מאמר שיטה

דור של Enterobacter Sp. YSU Auxotrophs שימוש transposon mutagenesis

DOI:

10.3791/51934

⸱

31 באוקטובר 2014

1Department of Biological Sciences, Center for Applied Chemical Biology, Youngstown State University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

sp Enterobacter. YSU גדל במדיום מלחים מינימאליים של גלוקוז. Auxotrophs מופקים על ידי הפיכתה עם transposome שמכניס את עצמו באופן אקראי לגנום המארח. מוטציות נמצאות על ידי ציפוי העתק מבינוני מורכבת עד בינוני מינימאלי. גנים נקטעו מזוהים על ידי הצלת גן ורצף.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חיידקי Prototrophic גדלים על M-9 מלחים מינימאליים בינוני בתוספת גלוקוז (בינוני M-9), המשמש כמקור פחמן ואנרגיה. יכול להיות שנוצר Auxotrophs באמצעות transposome. Tn 5 transposome זמין מסחרי, -derived שימוש בפרוטוקול זה מורכב ממקטע ליניארי של ה- DNA המכיל מקור R6K שכפול γ, גן לעמידות kanamycin ושני ברצף הפסיפס מסתיים, המשמש כאתרי transposase מחייבים. Transposome, סיפק כמתחם חלבון ה- DNA / transposase, מוצג על ידי electroporation למתח prototrophic, sp Enterobacter. YSU, ובאופן אקראי משלב את עצם לתוך הגנום של מארח זה. Transformants היא העתק מצופה על לוריא-Bertani צלחות אגר המכילות kanamycin, (LB-קאן) ועל גבי צלחות אגר M-9 מדיום המכילות kanamycin (M-9-קאן). Transformants הגדלים על צלחות LB-קאן, אבל לא על צלחות M-9-קאן נחשב auxotrophs. הגנומי מטוהרDNA מauxotroph מתעכל באופן חלקי, ligated והפך לPIR + Escherichia, מתח (E. coli). מקור שכפול R6Kγ מאפשר פלסמיד לשכפל בPIR + E. coli זנים, וסמן התנגדות kanamycin מאפשרים בחירת פלסמיד. כל transformant בעל פלסמיד חדש המכיל את transposon מוקף אזור כרומוזומליות שהופסק. סנגר רצף והמקומי יישור חיפוש הכלי בסיסי (פיצוץ) מציעים זהות משוערת של הגן שהופסק. ישנם שלושה יתרונות לשימוש באסטרטגית mutagenesis transposome זה. ראשית, הוא אינו מסתמך על הביטוי של גן transposase על ידי המארח. שנית, transposome מוחדר מארח היעד על ידי electroporation, ולא על ידי נטיה או על ידי התמרה ולכן הוא יעיל יותר. שלישית, מקור שכפול R6Kγ עושה את זה קל לזהות g המוטציהENE שהוא התאושש באופן חלקי בפלסמיד רקומביננטי. טכניקה זו יכולה לשמש כדי לחקור את הגנים מעורבים במאפיינים אחרים של sp Enterobacter. YSU או של מגוון רחב יותר של זני חיידקים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חיידקי Prototrophic לגדול בM-9 מלחים מינימאליים בינוני המכילים גלוקוז (M-9 בינוניים), המרת גלוקוז דרך מסלולי חילוף חומרים פחמן מרכזיים לייצר מבשרים, כגון חומצות אמינו, חומצות גרעין וויטמינים, לביוסינתזה 1. M-9 בינוניים מכיל אמוניום כלוריד כמקור חנקן, נתרן ופוספט אשלגן כחיץ ומקור זרחן, מגנזיום סולפט כמקור גופרית וגלוקוז כמקור פחמן ואנרגיה. לוריא-Bertani הבינוני (LB) הוא עשיר בחומצות אמינו מtryptone ובויטמינים וגורמי גדילה מתמצית שמרים. הוא תומך בצמיחה של auxotrophs שלא יכול לסנתז חומצות אמינו, ויטמינים וגורמי גדילה אחרים הנדרשים לצמיחה על M-9 בינוניים. כך, prototrophs יגדל בLB ו- M-9 בינוני, ואילו auxotrophs יגדל במדיום LB אבל לא בM-9 בינוניים. על ידי החדרת מוטציות לאוכלוסיית prototrophic של חיידקים וזיהוי גנים שעברו מוטציה שגורמים לפנוטיפים auxotrophic, זה פוssible להשיג הבנה טובה יותר של חילוף החומרים בזן חיידקים.

mutagenesis transposon יכול לשמש כדי לזהות רב של גנים הדרושים להתפתחות ברמת הסוכר בM-9 בינוניים. Transposons להכניס את עצמם באופן אקראי לגנום המארח 2. על ידי תצפית transformants transposon על צלחות אגר LB והעתק ציפוים על גבי צלחות אגר M-9 בינוניים, ניתן להקרין לauxotrophs. גנים נקטעו מזוהים דרך הצלת גן. מחקר זה משתמש Tn זמין מסחרי 5 -derived transposome שנשלח כפתרון של קטע DNA transposon יניארי מעורבב עם חלבון transposase. קטע DNA חסר גן transposase אבל מכיל את גן לעמידות kanamycin, המוצא שכפול γ R6K ושני מוטיבים פסיפס שהם רצפי DNA לtransposase מחייבים בכל קצה של הקטע 3,4. מאחר וחלבון transposase מתווסף ישירות ל- DNA, מגזר ה- DNA לבדמוגדר כtransposon, ומורכב חלבון ה- DNA / transposase מוגדר כtransposome. Transposome עובר טרנספורמציה על ידי electroporation 5 למארח רגיש kanamycin (איור 1 א). יש מושבות הגדלים על צלחות אגר LB המכילות kanamycin (LB-קאן) מוסיף transposon (איור 1), וtransformants העתק מצופה שלא מצליח לגדול על M-9 צלחות אגר המכילות בינוני kanamycin (M-9-קאן) הם auxotrophs (Figire 1 ג '). הדנ"א הגנומי של מוטציה הוא מטוהר ומעוכל חלקית עם endonuclease הגבלת חיתוך 4-הבסיס, Bfu CI (1D איור). DNA ligated הופך לזן של Escherichia coli (E. coli) המכיל את גן PIR (איור 1E). גן זה מאפשר לפלסמיד החדש המכיל את transposon ואיגוף אזור כרומוזומליות מארח לשכפל בE. coli 6. גן התנגדות kanamycin משמש כסמן electable לפלסמיד החדש. לבסוף, רצף באמצעות פריימרים משלימים לכל קצה של transposon והיסוד מקומי יישור חיפוש כלי הניתוח (פיצוץ) 7,8 של הרצף וכתוצאה מכך נמצא בשימוש כדי לקבוע את זהותו של גנים נקטעו.

אסטרטגית mutagenesis transposome זה מספקת שלושה יתרונות 3. ראשית, מאז חלבון transposase קשור ישירות לtransposon, הכנסה אינה תלויה בביטוי של גן transposase בתוך הפונדקאי. ברגע שtransposon משלב את עצם לתוך הגנום המארח, transposase נפגע, מניעת תנועה נוספת של transposon. עם זאת, לא ניתן למנוע תנועה נוספת אם המארח בעל אלמנט transpositional אנדוגני Tn 5. שנית, כניסתה של transposome ידי electroporation מאפשרת להשתמש בו במגוון רחב של מארחים. זה גם מבטל את הצורך להציג את transposon ידי קוניוגציה או על ידי viזיהום RAL. שני התהליכים דורשים רגישות מארח. שלישית, הכללה של גן התנגדות kanamycin והמוצא שכפול γ R6K בtransposome עושה את זה קל יותר לזהות את הגן שהופסק. ניתן לאחסן אזורי transposon-מופרע ורצף כפלסמידים, ומבטל את הצורך להשתמש בתגובת השרשרת של פולימראז ההפוך טכניקה (PCR) לזיהוי גן.

הפרוטוקול שהוצג בסרטון הזה מתאר כל שלב לmutagenesis transposon של sp Enterobacter. 9 YSU באמצעות transposome מהחדרתו לתאי החיידקים לזיהוי של הגן המשוער שזה ייפסק. בנוסף לפרוטוקולים שפורסמו בעבר 3,4,10, שיטות מפורטות לשימוש בציפוי העתק למסך auxotrophs מוצגות. טכניקת mutagenesis זה יכול לשמש לחקר פנוטיפים אחרים, כגון התנגדויות אנטיביוטיות ומתכת, בסוגים שונים של חיידקים, לזיהויifying המספר המינימלי של גנים הדרושים להתפתחות בתנאי תרבות הוגדרו במחקרים בביולוגיה סינטטיים, או להוראת מרכיב מעבדה של גנטיקה או קורס פיזיולוגיה של חיידקים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Electroporation של תאים מוסמכות 5,11

  1. לדלל O / תרבות N LB של sp Enterobacter. YSU 1/20 ל -50 מיליליטר של מדיום LB הטרי ולגדול עם רועד ב120 סל"ד ו -30 ° C עד OD (600 ננומטר) בין 0.4 ו -0.6. לחלופין, לגדול זני חיידקים אחרים בטמפרטורת הצמיחה האופטימלית שלהם.
  2. צ'יל התאים על קרח למשך 5 דקות ו צנטריפוגות ב 4 ° C ו -7,000 XG למשך 5 דקות.
  3. בטל supernatant, resuspend תאי 50 מיליליטר של מים סטריליים קרח קרים ו צנטריפוגות ב 4 ° C ו -7,000 XG למשך 5 דקות. חזור על פעולה זו.
  4. בטל supernatant ו resuspend התאים בנפח מים קרים כקרח שווים לגלולת נפח תא. עבור אחסון לטווח ארוך, לשטוף את התאים עם 10 מיליליטר של קרח קר 10% (v / v) גליצרול, גלול בשווה גלולה נפח של קרח קר 10% (v / v) גליצרול, חנות ב -80 מעלות צלזיוס, והפשרה על קרח לפני electroporation.
  5. הוסף 0.5 μl של transposome 40 μl שלתאים. פתרון transposome זמין המסחרית מסופק בריכוז ה- DNA של 0.33 מיקרוגרם / μl. למרות 0.33 מיקרוגרם מומלץ, 0.165 מיקרוגרם DNA מספיק.
  6. מניחים את תערובת התא / transposome בקרח קר, 0.2 מ"מ, קובט electroporation ולהקיש על התערובת לתחתית של קובט. לזעזע את התאים ב 25 μF, 200 Ω, ו -2.5 קילו וולט. כדי להבטיח שהתאים נשארים מקוררים, לאחסן cuvettes electroporation במקפיא C -20 ° לפני השימוש.
  7. מייד, להוסיף 960 μl של מסנן מעוקר מרק סופר אופטימלי עם דיכוי catabolite בינוני (SOC). מערבבים על ידי pipetting למעלה ולמטה ולהעביר את תאי צינור microfuge סטרילי 1.5 מיליליטר.
    הערה: התאים מתחילים למות לאחר ההלם, אבל מלח במדיום SOC מאפשר להם להתאושש. כדי לחסוך, אין זה הכרחי להוסיף transposome או לזעזע את תאי בקרה השליליים. רק להוסיף 960 μl בינוני SOC סטרילי אליו.
  8. דגירה התאים ב 30 מעלות צלזיוס ואו דקות 45-60 עם רועד ב120 סל"ד. זה מספק זמן לtransposome ללהשתלב מחדש עם גנום המארח ולתאים להביע התנגדות kanamycin.
  9. התפשטות של תאים 100 μl על צלחת אגר LB-קאן ודגירת O הצלחת / N ב 30 מעלות צלזיוס. אחסן את תערובת הטרנספורמציה שנותרה במקרר ב 4 מעלות צלזיוס. מורחים סכומים נוספים במועד מאוחר יותר עד 2 שבועות לאחר electroporation הראשוני במידת צורך.

2. gridding של transformants

  1. סרט רשת למכסה של צלחת פטרי מ"מ ריקה 100 x 15. העתק רשת מ" ​​קורס קצר בקטריאלי הגנטיקה "12.
  2. למתוח קו על החלק התחתון של צלחת אגר LB-קאן. השתמש בפיסה קטנה של סרט לעגן אותו למכסה gridded כך שהרשת היא גלויה לעין דרך אגר. ודא שהשורה על החלק התחתון של הצלחת מיושרת עם החלק העליון, מרכז הרשת. עיגון הצלחת עם קלטת שומר עליו מפני החלקה, ומאפשר לאף gridding. הקו מאפשר זיהוי מושבה לאחר ציפוי העתק.
  3. בחר transformant יחיד עם קיסם סטרילי ולהבחין בו במרכזה של כיכר ברשת. רק לגעת במושבה והמקום. לא לחפור הקיסם לתוך אגר. כדי למנוע זיהום הצלחת, להתמודד עם הקיסם רק בקצה אחד.
  4. ספוט transformant נוסף בכיכר סמוכה כמו בשלב 2.3. כאשר הצלחת מלאה, דגירה אותו O / N ב 30 מעלות צלזיוס. זה צלחת האדון.

3. Replica ציפוי לקביעת Auxotroph הפנוטיפ 12

  1. לכל צלחת שgridded, להפוך את ערימה של שלוש צלחות טריות אגר ממוספרות אחד עד שלוש: אחד לLB-קאן, שני לM-9-קאן ושלושה לLB-קאן. ייבש את הצלחות הפוכות, O / N, על 37 מעלות צלזיוס לפני השימוש.
  2. צייר קו בחלק העליון של כל צלחת כמו בשלב 2.2.
  3. נגב את כלי ציפוי העתק עם 70% אתנול, למקם את כיכר קטיפה סטרילית על גבי ציפוי ההעתק לol ולצבוט את כיכר הקטיפה. ידיים רוחשת חיידקים גם לאחר שטיפתם. למנוע הכניסה של זיהום חיידקים על ידי הטיפול מרובע הקטיפה בקצה שלה.
  4. יישר קו על צלחת ההורים עם קו משורטט על המהדק ומניח את הצלחת על גבי כיכר הקטיפה. להפעיל לחץ עדין להעביר את החיידקים מהצלחת לכיכר הקטיפה. היזהר שלא למרוח את החיידקים. הסר את צלחת האב מכיכר הקטיפה.
  5. יישר את הקו שצויר על מספר לוחית אחד עם הקו על המהדק ולמקם אותו על גבי כיכר הקטיפה. להפעיל לחץ עדין להעביר את החיידקים מכיכר הקטיפה לצלחת. הסר את מספר לוחית אחת.
  6. מחק את כיכר הקטיפה לתוך כוס מים ומניח את ריבוע נקי, סטרילי קטיפה על כלי ציפוי העתק כמו בשלב 3.3. פעולה זו מונעת על-חיסון שגורם לצמיחת פריצת דרך ותוצאות חיוביות כוזבות.
  7. יישרקו על מספר לוחית אחד עם הקו על המהדק ולמקם אותו על גבי כיכר הקטיפה החדשה. להפעיל לחץ עדין להעביר את החיידקים ממספר לוחית אחת לכיכר הקטיפה. הסר את מספר לוחית אחת.
  8. יישר את הקו שצויר על מספר לוחית שתיים עם הקו על המהדק ולמקם אותו על גבי כיכר הקטיפה. להפעיל לחץ עדין להעביר את החיידקים מכיכר הקטיפה למספר צלחת שתי. הסר את מספר לוחית שתי.
  9. חזור על שלב 3.8 למספר לוחית שלוש. הצלחת השלישית היא שליטה להעברה מלאה מהצלחת הראשית לשתי צלחות האחרות. מחק את כיכר הקטיפה לתוך כוס של מים. כדי לעשות שימוש חוזר ריבועי הקטיפה, חיטוי הכוס המכילה ריבועי קטיפה המזוהמים, לשטוף אותם, לייבש אותם, לעטוף אותם בנייר אלומיניום ומחדש חיטוי אותם.
  10. דגירה הצלחות על 30 מעלות CO / N. מושבות הגדלים על שני הצלחות אגר LB-קאן, אבל לא מצליחים לגדול על צלחות M-9-קאן נחשבות auxotrophs ( איור 2).
  11. auxotrophs פס החוצה ממספר לוחית אחת על צלחת אגר LB-קאן טרי, ודגירה את הצלחת על 30 מעלות CO / N.
  12. פס החוצה לבידוד 3 מושבות מצלחת הפס בשלב 3.11 על צלחת LB-קאן טרי. דגירה את הצלחת על 30 מעלות CO / N. הדבר מבטיח כי המוטציה היא מבודדת היטב. מחלקים את הצלחת לשלישים ופס את כל מושבה בסעיף אחד.
  13. מושבות ספוט מהמושבות הנמוגות נגזרות מצעד 3.12 על צלחת LB-קאן טרי כדי ליצור רשת כמו בצעדים 2.1-2.4. כל מוטציה היא להיות מחדש נבדקה בשלושה עותקים.
  14. לשכפל את צלחת שוב כמו בצעדים 3.1-3.10 כדי לאשר את הפנוטיפ auxotroph.

4. ג'ין הצלה

  1. לגדול 3 O מיליליטר / תרבות N של מושבה מוטציה מבודדת מצעד 3.13 במדיום LB-קאן נוזלי על 30 מעלות צלזיוס. לטהר DNA הגנומי של 1 מיליליטר של התרבות באמצעות ערכת טיהור הדנ"א הגנומי זמינה מסחרי.
  2. הגדר את תערובת של 0.025 Uendonuclease Bfu CI הגבלה ו -14 μl של 1 מיקרוגרם / הדנ"א הגנומי μl בתגובת 20 μl על קרח. מאז Bfu CI חותך את transposon בעשרה אתרים שונים, זה יכול להיות יעיל יותר להשתמש endonuclease הגבלה, BFA אני או Hae III, אשר חותך את transposon בשניים ושלושה אתרים שונים, בהתאמה.
  3. דגירה התגובה על 37 מעלות צלזיוס למשך 25 דקות ולאחר מכן ב 80 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות כדי להשבית את האנזים. ניתוח 3 μl של ה- DNA המעוכל חלקית על ג'ל 0.8% agarose (איור 3). תוצאות מוצלחות חלקיות עיכול במריחה מ 10 kb עד לתחתית של הג'ל.
  4. ולקשור 15 μl של הדנ"א הגנומי מעוכל חלקית באמצעות 800 יחידות של האנזים T4 DNA בתגובת μl 500. דגירה C ° O תגובה / N ב 4. גדול נפח התגובה מגדיל את קשירה של שברים יחידים לעצמם וממזער את יחסי גומלין בין שניים או יותר שברי DNA.
  5. Precipitate DNA ligated על ידי הוספת 50 μl של 3 אצטט M נתרן, pH 5.5, ו 1 מיליליטר של 95% אתנול ו דוגרים אותו ב -20 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
  6. Microfuge DNA על 4 מעלות צלזיוס ו13,500 XG במשך 10 דקות, לשטוף את הכדור עם 70% אתנול, לייבש אותו ברכז ואקום צנטריפוגלי, וresuspend אותו 10 μl מים nuclease חינם. לחלופין, ה- DNA יכול להיות אוויר יבש ב RT במשך 15 דקות.
  7. השתמש 4 μl של ה- DNA resuspended להפוך E. PIR coli ECD100D מתח או pir116 ECD100D ידי electroporation כאמור בסעיף 1. המקור שכפול γ R6k דורש זן חיידקים עם גן PIR לשכפל 6. תוצאות מתח PIR בפלסמידים עותק נמוכים, ומתח pir116 מכיל את גן שעבר מוטציה PIR כי תוצאות בפלסמידים עותק גבוהים. כל transformant מכיל פלסמיד חדש עם transposon ואזור של כרומוזום שהופסק (איור 1E).
  8. Inoculאכלתי 5 מיליליטר של מדיום LB-קאן עם מושבה אחת, לגדל אותו O / N עם רועד ב120 סל"ד ו -37 מעלות צלזיוס, ולטהר את פלסמיד דנ"א מכל O / התרבות N באמצעות ערכה מסחרית.
  9. לעכל 14 μl של פלסמיד באמצעות I. Xho endonuclease ההגבלה ודא הנפח הסופי של התגובה הוא 20 μl. אנזים זה מזהה אתר באמצע transposon בסוף '5 של גן התנגדות kanamycin. לנתח 10 μl של מעוכל ומתעכל פלסמיד על 0.8% agarose ג'ל (איור 3). פלסמיד מורכב מה- DNA מארח transposon kb 2 בתוספת האיגוף.

רצף 5. DNA

  1. רצף פלסמיד באמצעות מערכת ניתוח רצפי נימי ערכה זמינה מסחרי רצף, פריימרים שהומולוגיים לכל קצה של transposon, ו. לחלופין, פלסמיד ניתן לשלוח למוסד מחוץ לרצף.
  2. משתמש בתקן המשקל המולקולרי (סולם kb 1) בג'ל להעריך את גודלו של פלסמיד. ואז, להעריך את מספר ננוגרם (ng) של פלסמיד הנדרש ל-50 fmol.
  3. למדוד את הריכוז של פלסמיד דנ"א באמצעות ספקטרופוטומטר באורכי גל של 260 ננומטר (260) ו- 280 ננומטר (280). להבטיח את אורך נתיב האור דרך קובט הוא 1 סנטימטר. קבע את הריכוז על ידי הכפלת הספיגה ב 260 ננומטר ב -50 ng / μl. פלסמיד דנ"א באיכות גבוהה יהיה 260 / יחס 280 בין 1.8 ו -2.0.
  4. הנפח של ה- DNA הנדרש לכל תגובת סידור הוא מספר NG נדרש ל-50 fmol מחולק בריכוז של פלסמיד. מערבבים את הנפח של פלסמיד הנדרש במים כדי להביא את הנפח הכולל של עד 10 μl.
  5. מחממים את תערובת פלסמיד דנ"א / מים על 96 מעלות צלזיוס במשך דקות 1 ולאחר מכן לקרר אותו לRT.
  6. הוסף 8 μl של תערובת הורים מערכת הרצף ו -2 μl של 1.6 מיקרומטר של אחד מצבעי יסוד הרצף.
  7. Folנמוך הפרוטוקול מערכת הרצף לתכנית Cycler תרמית וניקוי תגובה.
  8. לנתח כל דגימה באמצעות מערכת ניתוח ה- DNA נימים.
  9. השתמש בחבילת תוכנה זמינה מסחרי כדי להציג את רצף ה- DNA. חפש את הרצף, "5'-GAGACAG-3", "שהוא 7 נ"ב האחרון של transposon (איור 4). הרצף לפני סוף '5 של קטע 7 נ"ב זה שייך לtransposon. הרצף אחרי סוף '3 של קטע 7 נ"ב זה שייך לגן שהופסק.
  10. לקבוע את הפונקציה האפשרית של הגן שהופסק שימוש המקומי יישור חיפוש הכלי בסיסי (פיצוץ) 7,8. השתמש הבא link: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&BLAST_PROGRAMS=megaBlast&PAGE_TYPE=BlastSearch . הדבק את הרצף של הפסיקהגן ed לתוך תיבת השאילתה, בחר באפשרות "אחר" תחת מסד הנתונים ולחץ על "פיצוץ" בחלק התחתון של הדף. כאשר התוצאה מופיעה, לגלול את הדף למטה כדי להציג את תוצאות היישור (איור 5).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפיכתו של sp Enterobacter. YSU ידי electroporation עם transposome יזם הכנסת הגנום אקראית לתוך הגנום המארח (איור 1 א, ב '). Electroporation מוצלח הניב כמה אלף transformants שגדלה על צלחות LB-קאן. כדי להשיג 300-400, היטב במרווחי מושבות בכל צלחת, הסכום של התפשטות תערובת הטרנספורמציה על כל צלחת אגר LB-קאן היה מותאם. כל transformant כלול להוסיף transposon לפחות אחד, אבל זה לא היה ברור אם גן חשוב לצמיחה בM-9 בינוניים נקטע ללא סינון על ידי ציפוי העתק. Transforma...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

mutagenesis transposon באמצעות transposome הוא כלי יעיל ליצירת auxotrophs בsp Enterobacter. חיידקים חיוביים YSU וסוגים אחרים של שלילי גרם וגרם 3,4. התהליך נעשה ביוזמת החדרת Tn 5 transposome -derived למארח על ידי electroporation. לזהות מושבות עם מוסיף, מתח יעד untransformed היה צריך להיות רגיש לkanamycin כדי לבחור עבור סמן ההתנגדות המבוצע על ידי transposon. מארחים מסוימים לייצר endonucleases הגבלה שלבזות את ה- DNA transposon לפני שהיא יכולה להשתלב מחדש ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחבר יש מה למסור.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחבר מבקש להודות לכל סטודנט לתואר ראשון שלי עצמאי תלמידי מחקר ואת כל הסטודנטים לתואר השני מיקרוביאלית הפיסיולוגיה שלי שנבדקו רעיונות mutagenesis transposon במהלך הסמסטרים אביב 2010-2014. עבודה זו מומנה על ידי המחלקה למדעי ביולוגיה באוניברסיטת מדינת יאנגסטאון.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
EZ-Tn5 R6K&גמא; ori/KAN-2 Tnp Transposome KitEpicentre (Illumina)TSM08KR
EC100D pir+ Electrocompetence E. coliEpicentre (Illumina)ECP09500מסוגל לשכפל פלסמידים עם R6Kγ מקור שכפול במספר עותק נמוך
EC100D pir-116 Electrocompetence E. coliEpicentre (Illumina)EC6P095Hמסוגל לשכפל פלסמידים עם R6Kγ מקור שכפול במספר עותק גבוה
5X M-9 מלחיםThermo FisherDF048517
Lennox LB BrothThermo FisherBP1427-2
AgarAmresco, Inc.J637-1KGמדיה מוצקה הכילה 1.6% (w/v) אגר
קנמיצין סולפט אמרסקו, בע"מ0408-25Gבעת הצורך, מדיה המכילה 50 μ גרם/מ"ל קנמיצין סולפט
D-גלוקוז מונוהידראטאמרסקו, בע"0643-1 ק"ג
תמצית שמריםאמרסקו, בע"מJ850-500G
טריפטוןאמרסקו, בע"מJ859-500G
KClסיגמא-אולדריץ'P4504-500G
NaCl אמרסקו, בע"מX190-1KG
MgCl2Fisher ScientificBP214-500
MgSO2Fisher ScientificBP213-1
מרק סופר אופטימלי עם דיכוי קטבוליט (SOC) בינוני0.5% (w/v) תמצית שמרים, 2% (w/v) טריפטון, 10 מ"מ NaCl, 2.5 מ"מ KCl, 10 מ"מ MgCl2, 20 מ"מ MgSO4 ו-20 מ"מ גלוקוז
BfuC INEBR0636Sעיכול חלקי של DNA גנומי
Xho INEBR0146Sעיכול פלסמיד
T4 DNA LigaseNEBM0202S
מים ללא נוקלאזAmresco, Inc.E476-1Lלהמסת DNA מזורז ותגובות אנדונוקלאז הגבלה
GenomeLab DTCS - ערכת התחלה מהירהבקמן קולטר608120ריצוף DNA
ערכת טיהור DNA גנומיPromegaA1120A
Wizard Plus SV Minipreps מערכת טיהור DNAPromegaA1460טיהור פלסמיד
בלוק ציפוי העתקתרמו פישר09-718-1
ריבועי קטיפהתרמו פישר09-718-2ציפוי העתק
PetriStickersמגוון ביוטקPSTK-1100רשת לציפוי העתק
צלחות פטריתרמו פישרFB0875712
Gene Pulser IIBioRadאלקטרופורציה
אלקטרופורציה קובטות – 2 מ"מBioExpressE-5010-2
CentriVap DNA רכז ואקוםLabconco7970010ייבוש DNA
CEQ 2000XL מערכת ניתוח DNAבקמן קולטר
וקטור NTI Advance 11.5.0Life Technologies12605099ניתוח רצף DNA
מ אשף

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kim, B. H., Gadd, G. M. Bacterial physiology and metabolism. , Cambridge University Press. Cambridge. (2008).
  2. Hayes, F. Transposon-based strategies for microbial functional genomics and proteomics. Annual review of genetics. 37, 3-29 (2003).
  3. Hoffman, L. M. Random chromosomal gene disruption in vivo using transposomes. Methods in molecular biology. 765, Clifton, N.J. 55-70 (2011).
  4. Goryshin, I. Y., Jendrisak, J., Hoffman, L. M., Meis, R., Reznikoff, W. S. Insertional transposon mutagenesis by electroporation of released Tn5 transposition complexes. Nature biotechnology. 18 (1), 97-100 (2000).
  5. Dower, W. J., Miller, J. F., Ragsdale, C. W. High Efficiency Transformation of E. coli by High Voltage Electroporation. Nucleic Acids Research. 16 (13), 6127-6145 (1988).
  6. Metcalf, W. W., Jiang, W., Wanner, B. L. Use of the rep technique for allele replacement to construct new Escherichia coli hosts for maintenance of R6Kγ origin plasmids at different copy numbers. Gene. 138 (1-2), 1-7 (1994).
  7. Morgulis, A., Coulouris, G., Raytselis, Y., Madden, T. L., Agarwala, R., Schäffer, A. a Database indexing for production MegaBLAST searches. Bioinformatics. 24 (16), Oxford, England. 1757-1764 (2008).
  8. Zhang, Z., Schwartz, S., Wagner, L., Miller, W. A greedy algorithm for aligning DNA sequences. Journal of computational biology a journal of computational molecular cell biology. 7 (1-2), 203-214 (2000).
  9. Holmes, A., Vinayak, A., et al. Comparison of two multimetal resistant bacterial strains: Enterobacter sp. YSU and Stenotrophomonas maltophilia OR02. Current microbiology. 59 (5), 526-531 (2009).
  10. Hoffman, L. M., Jendrisak, J. J., Meis, R. J., Goryshin, I. Y., Reznikoff, W. S. Transposome insertional mutagenesis and direct sequencing of microbial genomes. Genetica. 108 (1), 19-24 (2000).
  11. Ausubel, F., Brent, R., et al. Short Protocols in Molecular Biology. , John Wile., & Sons, Inc. New York, NY. (1997).
  12. Miller, J. H. A short course in bacterial genetics: a laboratory manual and handbook for Escherichia coli and related bacteria. 2, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Plainview, N.Y. (1992).
  13. Gibson, M. I., Gibson, F. Preliminary studies on the isolation and metabolism of an intermediate in aromatic biosynthesis: chorismic acid. The Biochemical journal. 90 (2), 248-256 (1964).
  14. Jacobs, M. A., Alwood, A., et al. Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), (2003).
  15. Reznikoff, W., Winterberg, K. Transposon-Based Strategies for the Identification of Essential Bacterial Genes. Microbial Gene Essentiality: Protocols and Bioinformatics SE. 2, 13-26 (2008).
  16. Suzuki, N., Inui, M., Yukawa, H. Random genome deletion methods applicable to prokaryotes. Applied Microbiology and Biotechnology. 79 (4), 519-526 (2008).
  17. Malley, M. A., Powell, A., Davies, J. F., Calvert, J. Knowledge-making distinctions in synthetic biology. BioEssays news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 30 (1), 57-65 (2008).
  18. Zheng, Y. -N., Li, L. -Z., et al. Problems with the microbial production of butanol. Journal of industrial microbiolog., & biotechnology. 36 (9), 1127-1138 (2009).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Replica PlatingDNABLASTR6K

מאמרים קשורים