נדידת נוירונים מווסתת על ידי מספר רב של גורמים אוטונומיים תאיים ולא תאים. פרוטוקול זה מראה כיצד ניתן להשתמש באלקטרופורציה ברחם כדי לקבוע אם פנוטיפ בעכבר טרנסגני נובע משיבוש במנגנון הפנימי של התא או מפגיעה באינטראקציה בין הנוירון לסביבתו.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
אינדוקציה של חלבונים באמצעות מחיקה ברחם Electroporation להגדיר גירעונות בעצביים הגירה במודלים מהונדסים
במאמר זה
סיכום
תקציר
מחיקה גנטית באמצעות מערכת Cre-לקס בקווי עכבר מהונדסים היא כלי רב עוצמה המשמש ללמוד תפקוד חלבון. עם זאת, למעט בדגמי Cre ספציפיים מאוד, מחיקה של חלבון בכל אוכלוסיית רקמה או תא מוביל לעתים קרובות לפנוטיפים מורכבים הנובעים ממנגנוני אינטראקציה מרובים. קביעה אם תוצאות פנוטיפ משיבוש מנגנון אוטונומי תא, שהוא מהותי לתא בשאלה, או ממנגנון אוטונומי שאינו תא, אשר יביא מירידת הערך של הסביבה של התא ש, יכולות להיות קשות להבחין. כדי לקבל תובנה תפקוד חלבון בהקשר in vivo, electroporation ברחם (IUE) מחיקת גן מאפשר בתת-קבוצה קטנה של תאים בקליפת המוח מתפתח או אזור במוח שנבחר אחר. IUE יכול לשמש כדי להתמקד באזורים מסוימים במוח, כולל telencephalon הגב, telencephalon המדיאלי, היפוקמפוס, או רוממות ganglionic. זה מקל על o תצפיתf ההשלכות של מחיקת גן אוטונומית תא בהקשר של סביבה בריאה. המטרה של פרוטוקול זה היא להראות כיצד IUE ניתן להשתמש כדי לנתח פגם בהגירה הרדיאלי בקו עכבר מהונדס floxed, עם דגש על הבחנה בין ההשפעות האוטונומיות אוטונומיות ולא-תא התא של מחיקת חלבון. על ידי השוואת פנוטיפ כתוצאה ממחיקת הגן בתוך כל הקליפה לעומת מחיקת גן תיווך IUE באוכלוסיית תא מוגבלת, להבין טוב יותר את תפקוד חלבון בהתפתחות המוח ניתן להשיג יותר מאשר באמצעות אחת טכניקה בבידוד.
מבוא
הגירת רדיאלי היא תהליך מרכזי בהתפתחות קליפת המוח מוקדמת. זה תלוי במגוון גורמים אוטונומיים תא, כגון יציאה נכונה mitotic והבחנה עצבית, קוטביות תא, רגולציה של דינמיקת cytoskeletal וביטוי של קולטנים הטרנסממברני, כמו גם גורמים אוטונומיים שאינו תא, כגון היווצרות פיגום גליה רדיאלי ו הפרשת ההדרכה נודדת מולקולות 1-3. מאז שיבוש של כל אחד ממנגנונים אלה יכולים לפגוע בהעברה עצבית במודל של עכברים מהונדס 4-8, קביעת הסיבה הבסיסית של פגם בהגירה יכולה להיות תהליך מורכב וקשה. ברחם electroporation (IUE) ניתן להשתמש כדי להשלים ולפשט פרשנות של הפנוטיפ של מודל נוק-אאוט גנטי ובכך להבהיר מנגנונים חשובים הנדרשים להגירת רדי....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הערה: כל הניסויים אושרו על ידי האוניברסיטה של ועדת האתיקה הטיפול בבעלי חיים של אוטווה, הקפדה על ההנחיות של המועצה הקנדית על טיפול בבעלי חיים.
הכנה וחומרים 1. טרום ניתוחיים
- פלסמיד הכנה:
- הכן פלסמידים באמצעות MegaPrep Qiagen פי הפרוטוקול של היצרן. Innoculate לפחות 400 מיליליטר של מרק LB עם חיידקים הפכו להבטחת תשואת DNA גבוהה ודגירת הלילה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
ניתן לכוון לאזורים שונים במוח לצורך אלקטרופורציה על ידי שינוי כיווןן של אלקטרודות המשטח (paddle electrodes) מעל ראשו של העובר (איור 2). עבור כל חלקי המוח הקדמי, הפלסמיד מוזרק לחדר הצדי (ניתן לכוון למוח האחורי על ידי הזרקה לחדר הרביעי). באופן כללי, יש להניח את האלקטרודות כך שהקו הישר ביניהן יעבור דרך אזור העניין, כאשר ה-DNA נמשך לעבר האלקטרודה החיובית. כדי לכוון לקליפה הצדית (lateral cortex) (איור 2A), הנח את האלקטרודה החיובית מעל ההגסין הירוק, בזווית רוסטרלית קלה. עבור הקליפה המדיאלית (m.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
שניים מהאתגרים העיקריים בביצוע בelectroporations ברחם הם 1) מניעה קטלני עובר ו 2) הפחתת שונות בין electroporations. אחד הגורמים החשובים ביותר במניעה קטלנית הוא איכות מחט, כמחטים קהות לגרום יותר נזק לעובר. בעת חיתוך המחט, לשמור על קצה זמן רב ככל האפשר בזמן שעדיין מאפשר אגל גלוי של 0.1-0.2 μl של נוזל להופיע הבא משאבה של ההנעה כף הרגל (איור 1J). אם המחט היא משעממת מדי או קצרה מדי הפיר, נזק לרקמות וכתוצאה מכך יכול להרוג את העובר. לעומת זאת, אם קצה המחט הוא דק.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף
תודות
אנו אסירי תודה לפייר מטר ופרדה מילר על עזרתם באלקטרופורציה ברחם ולנואל גאנם ובנסון פונג על יצירת דיאגרמות. אנו מודים ללינדה ג'וי וג'ייסון ג'י מקלורין על הסיוע הטכני המצוין. הציוד נתמך על ידי המרכז להתאוששות משבץ מוחי.
עבודה זו נתמכה על ידי מלגה מ-HSFO ו-OGS ל-D.S.S. ומענק CIHR ל-R.S.S.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| ECM 830 גל מרובע אלקטרופורטור | BTX הרווארד מכשיר | 45-0052 | אלקטרופורטור בלבד – קנה כבלים בנפרד (45-0204) |
| 1250FS מתג רגל עבור ECM 830 | BTX הרווארד מנגנון | 45-0211 | משוט רגל נחוץ לאלקטרופורציה ללא ידיים |
| פינצטה | BTX הרווארד מנגנון | 45-0489 (5 מ"מ) 45-0488 (7 מ"מ) | אלקטרודות בסגנון מלקחיים פלטינה |
| Femtojet | Eppendorf | 920010504 | Microinjector |
| Griphead 0 | Eppendorf | 920007414 | מחזיק את המחט הנמשכת |
| מחזיק נימי אוניברסלי | Eppendorf | 920007392 | מחבר את ראש האחיזה לצינור |
| הזרקה | Eppendorf | 920007431 | מחבר מחזיק נימי ל-Femtojet |
| בקרת כף הרגל | Eppendorf | 920005098 | משוט כף הרגל להזרקה ללא ידיים |
| טיפים למיקרו-טוען טיפים | 930001007 Eppendorf | טיפים | להעמסת צינורות הנימים הנמשכים |
| פלסמיד מגה קיט | Qiagen | 12181 | 5 QIAGEN-tip 2500, ריאגנטים, חוצצים |
| מהיר ירוק FCF | Sigma-Aldrich | F7252-5G | צבע לא רעיל |
| מספריים בון עדין במיוחד | כלי מדע עדינים | 14084-08 | לחיתוך המחטים |
| מספריים פזילה בון | כלי מדע עדינים | 14084-09 | |
| מלקחיים Graefe | כלי מדע עדינים | 11050-10 | |
| מחזירי קוליברי | כלי מדע עדינים | 17000-03 | |
| מהדק | כלי מדע עדינים | 12031-07 | עבור קליפים |
| של 7 מ"ממחזיק מחט Castroviejo | כלים רפואיים | SNH-6737 | ישר, עם מנעול |
| חולץ מחט | Narishige | PC-10 | למשיכת מיקרו-קפילרים |
| מיקרו-נימים | Drummond | 1-000-800 | 0.4 מ"מ צינורות נימי זכוכית בקוטר פנימי |
מקורות
- Hippenmeyer, S. Molecular pathways controlling the sequential steps of cortical projection neuron migration. Adv. Exp. Med. Biol. 800, 1-24 (2014).
- Evsyukova, I., Plestant, C., Anton, E. S. Integrative mechanisms of oriented neur....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
