מדידת מרחב ובזמן Ca 2 + אותות בצמחים ארבידופסיס

סיכום

איתות ^{2 +} Ca מסדירה תהליכים ביולוגיים מגוונים בצמחים. כאן אנו מציגים גישות לניטור לחץ אביוטי המושרה Ca מרחב ובזמן ^{2 +} אותות בתאי ארבידופסיס ורקמות באמצעות Ca ^{2 +} אינדיקטורים מקודד גנטי Aequorin או Case12.

תקציר

רמזים התפתחותית וסביבתיים לגרום Ca ^{2 +} תנודות בתאי צמח. Ca ^{2 +} דפוסי מרחב וזמן גירוי ספציפי חשו על ידי חלבוני Ca ^{2 +} מחייב סלולריים שליזום Ca ^{2 +} מפלי איתות. עם זאת, אנחנו עדיין יודעים מעט על איך גירוי האותות ^{2 +} Ca הספציפי נוצרים. הספציפיות של אות Ca ^{2 +} ניתן לייחס לרגולציה המתוחכמת של הפעילויות של הערוצים ו / או מובילי Ca ^{2 +} בתגובה לגירוי נתון. לזהות מרכיבים תאיים אלה ולהבין את תפקידם, זה קריטי לשימוש במערכות המאפשרות הקלטה רגישה וחזקה של אותות ^{2 +} Ca בשתי הרקמות ורמות תאיות. Ca ^{2 +} אינדיקטורים מקודד גנטי שממוקדות לתאים סלולריים שונים סיפקו פלטפורמה להדמית confocal תא חי של Ca ^{2 +} אותות סלולריים. כאן אנו מתארים הוראהים לשימושם של שני Ca ^{2 +} מערכות גילוי: aequorin FAS (שתילי דבק סרט) הדמיה הארה Ca ^{2 +} וcase12 הקרינה confocal תא חי המבוססת הדמיה Ca ^{2 +} מבוסס. הדמיה הארה באמצעות מערכת FAS מספקת זיהוי פשוט, חזק ורגיש של ^{2 +} אותות מרחב ובזמן Ca ברמת הרקמה, תוך הדמיה confocal תא חי באמצעות Case12 מספקת זיהוי בו זמני של cytosolic ^{ו2 +} אותות Ca גרעיניים ברזולוציה גבוהה.

מבוא

תא הצמח מגיב לסביבה באמצעות איתות שהוא מתאם את פעולות תא. תא מוקדם איתות אירוע בתגובה לגירויים סביבתיים הוא עליית Ca ^{2 +} ארעית. הדפוס, או החתימה של עלייה זמנית בריכוז Ca ^{2 +} חינם מאופיין במשרעת, התדירות, ומשך הזמן שלה. חתימות ^{2 +} Ca מרחב ובזמן שונים מסדירות את הפעילות סלולרית שונה ^1. גירויים ספציפיים, כגון חום, קור, מלח, הבצורת, אור, או הורמונים צמחיים, עשויים לכוונן את פעילות מרחב ובזמן של ערוצים מקומי קרום Ca ^{2 +} ו / או מובילים, וכתוצאה מכך Ca ^{2 +} חתימות ספציפיות. למרות Ca ^{2 +} מובילים כבר מאופיינים היטב, מעט מאוד ידוע על הזהות המולקולרית ופונקציות של ערוצי ^{2 +} Ca בצמחי ^1. מסכי גנטיים למוטציות בתגובה שינתה Ca ^{2 +} להדגיש גירויים עשויים להיות appr יעילאוח לזיהוי הרכיבים שמרכיבים את חתימות Ca ^{2 +.} מערכות גילוי Ca ^{2 +} לאחרונה מבוססים כמה Aequorin פותחו המאפשרות מסכי גנטיים לCa ^{2 +} איתות רכיבים בתגובה להתקפת הפתוגן ואביוטי מתח ^2-4.

Aequorin שימש לראשונה כדי לזהות Ca ^{2 +} אותות בצמחים בתחילת 1990 ^5. מאז, Aequorin כבר ממוקד לתאים סלולריים שונים, כגון ציטופלסמה ^5, גרעין ^6, כלורופלסטים ^7, tonoplast ^8, מיטוכונדריה ^9, וסטרומה ^10, כמו גם לסוגים שונים של תאים בשורש כדי לפקח על תא ספציפי Ca ^{2 +} אותות ^11. מדידות Ca ^{2 +} מבוסס Aequorin לחשוף את Ca ^{2 +} תגובת מרחב ובזמן של אוכלוסייה של תאים להדגיש גירויים. עם זאת, ברוב המקרים, תגובות Ca ^{2 +} של תאים בודדים הן unsynchronized ברקמות להגיב ^4. לכן, הקלטת ^{2 +} Aequorin Ca לא בהכרח לדווח אות Ca ^{2 +} בתאים בודדים. בשנים האחרונות, חלבון פלואורסצנטי מקודד גנטי (FP) המבוסס Ca ^{2 +} אינדיקטורים, כגון Cameleon הצהוב (YCS) ^{12 ו13} CASEs12 היה בשימוש ללמוד Ca ^{2 +} איתות עם רזולוציה subcellular גבוהה. YCS הוא העברת אנרגיית תהודת הקרינה (סריג) המבוסס Ca ^{2 +} אינדיקטורים, המכילה CFP ו YFP ריאנטים מקושר על ידי Ca ^{2 +} -binding calmodulin החלבון ופפטיד מחייב calmodulin M13. Calmodulin עובר שינוי קונפורמציה כפי שהוא נקשר לCa ^{2 +,} ובכך מביא CFP ו YFP ביחד קרוב, וכתוצאה מכך העברת אנרגיה מוגברת (סריג משופר). רמת סריג לאורך זמן, מחושבת בערך כמו היחס של YFP לעוצמות אות CFP, משקפת תאיים Ca ^{2 +} דינמיקה. כמה גרסאות י"ס היו בשימוש בצמחים. YC3.6 היה targeted לcytosol ^14,15, גרעין ^16, מיטוכונדריה ^17, וקרום פלזמה ^18, וYC4.6 וD4ER היו ממוקד לחדר המיון ^15,19, וD3cpv היה ממוקד peroxisomes ^20. צמחים מהונדסים מבטא YCS לאפשר ההדמיה לחיות התאים של Ca ^{2 +} דינמיקה בתוך תאים סלולריים שונים של סוגי תאים שונים. מקרים (כנראה Ca lcium se nsor) הם חלבונים יחידים מעגלי permuted ניאון (cpFPs) מחסה calmodulin ופפטיד מחייב calmodulin M13. על הכריכה לCa ^{2 +,} מקרים עוברים שינויי קונפורמציה, שהובילו לגידול של עוצמת הקרינה. המתאם בין תגובת הקרינה של CASE וריכוז Ca ^{2 + 2 +} מאפשר דינמיקה תאית Ca להימדד כמותית. גרסת Case12 יש לקפל 12 עלתה הקרינה בCa ^{2 +} צורות -saturated. נ צמחי benthiminana זמני exprEssing Case12 או צמחי ארבידופסיס ביציבות להביע 12 מקרה שמשו ללמוד איתות Ca ^{2 +} במתח הבטחוני ואביוטי ^{4,21. 2 +} תנודות Ca מרחב ובזמן אסינכרוני בתאים מגיבים להתקפת הפתוגן, או ללחץ התייבשות נחשפו עם ההדמיה Ca ^{2 +} מבוסס Case12.

כאן, אנו מציגים הוראות מפורטות להדמית Aequorin מבוססת הארה של ברקמה וגירויים ספציפית Ca ^{2 +} דינמיקה בשתילי ארבידופסיס, והדמית confocal של cytosolic וCa הגרעיני ^{2 +} דינמיקה בתאי שורש ארבידופסיס המבטאות מקרה 12. הדמיה הארה של FAS יכול להיות מותאם כדי לנתח דינמיקת Ca ^{2 +} מתח מושרה בצמחים או ברקמות אינן מתוארות כאן בשלמותה, או כדי לסנן אוכלוסיות צמח ארבידופסיס mutagenized למוטציות עם לחץ שינה המושרה Ca ^{2 +} אותות. התקנת ההדמיה התא החי Ca ^{2 +} יכולה להיות מותאמת כדי לנתח Ca2 + דינמיקה בתוך תאי subcelluar שונים או בתאים מסוגים שונים באמצעות Ca ^{2 +} אינדיקטורים אחרים.

פרוטוקול

.1 ההדמיה Aequorin מבוסס Ca ^{2 +} שימוש במערכת FAS

1. הכן שתילי הדמיה הארה. לעקר זרעים של צמחי ארבידופסיס להביע Aequorin עם פתרון אקונומיקה 10% מכיל 0.01% Triton-100. לזרוע את הזרעים סטריליים על צלחת מרובעת (10 x 10 סנטימטר צלחת פטרי מרובע עם רשת,) המכילים במלוא הכוח MS (Murashige ותערובת Skoog סל מלח), סוכרוז 1%, ואגר 1.2%. צלחות מקום אנכי בתא צמיחה לאחר ריבוד על 4 מעלות צלזיוס למשך 2 ימים (איור 1 א).
2. העבר את השתילים על גבי סרט. מניחים סרט דבק (איור 1) בחלק העליון של שתילים ישנים 7-10 יום גדלו על הצלחת. דחף בעדינות את הסרט ביד על מנת להבטיח ששתילים לדבוק בסרט (איור 1 ג). לקלף את הסרט בעדינות, כך שהשתילים יישארו דבקו בסרט (1D איור ו1E)
3. דגירה השתילים עם cofactor. הנח אתשתילי dhered לצלחת המרובע (10 x 10 סנטימטר) המכילה 15 מ"ל של 2 מיקרוגרם h-CTZ / מ"ל ​​(coelenterazine) במים. דגירה השתילים בטמפרטורת חדר למשך 4 שעות ללילה (איור 1F).
4. להתכונן להדמית הארה. קח את הסרט של פתרון h-CTZ ולחתוך אותו באמצע, ויצר שתי חתיכות. מניחים כל חתיכת סרט עם שתילים עם הפנים כלפי מעלה בשתי צלחות שונות. השאר את הצלחות בחושך במשך 5 דקות.
5. לרכוש תמונות הארה. בחושך, מקם את שתי הצלחות לצד זה על הבמה של מערכת ההדמיה הארה (איור 1G). לרכוש תמונות מייד עם הוספת 20 מ"ל של תמיסת גירויים לצלחות בו זמנית.
6. ניתוח תמונות הארה. בחר את אותו טווח תצוגה לכל תמונות הארה. לחתוך את האזור של העניין (ROI) וליצור תמונות כקבצים (איור 2 א) JPEG. לחלופין, לייצא את התמונות כקבצים בפורמט SPE ולייבא אותם לתוךתוכנת ניתוח תמונת ImageJ. מדידות קבועות לחישוב הערך האפור הממוצע של החזר על השקעה. בחר באותו הגודל של שטח החזר על ההשקעה ולמדוד את הנתונים אפורים ובהווה אומר כגרף עמודות (איור 2).

.2 תא חי הדמיה Confocal Ca ^{2 +}

1. הכן שתילים להדמית confocal. לעקר זרעים של צמחי ארבידופסיס להביע case12 עם פתרון אקונומיקה 10% מכיל 0.01% טריטון. לזרוע את הזרעים סטריליים על צלחת המכילה מלחי כוח משרה מלא MS, סוכרוז 1%, ואגר 1.2%. צלחות מקום אנכי בתא צמיחה לאחר ריבוד על 4 מעלות צלזיוס למשך 2 ימים.
2. צ'יימברס ההדמיה התקנה
   1. להרכיב חדר הדמיה באמצעות שקופיות וcoverslip (קאמרי). מניחים פיסת צמר גפן במים ספוגה על אמצע השקופית. לאחר מכן להעביר ישנים שתילי 5 יום אחד או שתיים מהצלחת על החלק העליון של צמר גפן ספוג מים. היצמד חתיכות קטנות של חימר לכל פינה של coverslip,coverslip מקום ד בחלק העליון של שתילים כדי ליצור פער (קאמרי) בין coverslip ושקופיות (איור 3 א, פנל משמאל). חבר קצה אחד של צינור פוליאתילן (0.58 מ"מ קוטר) למזרק 1 מ"ל ומניח את הקצה השני של צינור מייד בסמוך לתא. החזק את צינורות במקום עם קלטת (איור 3 א, פנל מימין).
   2. להרכיב חדר הדמיה באמצעות תא פרספקס (הקאמרי B).
      1. מורחים שכבה דקה של גריז סיליקון סביב שני צינורות פוליאתילן (קוטר 0.58 מ"מ) ולחץ על הצינורות מצופים לערוצים בכל צד של חדר פרספקס (איור 3B עזב פנל). מורחים שכבה דקה של גריז סיליקון על פני השטח של התא המכיל את חריצי הצינור ולחץ coverslip לתוך הגריז לאטום צד אחד של פתיחת התא (לגזור).
      2. העבר את השתיל בן חמישה ימים מהצלחת לתוך התא ולמקם את פיסת צמר גפן טבול במים בo העליונהf השתיל. מורחים גריז סיליקון על גבי המשטח האחר של החדר, ולחץ coverslip אחר על גבי לאטום. חבר את קצו של אחד מהצינורות למזרק 1 מ"ל. השאר את קצה הצינורית האחר (פנל מימין איור 3 ב) פתוח.
   3. הכן חדר הדמיה באמצעות מכסה זכוכית chambered (הקאמרי C). לעקר את מכסה זכוכית chambered עם אתנול 70% ולהשאיר אותה על מכסה המנוע עד יבש. הוספת 0.6 מ"ל או 0.2 מ"ל של כוח מלא בינוני MS המכיל סוכרוז 1% וphytagel 0.5% לבאר כל תא 2 היטב או קאמרי 8 היטב (פנל מימין איור 3 ג), בהתאמה. לעקר זרעים ולזרוע את הזרעים ישירות בכיסוי זכוכית chambered המכילה שכבה דקה של ג'ל ברור ולתת להם לגדול בצורה אנכית במשך 5 ימים (איור 3 ג).
3. לרכוש תמונות באמצעות מיקרוסקופ confocal. כדי להחיל גירויי מתח, כגון מלח, קר או מי חמצן, להזריק לאט על 200 μl של 150 mM NaCl, קרח colהמים ד או 1 מ"מ H ₂ O ₂ פתרון לתוך התא (הקאמרי A או B) רק לפני רכישת תמונות, או בעדינות להוסיף 500 μl μl או 100 של פתרון גירוי ולשל תא 2 או 8 היטב, בהתאמה . צלם תמונות באופן מיידי לאחר יישום פתרון הגירוי באמצעות מיקרוסקופ confocal Nikon A1R הפוך לייזר סריקה עם עדשת 20X טבילה במים (צמצם מספרי 0.75). לאסוף סדרת זמן של תמונות ב 4 מרווחי שניות עם אורכי גל עירור ופליטה של ​​488 ננומטר ו500-550 ננומטר, בהתאמה, וברזולוצית פיקסל של 512 x 512.
4. ניתוח תמונה
   השימוש בNikon אלמנטים, ROIs נמשכו מסביב לכל תא (או אזור) של עניין. עוצמת סה"כ בתוך כל החזר על השקעה נמדדה לאורך זמן באמצעות תיבת הדו שיח זמן המדידה (יכול לשמש ImageJ במקום). מדידות עוצמת סה"כ יוצאו ומעובד בDataGraph. משרעת ספייק ^{2 +} Ca הוגדר כעוצמת שיא מינוס עצמת מנוחה, משך כהזמן דואר בין ייזום והשלמת ספייק, ותקופה כפי שמרווח הזמן בין פסגות ספייק הסמוכות של שני קוצים. ט'-test שימש להשוות את האמצעים.

תוצאות

מניטול, NaCl וH ₂ O ₂ שמשו כשליחים לגירויי התייבשות, מלח וסטרס חמצונים, בהתאמה. כדי לבדוק אם יון המתכת הכבד Cu ^{2 +} synergizes עם כל אחד משלושת גירויי מתח אלה, השווינו את תגובת Ca ^{2 +} לכל גירויים בנוכחותו או היעדריו של Cu ^{2 +.} כפי שניתן לראות באיור 2, הדמיה הארה FAS גילתה כי שתילי Arabidoposis הגיבו באופן שונה להתייבשות, מלח וסטרס חמצונים. לריכוז של גירויים נבחנו במחקר זה, 75 mM NaCl מושרה Ca ^{2 +} התג...

דיון

אנחנו הוכחנו מערכת FAS להקלטת Ca ^{2 +} תגובת מרחב וזמן של שתילי ארבידופסיס. מערכת הקלטה זו FAS Ca ^{2 +} מספקת גישה פשוטה, רגישה וחזקה שיכול להיות מותאמת למדידת Ca ^{2 +} דינמיקה מופעלת על ידי גירויים שונים, בנוסף לגירויים אביוטי המתח שמוצגים כאן. באמצעות מערכת זו, אנו יכולים בקלות להשוות ברקמה או גירויים ספציפיים ^{2 +} דינמיקת Ca מרחב וזמן ברמת הצמח כולו. הרגישות הגבוהה של FAS מאפשרת השימוש בגירויים בעוצמה נמוכים לבחינת תגובות Ca ^{2 +,} ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
צלחת פטרי מרובעת בגודל 10 ס"מ על 10 ס"מ	VWR	60872-310
סרט דבק	VWR	60941-062
צינורות פוליאתילן	PerkinElmer	9908265
מזרק 1 מ"ל	VWR	53548-000
גריז סיליקון	בקמן	335148
זכוכית כיסוי עם תא 2 בארות	Nalge Nunc international	155379
זכוכית כיסוי בעלת 8 תאים	Nalge Nunc International	155409
מערכת הדמיית זוהר	Princeton Instruments	N/A
מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי הפוך	Nikon Instruments Inc.	לא ישים	ניקון A1R
תוכנת הדמיה	Nikon Instruments Inc.	לא ישים	Nikon Elements
DataGraph	Visual Data Tools Inc	N/A	DataGraph 3.1.1 היא הגרסה החדשה ביותר
Coelenterazine	NanoLight Technolgies	#301B NF-BCTZ-FB
אקונומיקה לכל מטרה	כל חנות מקומית	N/A
Triton X-100	Fisher	BP151500
MS מלח	Phytotechnology Labs	M524-50L
סוכרוז	VWR	BDH8029-12 ק"ג
אגר	סיגמא	A1296-5 ק"ג
פיטאג'ל	סיגמא	P8169-1 ק"ג