והעברת דגימות לצינורות חדשים, והותירו אחריו את הפסולת בלתי מסיס.
3. הכן דגימות נפרדות לSDS-PAGE והעברה לניתוח כתם מערבי שלאחר מכן, בעקבות פרוטוקול כגון אסלאמי et al ^9. סופג לחלבון בקרת טעינה הוא חיוני לכימות חלבון.

תוצאות

שימוש בטכניקת הכנה זו, שהיינו מסוגל לזהות סמאד ^1,5,8 פוספורילציה (pSmad) באזורי שסתום אב העורקים אחת מE13.5 עוברים. כפי שניתן לראות באיור 1 א, החלבון מבודד מאף אזור שסתום חד מספיק כדי לזהות להקת pSmad קלושה. עוצמת אות מגדילה באופן יחסי למספר אזורי שסתום שייאגרו. חשוב לציין, pSmad / היחס β-אקטין נשאר כמעט קבוע על פני הגדלים השונים מדגם (איור 1 ג). בשל הרמות נמוכות של חלבון זמין, באותו הכתם לא יכול להיות חשוף וreprobed לסמאד סך הכל. עם זא...

דיון

היכולת לכמת רמות חלבון בעכבר עוברי מוקדם וחומוס אזורי שסתום לב מספקת כלי נוסף להבנת אירועי איתות התאיות הקריטיים להתפתחות שסתום. הפרוטוקול שלנו שתואר במסמך זה אינו שונה בהרבה מהנהלים בידוד חלבון סטנדרטיים. עם זאת, על ידי שינוי כמה שלבים עיקריים, שהשגנו בהצלחה חלבוני phosphorylated מגודל מדגם קטן מאוד. כדי להשיג תוצאה זו, השלבים הבאים הם בעלת חשיבות מיוחדת. כדי להבטיח שחלבון באיכות מתקבל, זה הוא חיוני כדי לשמור על דגימות מקוררים, אם על קרח או על ידי שימוש במאגרים קר כקרח, בנוכחותו ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
		בהריון מתוזמן	לניתוח בשלב העניין העוברי
מיקרוסקופ סטריאוסקופי	Nikon	SMZ645
0.1 M Tris, pH 7.6
מיקרומספריים	Fine Science Tools	15003-08
מלקחיים עדינים, #5	Fine Science Tools	11251-30
מחט ניתוח המחזיקים	טד פלה בע"מ	13560
מחטי ניתוח	טד פלה בע"מ	13561-10
מיקרופיפטה, 20 μ l, עם טיפים
מאגר			50 מ"מ Tris-HCl, pH 7.5, 150 מ"מ NaCl, 5 מ"מ EDTA, 1% Triton
PhosSTOP	Roche	4906845001	הוסף טבליה אחת ל-10 מ"ל מאגר ליזה
TissueLyser LT	Qiagen	85600
חרוזי נירוסטה	Qiagen	69989
מיקרוצנטריפוגה