Method Article

שיטה להקרנה ואישור של מוטציות עמידות נגד קינאז המעכבים

DOI:

10.3791/51984

⸱

December 7th, 2014

 ,  ,  , 
1Divisions of Experimental Hematology and Cancer Pathology, Cancer Blood Disease Institute, Cincinnati Children's Hospital Medical Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הופעתה של התנגדות גנטית נגד טיפול במעכבי קינאז מציבה אתגר משמעותי לטיפול בסרטן יעיל. זיהוי ואפיון של מוטציות עמידות נגד סמים חדשים שפותח מסייע בניהול טוב יותר קליני ועיצוב תרופת הדור הבא. כאן אנו מתארים הפרוטוקול שלנו להקרנה ואימות של מוטציות עמידות במבחנה.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הגילוי של BCR / ABL כאונקוגן נהג בלוקמיה מיאלואידית הכרונית (CML) הביא לפיתוח של גליבק, אשר, למעשה, הוכיח את הפוטנציאל של מיקוד kinase בסרטן על ידי יעילות טיפול בחולי CML. תצפית זו חוללה מהפכה בפיתוח תרופות למקד קינאז שהעור מעורב בגידולים ממאירים שונים אחרים, כגון, EGFR, B-RAF, KIT וPDGFRs. עם זאת, חסרון עיקרי אחד של טיפולים אנטי-kinase הוא ההופעה של מוטציות עמידות לתרופות טיוח היעד להפחיתה או איבדה את הזיקה לסמים. הבנת המנגנונים המועסקים על ידי גרסאות עמידות לא רק עוזרת בפיתוח מעכבי הדור הבאים, אלא גם נותנת תנופה לניהול קליני באמצעות רפואה אישית. דיווחנו אסטרטגית retroviral וקטור מבוססת הקרנה לזהות את הספקטרום של ההתנגדות המקנה מוטציות בBCR / ABL, אשר סייעה בפיתוח הדור הבא BCR / ABL מעכבים. באמצעות Ruxolitinib וJAK2 כזוג יעד סמים, כאן אנו מתארים בשיטות הקרנה חוץ גופית שמנצלות את תאי BAF3 העכבר מבטאים את ספריית המוטציה האקראית של קינאז JAK2.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קינאז החלבון הם אנזימים רגולטוריים מרכזיים של מסלולי העברת אותות תוך-תאיים שלכאורה לווסת כל פונקציה סלולרית. בקרה נאותה של איתות kinase בתיווך היא קריטית להומאוסטזיס ופיתוח, אשר רובם מסתמך על רגולציה ראויה של קינאזות, phosphatases והשפלה שלה על ידי UPS (מערכת היוביקוויטין פרוטאזום). קינאז deregulated נמצא במרכז הבמה של סוגי סרטן רבים ומעורב בשורה של מחלות בבני אדם 1. הגנום אנושי מקודד יותר מ -500 קינאז חלבון שנקשר, במישרין או בעקיפין, ל~ 400 מחלות אנושיות 2. תצפיות אלה תמכו ברעיון למיקוד טיפולי של קינאז על ידי מעכבי מולקולה קטנים 3-5.

ההפגנה של מעכבי קינאז ABL, כגון גליבק, בטיפול בלוקמיה מיאלואידית הכרונית (CML) סיפקה את ההוכחה של מושג לגישה זו 6,7. תצפית זו מהפכה בנמלים לא רקi-kinase טיפול אלא גם נאכף הרעיון לזהות נגעים הגנטיים במחלות אחרות גידולים למיקוד טיפולי, שתובלנה לגילוי של מוטציות סרטניות בJAK2 מפוליציטמיה (PV) וחולים עם שאתות myeloproliferative (MPN). תגלית זו עוררה עניין רב בטיפול בMPNs על ידי מיקוד JAK2 במעכבי קינאז מולקולה קטן. עכשיו, כמעט תריסר של מעכבי JAK2 נמצאים בניסויים קליניים ואחד מהם אושר לאחרונה לטיפול במיילופיברוזיס ראשוני. בעוד מיקוד ספציפי של קינאזות שעור על ידי מעכבי מולקולה קטנים בסרטן להביא תוצאות מבטיחות, היא גם סובלת ממפתחים עמידים לטיפול. למעשה, עד כה, חולים שטופלו במעכבים קינאז, כגון גליבק, ארסתי, Erlotinib וdasatinib פיתחו מוטציות התנגדות בעיקר על ידי רכישת מוטציות בתחום קינאז שתרופה מיועדת ל8-10. התנגדות כתוצאה ממוטציה בגן מדגישה את המגבלות of ממוקדת טיפול יחיד נגד קינאז שהעור, ומייצגת את האתגר הבא בהתפתחות של סרטן כימותרפיה יותר ויותר מוצלחת. השלכות מכניסטית ופונקציונליות של עמידות לתרופות צריכות לספק רציונל לבחירה ועיצוב של תרכובות משלימות לפיתוח תרופות. מוטציות שזוהו באמצעות מסכי במבחנה, הראו רמה גבוהה של מתאם עם אלה שנמצאו בחולים. לכן, הקרנה במבחנה למוטציות המעניקות סמים התנגדות לזוגות יעד תרופה ניתנו באסיסטים פיתוח קליניים או פרה-קליניים בזיהוי דפוסי ההתנגדות שעלול לגרום להישנות קלינית. זיהוי של מוטציות אלה הוא לא רק מועיל בניטור החולים לתגובת סמים ולהרע, אלא גם חיונית לעיצוב של מעכבי הדור הבא חזקים יותר. לדוגמא, פיתוח של מעכבי BCR / ABL הדור הבא, Nilotinib וPonatinib, התאפשרו בגלל MEC יותרהבנות hanistic צברו מmutagenesis, מבני, ומחקרים תפקודיים.

מוקדם יותר, יש לנו דיווחו על התוצאות של המסך שלנו באמצעות mutagenesis של BCR / ABL האקראי כדי לחשוף את הספקטרום של מוטציות המקנות עמידות למעכבים כגון 11,12 גליבק, 12 PD166326, ו -13 AP24163. התוצאות לא רק זיהו את המוטציות המקנות הישנות התנגדות ומחלה קלינית, אלא גם סיפקו את הבנת מכניסטית של עמידות לתרופות ולעקרונות המסדירים את תפקוד kinase 11,14. כאן אנו מספקים פירוט מתודולוגיים נוסף, באמצעות Ruxolitinib וJAK2 כזוג יעד סמים, כדי לאפשר יישום רחב יותר של אסטרטגית הקרנה זו.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: כל הנהלים בפרוטוקול זה נערכו על פי המכון הלאומי לבריאות הנחיות לטיפול והטיפול האתיים בבעלי חיים, ועל-פי פרוטוקול שימוש בבעלי החיים אושר IACUC.

תחזוקת קו 1. תא

  1. תאי BAF3 תרבות במדיום RPMI-1640 בתוספת 10% בסרום שור עוברי ופניצילין / סטרפטומיצין (100 יחידות / מיליליטר ו 100 מיקרוגרם / מיליליטר) ובינוני תרבות בילה של תאי Wehi. לגדל תאי HEK293T בDMEM בתוספת 10% בסרום שור עוברי ופניצילין / סטרפטומיצין (100 יחידות / מיליליטר ו -100 מיקרוגרם / מיליליטר). שמור על תאים על 37 מעלות צלזיוס באווירת humidified המכילה 5% CO 2.

2. פלסמיד בנייה

  1. לשכפל את העכבר JAK2 ואיזופורם JAK2-V617F שבעור בpMSCV-פור-GW על ידי LR clonase באמצעות הליך שיבוט רקומבינציה סטנדרטי.
  2. לבניית וקטור הביטוי בלוציפראז (pMSCV-לוק-הדובדבן-GW) המשמש ב- viההדמיה vo, להגביר לוציפראז מוקטור pLVX-ט-ON על ידי PCR באמצעות פריימרים (לוק-SD / RP TTACAATTTGGACTTTCCG ולוק-SD / FP-CACCATGGAAGACGCCAAAAAC) ואחריו עם שיבוט בpENTR-SD-TOPO ליצור pENTR-לוק, המשמש להעביר את הגן בלוציפראז בוקטור retroviral, pMSCV-דובדבן-GW על ידי שיבוט תיווך רקומבינציה באמצעות clonase LR.

3. הכנת ספריית מוטציה אקראית, הקרנה וזיהוי המוטציות

3.1) אקראי mutagenesis

  1. באורך מלא שיבוט של סוג בר JAK2 ומוטצית V617F לתוך וקטור retroviral pMSCV-הפור-GW באמצעות טכנולוגיית שיבוט רקומבינציה מסחרית.
  2. השתמש 1 מיקרוגרם של ה- DNA פלסמיד JAK2-V617F להפוך, XL-1 אדום, E. תאי coli, שהוא פגום במנגנוני תיקון DNA ובכך מאפשר להם לשלב מוטציות אקראיות בעת השכפול. באופן ספציפי יותר, לערבב 50-100 ng של DNA (DNA של יותר מ -100 ng מקטין את יעילות שינוי) עם 100 μl של תאים מוסמכים בצינור פוליפרופילן טרום צונן וטופחו על קרח למשך 30 דקות, בעדינות מתערבלת כל 5 דקות. לכיסוי ספרייה טוב, להשתמש 05:56 צינורות של תאים מוסמכים.
    הערה: DNA של יותר מ -100 ng מקטינה את יעילות שינוי
  3. לטבול את הצינור באמבט מים ב 42 ° C להלם חום של 45 שניות ולדגור על קרח במשך 2 דקות. לאחר מכן, להוסיף 1 מיליליטר של מדיום SOC (tryptone 2.0%, 0.5% תמצית שמרים, 0.05% NaCl, 10 מ"מ MgCl2, 10 מ"מ MgSO4, ושל 0.4% D-גלוקוז). דגירה הצינור ב 37 מעלות צלזיוס בזמן רועד ב225-250 סל"ד 90 דקות.
  4. תאי פלייט מצינור אחד בארבעה 10 סנטימטרים צלחות LB-אגר המכילים 100 מיקרוגרם / מיליליטר אמפיצילין. דגירה הצלחות ל16-24 שעות על 37 מעלות צלזיוס.
  5. בעקבות מושבות גלויות, לאסוף אותם על ידי גירוד הצלחות עם מגרד צלחת סטרילית. תאי בריכה מכל DNA צלחת ופלסמיד המבודד באמצעות ערכת חילוץ פלסמיד מסחרית.
    הערה: בדרך כלל מושבות קטנות ולקחת 18-24 שעות כדי להיותגלוי כי אלה הם זני חיידקים הגדלים לאט. בשלב זה, להעריך את ההטרוגניות של מוטציות בספרייה על ידי עיכול הגבלה עם חותך תכוף כגון Sau3A1 או Taq1 או רצף.

3.2) ייצור Supernatants retroviral והתמרה

  1. יום אחד לפני transfection, צלחת 4 x 10 6 תאי 293T HEK על 100 מנות סנטימטר בDMEM המכילות 10% FCS, פניצילין / סטרפטומיצין וL-גלוטמין 2 מ"מ.
  2. למחרת, להחליף את המדיום וtransfect התאים עם ספריית pMSCV-JAK2-V617F mutagenized. לכל צלחת 10 סנטימטרים, לערבב 10 מיקרוגרם של ה- DNA (5 מיקרוגרם של ספריית פלסמיד ו5 מיקרוגרם של פלסמיד האריזה retroviral, pCLEco) עם 40 μl של FuGENE להיקף כולל של 400 μl באמצעות תקשורת DMEM חופשית בסרום. דגירה תמהיל DNA ושומנים בדם במשך 20 דקות בטמפרטורת חדר. לאחר 20 דקות להוסיף הטיפה המורכבת DNA שומנים בדם חכם על גבי תאי HEK293T.
  3. לאחר שש שעות, לשנות את תקשורת transfection wה- i תקשורת טרי ודגירת הצלחות במשך 48 שעות על 37 מעלות צלזיוס לייצור וירוס. לאחר 48 שעות של דגירה, לאסוף supernatants ויראלי המסונן דרך מסנן 0.45 מיקרומטר acrodisc.

3.3) בחירה של שיבוטים עמידים במבחנה

  1. למוטציות JAK2-V617F תרופה עמידות, transduce 100 מ'BAF3 תא עם של supernatants וירוס שיש כייל נגיף של 0.5-1 x10 6 100 מיליליטר. באופן ספציפי יותר, לערבב 10 8 תאים עם של supernatant וירוס 100 מיליליטר להיקף כולל של 300 מיליליטר באמצעות תקשורת RPMI, סרום המכיל 10% ו -24 מיקרוגרם / מיליליטר של polyberene (ריכוז סופי של ployberene הוא 8 מיקרוגרם / מיליליטר). להפיץ מערבלי תאים אלה במספר רב של שש צלחות היטב (4-5 מיליליטר לכל טוב).
  2. צנטריפוגה הצלחות ב 1,250 XG למשך 90 דקות ב -25 מעלות צלזיוס. לאחר צנטריפוגה, דגירה הצלחות על 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
  3. למחרת, בריכת התאים יחד ומערבבים עם Ruxolitinib ובינוני המכילים אגר רך ומצופה בsix צלחות גם. עבור כל ריכוז תרופה, לערבב 10 מיליליטר של תאי transduced BAF3 (10-20 מיליון תאים) עם הכמות המתאימה של Ruxolitinib בשפופרת 50 מיליליטר. מרכיבים את הנפח 40 מיליליטר באמצעות RPMI המכיל סרום 20%. הוסף 10 מיליליטר של אגר 1.2% לתאים, mixcarefully וצלחת בשש צלחות גם.
  4. דגירה הצלחות על 37 מעלות צלזיוס במשך שבועיים. פיק המושבות עמידות באמצעות טיפים פיפטה 0.2 מ"ל ותת-תרבותם בנפרד ב 24 צלחות גם במשך 3-4 ימים.
  5. קציר תאי BAF3 העמידים על ידי צנטריפוגה ב 450 XG במשך חמש דקות בטמפרטורת חדר. לבודד את הדנ"א הגנומי באמצעות ערכת בידוד הדנ"א הגנומי מסחרית. PCR להגביר אורך מלא JAK2 cDNA משל פריימרים הגנומי DNA באמצעות (mJAK2FP-ATGGCCTGCCTTACAATGACAG וmJAK2RP-GGTTCTGGAAGTCTGCTTGG) וארוכת תבנית להרחיב מערכות PCR איכות גבוהה 100 ng.
  6. הפרד את מוצרי ה- PCR על ידי ג'ל אלקטרופורזה agarose. בלו 3.4 kb של להקת DNA המייצג מסגרת קידוד JAK2 ולבודד את ה- DNAבאמצעות ערכת חילוץ ג'ל מסחרית. רצף באורך המלא של cDNA באמצעות 8 פריימרים פנימיים (P1 - P8) פורש רצף הקידוד ורצפים לנתח באמצעות תוכנה מסחרית.

4. במבחנת אישור של מוטציות עמידות

שיבוטים תא רבים לשאת מוטציה יותר מאחד, כדי לבדוק את תרומתו של כל מוטציה בפנוטיפ התנגדות, ליצור גרסאות שנבחרו על ידי מוטגנזה מכוונת באמצעות פלסמיד pMSCV-JAK2V-617F כתבנית.

  1. בצע mutagenesis האתר מכוון על פלסמיד pMSCV-JAK2-V617F באמצעות ערכת mutagenesis מסחרית וoligonucleotides נועד ליצור מוטציות נקודה. לאשר את זהותם של שיבוטים מוטציה על ידי רצף.
  2. Transduce תאי BAF3 עם רטרווירוסים נעשה באמצעות פלסמידים מוטציה אחריו עם בחירה באמצעות puromycin ב1μg / ml.
  3. צלחת 10 4 תאי BAF3-JAK2-V617F (50 μl של RPMI עם 10% FCS) לבאר כל צלחת גם 96. נפרדly להוסיף 50 μl של תקשורת ruxolitinib המכיל את הבארות על פני הצלחת (הריכוז הסופי: 0, 1, 3, 5, 10, ו -20 מיקרומטר), ודגירת הצלחות במשך 60 שעות על 37 מעלות צלזיוס.
  4. להעריך את כדאיויות תא על ידי הוספת 10 μl של מגיב WST-1 לכל ואחרי היטב עם דגירה על 37 מעלות צלזיוס במשך 2-4 שעות. שיא הספיגה ב A450 באמצעות קורא צלחת. לבצע את כל מבחני בשלושה עותקים ועלילה בממוצע ספיגה נגד INCB018424 ריכוזים. לבצע עקומת sigmoidal מיטבית באמצעות אלגוריתם הולם עקומה ליניארית. ציון ריכוז התרופה וכתוצאה מכך 50% כדאיות תא כIC50 הסלולרי.
  5. בשלב הבא, צלחת שישה מ'BAF3 תאים לבטא גרסאות JAK2 בשש צלחות גם במדיום RPMI המכיל סרום 10% עם עלייה בריכוזים של ruxolitinib וטופחו במשך 4-6 שעות על 37 מעלות צלזיוס.
  6. לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה ב 450 XG במשך חמש דקות ב 4 מעלות צלזיוס. לשטוף את התאים פעם אחת עם PBS, וlyse ב -20 מ"מ טריס-Cl (pH 7.5), 50mM NaCl, 1% NP-40, 0.1% SDS, 5 מ"מ EDTA, 1 המ"מ EGTA, 1 פלואוריד מ"מ נתרן, 2 מ"מ נתרן Vanadate, ו -5% גליצרול בתוספת מעכבי מעכבי פרוטאז קוקטייל וphosphatase. Sonicate ההשעיה תא 1 דקות ואחריו תוספת של חיץ טעינת ג'ל 5x (350 מ"מ טריס-HCl [pH 6.8], 500 מ"מ DTT, 15% SDS, 10 מ"מ Benzamidine, 5 מ"מ EDTA, 5 מ"מ EGTA, 5 מ"מ נתרן Vanadate , קוקטייל פרוטאז, 50% גליצרול, ו0.001% bromophenol כחול) וdenaturation על 70 מעלות צלזיוס למשך 5-10 דקות.
  7. לפתור את החלבונים על 8% ג'ל polyacrylamide SDS בתנאי denaturing. בצע immunoblotting עם STAT5 אנטי-phopsho חד שבטי עכבר. להפשיט את הכתמים וreprobed עם נוגדן אנטי SATA5 polyclonal ארנב. דמיינו את הלהקות באמצעות ריאגנטים ECL בהתאם להמלצתו של הספק.

5. בVivo אישור ב

  1. Transduce תאי BAF3 להביע לוציפראז ודובדבן (transduced עם רטרווירוסים עשויים pMSCV-לוק-cherר"י GW) עם וירוסים להביע JAK2-V617F וריאנטים עמידים. בחר תאים ששורדים בחירת puromycin לביטוי של JAK2 וריאנטים התנגדותה.
  2. הזרק שני מיליון תאים / דובדבן BAF3-לוק ומתרחבים ביצוע JAK2-V617F וריאנטים העמידים שלה ב -200 μl של PBS על 6 עכברי BALB / C באמצעות הזרקה לוריד זנב.
  3. אחרי שלושה ימים של השתלות תאים, להזריק עכברים עם Ruxolitinib (100 מ"ג / קילוגרם) פעמיים ביום במשך שבועיים.
  4. לבצע הדמיה פליטת אור מבוסס לוציפראז עם מערכת הדמיה. .
    1. בקיצור, להכין פתרון luciferin ידי המסת 300 מ"ג ל- 25 מיליליטר של מים סטריליים deionized, aliquot בנפח ובחנות קטנים יותר.
      הערה: luciferin החנות ב -80 ° C ולהגן מפני אור עד לשימוש.
    2. להזריק 250 μl לכל עכבר על ידי IP כדי להשיג 125 מ"ג / קילוגרם בכל עכבר. להרדים את העכברים מאותה קבוצה יחד באמצעות isoflurane בשאיפה (1.5% -2.0%) בקופסא אטומה. החל משחה וטרינר על העין אלקטרוני למניעת יובש.
      הערה: הזמן שלוקח לעכברים לישון (10-15 דקות) אפשרה פעילות luciferin לשיא. שמור את הזמן עקבי בין הקבוצות, כדי למנוע וריאציה.
  5. העבר את העכברים מייד לבמת חדר הדמיה ולשמור על הרדמה בisofluorane 1.5-2% במהלך הליכי הדמיה. עכברי תמונה עם חשיפת שניות רציפה 0.1, 0.5, 1, 5, 30, 60, ו -300. צלם תמונות ולכמת עוצמת פליטת אור באמצעות רכישת תמונה ותוכנת ניתוח. בעקבות הדמיה להחזיר את העכברים חזרה לכלוב שלה.
  6. ל, הכולל תאים bonemarrow in vivo קציר chimerism. להרדים את העכברים עם CO 2 דקות 5 אחריו עם נקע בצוואר הרחם. לקצור את העצמות ולמחוץ ב 4 מיליליטר PBS הקר כדי לאסוף את מח העצם. נתח את התאים חיוביים דובדבן אחוזים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי ולכמת באמצעות FACS. לאסוף עשרים אלף אירועים מכל מדגם.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הופעתה של מוטציות גנטיות מהווה אתגר גדול עבור הטיפול אנטי kinase הממוקד. מחקרי מוטאציות, מלבד מתן תובנות מכניסטית ופונקציונליות שהם סייעו בבחירה ועיצוב של פיתוח תרופות מהדור הבא, גם מאפשר ניהול קליני טוב יותר ועשויים בעתיד להיות מועיל יותר לטיפול מותאם אישית. בניסוי זה, אנו מציגים הקרנה למוטציות ruxolitinib התנגדות בkinase JAK2-V617F (איור 1). אנו נבנו וקטור pMSCV-JAK2-V617F-cherry.gateway על ידי החדרת העכבר באורך מלא JAK2-V617FcDNA לpMSCV-הדובדבן-GW. מומלץ להשתמש...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ההצלחה הקלינית של גליבק בטיפול CML הפגינה לא רק את הפוטנציאל של מיקוד קינאז האודם על ידי מעכבי מולקולה קטנים, אבל מגבלות גם חשפו טיפול ממוקד: חזרה קליני והופעה של מוטציות עמידות לתרופות בגן המטרה. זיהוי מוטציות התנגדות מסייע בניהול ופיתוח טובים יותר של מעכבי הדור הבא קליניים. פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה לזהות מוטציות עמידות לתרופות בגן הממוקד. שיטה זו משתמשת בספריית פלסמיד mutagenized באופן אקראי שנבנתה בE. coli, כדי לבטא את חלבוני המוטציה. הספרייה לאחר מכן הציגה בBAF3 תא...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לא הוכרז על ניגוד עניינים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נתמך על ידי מענקים ל-M.A. מ-NCI (1RO1CA155091), NHLBI (1R21HL114074) והקרן לחקר הלוקמיה. M.A. הוא זוכה פרס V-Scholar מקרן V-Foundation. המחברים מודים לד"ר שרה רוהרבאו על העריכה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
תרבית תאים ורקמות 
תאי BaF3ATCC
תאי HEK293TATCC
pMSCV-JAK2-V617F-puro.GWמתנה מרוס לוין
pMSCV-JAK2-V617F/Y931C. GWמיוצר בבית
pMSCV-JAK2-V617F/L983F. GWתוצרת בית
pMSCV-JAK2-V617F/P58A. GWתוצרת הבית
pMSCV-V617F-Cherry.GWתוצרת הבית
pMSCV-JAK2-V617F/Y931C-דובדבן.GWתוצרת הבית
pMSCV-JAK2-V617F/L983F-דובדבן.GWתוצרת הבית
pMSCV-Luciferase-puro.GWתוצרת הבית
RPMICellgro (קורנינג)15-040-CV
DMEMCellgro (קורנינג)15-013-CV
Penn/StrepCellgro (קורנינג)30-002-CI
FBSאטלנטה ביולוגיS11150
טריפסין EDTA 1XCellgro (קורנינג)25-052-CI
1X PBSCellgro (קורנינג)21-040-CV
L-גלוטמיןCellgro (קורנינג)25-005-CL
PuromycinGibco (טכנולוגיות חיים)A11138-03
פרוטמין סולפטSigmaP33695 מ"ג/מ"ל מלאי במים
תמיסת טריפאן כחול (0.4%)SigmaT8154
DMSOCellgro (קורנינג)25-950-CQC
INCB018424 (Ruxolitinib)ChemieTeK941678-49-5
WST-1Roche11644807001
מסנן דיסק 0.45 מיקרוןPALL2016-10
מסננת תאי ניילון 70 מיקרוןBecton Dickinson352350
תרבית
XL-1 אדום E. coli תאיםAgilent Tech200129
SOCNew England BiolabsB90920s
AmpicillinSigmaA0166100 מ"ג/מ"ל תמיסת מלאי 
Bacto agarDifco214050
מרק נהדרBecton Dickinson243820
AgaroseGenemateE-3119-500
ערכות
Dneasy Blood & רקמות ערכתQiagen69506
הרחב תבנית ארוכה מערכת PCRRoche1168134001
Wizard מערכת ניקוי ג'ל Sv ו-PCRPromegaA9282
הכנה מיני פלסמיד תשואה טהורהPromegaA1222
PCR עם טכנולוגיית Gateway עם pDONR 221 & OmniMAX 2 תאים מוכשריםInvitrogen12535029
Gateway  תערובת אנזים קלונאז LR ריאגנטים
Vivo-Glo Luciferin in-vivo GradePromegaP1043
1/2 סמ"ק Lo-Dose u-100 מזרק אינסולין 28 G1/2Becton Dickinson329461
60316 ו- 60317
איזופלורן (איזותזיה TM)באטלר שיין29405
מכשירים
חממת CO2 מסדרת NAPCO 8000 WJדלי
נדנדה 5810REppendorf
TC-10 מונה תאים אוטומטיBio-RADזה לא הכרחי, אפשר להשתמש בהמוציטומטר סטנדרטי לספירת תאים
חיידקים מערכת מערכת שיבוט לעכבר Invitrogen 11791019 Mortor pestle Coor tek  צנטריפוגת רוטור

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Huse, M., Kuriyan, J. The conformational plasticity of protein kinases. Cell. 109, 275-282 (2002).
  2. Melnikova, I., Golden, J. Targeting protein kinases. Nat Rev Drug Discov. 3, 993-994 (2004).
  3. Cohen, P. Protein kinases--the major drug targets of the twenty-first century. Nat Rev Drug Discov. 1, 309-315 (2002).
  4. Dancey, J., Sausville, E. A. Issues and progress with protein kinase inhibitors for cancer treatment. Nat Rev Drug Discov. 2, 296-313 (2003).
  5. Noble, M. E., Endicott, J. A., Johnson, L. N. Protein kinase inhibitors: insights into drug design from structure. Science. 303, 1800-1805 (2004).
  6. Druker, B. J., et al. Activity of a specific inhibitor of the BCR-ABL tyrosine kinase in the blast crisis of chronic myeloid leukemia and acute lymphoblastic leukemia with the Philadelphia chromosome. N Engl J Med. 344, 1038-1042 (2001).
  7. Druker, B. J., et al. Effects of a selective inhibitor of the Abl tyrosine kinase on the growth of Bcr-Abl positive cells. Nat Med. 2, 561-566 (1996).
  8. Gorre, M. E., et al. Clinical resistance to STI-571 cancer therapy caused by BCR-ABL gene mutation or amplification. Science. 293, 876-880 (2001).
  9. Shah, N. P., et al. Multiple BCR-ABL kinase domain mutations confer polyclonal resistance to the tyrosine kinase inhibitor imatinib (STI571) in chronic phase and blast crisis chronic myeloid leukemia. Cancer Cell. 2, 117-125 (2002).
  10. Branford, S., et al. High frequency of point mutations clustered within the adenosine triphosphate-binding region of BCR/ABL in patients with chronic myeloid leukemia or Ph-positive acute lymphoblastic leukemia who develop imatinib (STI571) resistance. Blood. 99, 3472-3475 (2002).
  11. Azam, M., Latek, R. R., Daley, G. Q. Mechanisms of autoinhibition and STI-571/imatinib resistance revealed by mutagenesis of BCR-ABL. Cell. 112, 831-843 (2003).
  12. Azam, M., et al. Activity of dual SRC-ABL inhibitors highlights the role of BCR/ABL kinase dynamics in drug resistance. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 9244-9249 (2006).
  13. Azam, M., et al. AP24163 inhibits the gatekeeper mutant of BCR-ABL and suppresses in vitro resistance. Chem Biol Drug Des. 75, 223-227 (2010).
  14. Azam, M., Seeliger, M. A., Gray, N. S., Kuriyan, J., Daley, G. Q. Activation of tyrosine kinases by mutation of the gatekeeper threonine. Nat Struct Mol Biol. 15, 1109-1118 (2008).
  15. Soverini, S., et al. Implications of BCR-ABL1 kinase domain-mediated resistance in chronic myeloid leukemia. Leukemia research. 38, 10-20 (2014).
  16. Deshpande, A., et al. Kinase domain mutations confer resistance to novel inhibitors targeting JAK2V617F in myeloproliferative neoplasms. Leukemia. 26, 708-715 (2012).
  17. Koppikar, P., et al. Heterodimeric JAK-STAT activation as a mechanism of persistence to JAK2 inhibitor therapy. Nature. 489, 155-159 (2012).
  18. Marit, M. R., et al. Random mutagenesis reveals residues of JAK2 critical in evading inhibition by a tyrosine kinase inhibitor. PLoS One. 7, 43437(2012).
  19. Weigert, O., et al. Genetic resistance to JAK2 enzymatic inhibitors is overcome by HSP90 inhibition. The Journal of experimental medicine. 209, 259-273 (2012).
  20. Kesarwani, M., Huber, E., Azam, M. Overcoming AC220 resistance of FLT3-ITD by SAR302503. Blood cancer journal. 3, 138(2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Drug Resistance MutationsKinase Inhibitor ScreeningRandom Mutation LibraryIn Vitro ScreeningSite Directed MutagenesisJAK2 V617FRuxolitinib ResistanceBAF3 CellsRetroviral VectorIC50 Validation

Related Articles