בידוד חלבון מהעכבר עוברי שסתום לב אזור פיתוח

Summary

ניתוח ביטוי החלבון במסתמי עכברים עובריים צעירים נפגע על ידי הרקמה המוגבלת הזמינה. כתב יד זה מספק פרוטוקול להכנת חלבון מאזורי שסתום עכבר עובריים מתפתחים לניתוח כתמים מערביים.

Abstract

ניתוח כתמים מערביים הוא טכניקה נפוצה לאיתור וכימות רמות חלבון. עם זאת, עבור דגימות רקמה קטנות, ייתכן ששיטת ניתוח זו לא תהיה רגישה מספיק כדי לזהות חלבון מעניין. כדי להתגבר על קשיים אלה, בדקנו פרוטוקולים להשגת חלבון ממסתמי לב אנושיים בוגרים ושינינו פרוטוקולים אלה עבור עמיתיהם העובריים המתפתחים. בקצרה, אזורי המסתם האאורטלי העוברי של העכבר, כולל המסתם האאורטלי ודופן אבי העורקים שמסביב, נאספים בנפח המינימלי האפשרי של מאגר ליזה מבוסס טריס עם מעכבי פרוטאז. במידת הצורך על סמך אסטרטגיית הרבייה, העוברים עוברים גנוטיפ לפני איגום ארבעה אזורי מסתם אבי העורקים העוברי להומוגניזציה. לאחר הומוגניזציה, נעשה שימוש במאגר דגימה מבוסס SDS כדי לפרק את הדגימה להפעלה על ג'ל SDS-PAGE וניתוח כתמים מערביים לאחר מכן. למרות שריכוז החלבון נותר נמוך מכדי לכמת באמצעות מבחני כימות חלבון ספקטרופוטומטריים ונותרה דגימה לניתוחים הבאים, ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לזהות בהצלחה ולכמת למחצה חלבונים זרחניים באמצעות כתם מערבי מדגימות מאוגדות של ארבעה אזורי שסתום אבי העורקים של העכבר ביום 13.5 עוברי, שכל אחד מהם מניב כ-1 מיקרוגרם חלבון. טכניקה זו תועיל לחקר הפעלת מסלול איתות התאים ורמות ביטוי החלבון במהלך התפתחות מוקדמת של מסתם עכבר עוברי.

Introduction

יכולת לזהות ולכמת רמות ביטוי חלבון היא טכניקה סטנדרטית לבהמה וניסויים מבוססי תאים. עם זאת, למרות ארוך שנתי עניין בפיתוח שסתום לב עוברי מוקדם, הערכת ביטוי חלבון ברקמה הספציפית הזה במהלך ההתפתחות כיום מוגבלת לאימונוהיסטוכימיה בשני האפרוח ^ו1,2 עכבר. חלק מהקושי של כימות ביטוי חלבון בשסתומי הפיתוח של רוב האורגניזמים מודל (למשל, אפרוח ועכבר) הוא בגודל הקטן של השסתומים, אשר מגביל את כמות החלבון שניתן להשיג. לפיכך, לניתוחים כמותיים, חוקרים בדרך כלל מסתמכים על מיצוי RNA והגברה לPCR כמו שלאחר מכן או ניתוח microarray ^2-5. עם זאת, רמות ביטוי RNA והחלבון אינן מלא גומלות ^6, כל כך מתמקדות בביטוי RNA א....

Protocol

הערה: כל הניסויים אושרו על ידי הוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטת צפון קרוליינה בצ'אפל היל.

.1 בלו מסתם אאורטלי

1. שימוש בטכניקת המתת חסד אושרה לשלב העוברי של עניין, להרדים עכבר בהריון עם גורים ביום הרצוי העוברי (E) של פיתוח.
2. השתמש 70% אתנול לעקר הבטן של הנשים בהריון. הרם את העור ושרירים של הבטן התחתונה ומן האיברים הפנימיים, ולנתח חלל הבטן התחתונה של פתוחה הנקבה כדי לאפשר גישה לקרן הרחם.

Results

שימוש בטכניקת הכנה זו, שהיינו מסוגל לזהות סמאד ^1,5,8 פוספורילציה (pSmad) באזורי שסתום אב העורקים אחת מE13.5 עוברים. כפי שניתן לראות באיור 1 א, החלבון מבודד מאף אזור שסתום חד מספיק כדי לזהות להקת pSmad קלושה. עוצמת אות מגדילה באופן יחסי למספר אזורי שסתום שייאגרו. חשוב לציין, pSmad / היחס β-אקטין נשאר כמעט קבוע על פני הגדלים השונים מדגם (איור 1 ג). בשל הרמות נמוכות של חלבון זמין, באותו הכתם לא יכול להיות חשוף וreprobed לסמאד סך הכל. עם זא.......

Discussion

היכולת לכמת רמות חלבון בעכבר עוברי מוקדם וחומוס אזורי שסתום לב מספקת כלי נוסף להבנת אירועי איתות התאיות הקריטיים להתפתחות שסתום. הפרוטוקול שלנו שתואר במסמך זה אינו שונה בהרבה מהנהלים בידוד חלבון סטנדרטיים. עם זאת, על ידי שינוי כמה שלבים עיקריים, שהשגנו בהצלחה חלבוני phosphorylated מגודל מדגם קטן מאוד. כדי להשיג תוצאה זו, השלבים הבאים הם בעלת חשיבות מיוחדת. כדי להבטיח שחלבון באיכות מתקבל, זה הוא חיוני כדי לשמור על דגימות מקוררים, אם על קרח או על ידי שימוש במאגרים קר כקרח, בנוכחותו .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
		בהריון מתוזמן	לניתוח בשלב העניין העוברי
מיקרוסקופ סטריאוסקופי	Nikon	SMZ645
0.1 M Tris, pH 7.6
מיקרומספריים	Fine Science Tools	15003-08
מלקחיים עדינים, #5	Fine Science Tools	11251-30
מחט ניתוח המחזיקים	טד פלה בע"מ	13560
מחטי ניתוח	טד פלה בע"מ	13561-10
מיקרופיפטה, 20 μ l, עם טיפים
מאגר			50 מ"מ Tris-HCl, pH 7.5, 150 מ"מ NaCl, 5 מ"מ EDTA, 1% Triton
PhosSTOP	Roche	4906845001	הוסף טבליה אחת ל-10 מ"ל מאגר ליזה
TissueLyser LT	Qiagen	85600
חרוזי נירוסטה	Qiagen	69989
מיקרוצנטריפוגה