במבחנה מתילציה Assay ללמוד מתילציה ארגינין חלבון

סיכום

מתילציה ארגינין חלבון, מזורז על ידי כיתה של אנזימים דהינו., מתיל ארגינין חלבון transferases (PRMTs), הוא התהליך של בנוסף האנזימטית של קבוצה מתיל (ים) לarginines בתוך חלבונים. במבחנה assay מתילציה הוא הכלי האמין ביותר להערכת מצב מתילציה של מצעי PRMT ידועים או רומן.

תקציר

מתילציה ארגינין חלבון היא אחד מהשינויים שלאחר translational הנפוצים ביותר בגרעין. מתילציה ארגינין חלבון יכולה להיות מזוהה ו / או שנקבעה באמצעות גישות proteomic, ו / או immunoblotting עם נוגדנים ספציפיים מתיל-ארגינין. עם זאת, טכניקות אלה לפעמים יכולות להיות מטעות, ולעתים קרובות מספקות תוצאות חיוביות כוזבות. והכי חשוב, בטכניקות אלה אינם יכולים לספק ראיות ישירות לתמיכה בסגוליות מצע PRMT. במבחנה מבחני מתילציה, לעומת זאת, הם מבחני ביוכימיים שימושיים, שהם רגישים, ולחשוף באופן עקבי אם החלבונים שזוהו הם אכן מצעי PRMT. Assay מתילציה טיפוסי במבחנה כולל PRMTs מטוהר, פעיל, מצע מטוהר ותורם רדיואיזוטופים שכותרתו מתיל (S-adenosyl-L- [methyl- ³ H] מתיונין). כאן אנו מתארים פרוטוקול צעד אחר צעד כדי לבודד PRMT1 הפעילו כקטליזאטור, בן משפחת PRMT הביע כל מקום בגוף. שליפעילויות transferase thyl של PRMT1 המטוהר נבדקו מאוחר יותר על חלבון ראס-GTPase הפעלת חלבון מחייב 1 (G3BP1), מצע PRMT ידוע, בנוכחות S-adenosyl-L- [methyl- ³ H] מתיונין כתורם מתיל. פרוטוקול זה יכול להיות מועסק לא רק להקמת מעמד מתילציה של מצעי PRMT1 פיסיולוגיים רומן, אלא גם להבנת המנגנון הבסיסי של מתילציה ארגינין החלבון.

מבוא

מתילציה החלבון תוארה לראשונה בשנת 1968 ^1. זה לא היה עד השיבוט הראשון של PRMT1 ב -1996, כי חוקרים החלו להעריך את החשיבות של שינוי שלאחר translational זה ^2. מעניין, כ -2% משאריות ארגינין בחלבונים של תמציות גרעיניות מפוגלים ^3, המציינים את השפע של שינוי זה. ארגינין הוא חומצת אמינו טעונה חיובי עם צד שרשרת בסיסית והחנקן / s בתוך הרשתות בצד של ארגינין יכול להיות שלאחר translationally שונה באמצעות התוספת של קבוצה מתיל, תהליך המכונה מתילציה ארגינין ^4-6. מתילציה ארגינין היא מזורזת על ידי כיתה של אנזימים דהינו., transferases תיל ארגינין חלבון (PRMTs). יכול גם להיות monomethylated Arginines או dimethylated והאחרון יכול להיות או סימטרי או לא סימטרי, תלוי בסוג של PRMTs מזרזות התהליך ^4-6.

חלבונים המציגים argininמוטיבים עשירים דואר גליצין הם יעדים פוטנציאליים לקטליזה בתיווך PRMT. מתילציה בתיווך PRMT של מצעים הוכח לווסת אינטראקציה בין חלבונים, אינטראקציה חומצת חלבון גרעין, תפקוד חלבון, ביטוי גנים, ו / או איתות תאית, כל אלה הם הגורמים קריטיים להומאוסטזיס סלולארי רגיל ^7-9. על מנת להבין את התפקיד הביולוגי של מתילציה ארגינין חלבון, מבחני מדויקים, יעיל, לשחזור נדרשים לביסוס מעמדה מתילציה של מצעי PRMT המזוהים.

ב assay מתילציה מבחנה, המעריך את היכולות של PRMTs מטוהר לזרז מתילציה של מצעים שלהם, הוא assay מקובל היטב ללימוד מתילציה ארגינין ^10-12. ההצלחה הכוללת של assay זה תלוי במידה רבה על הפעילות של PRMTs המטוהר. ניתן לבטא PRMTs ומטוהר מחיידקים, או תאי יונקים ^10,11. assay זה במבחנה מתילציה, כמו דetailed בסעיף הפרוטוקול, מבוסס על שיטה המתוארת במקור על ידי Tini ועמיתים ^10. בפרוטוקול זה, אנו מראים בפירוט את השלבים כרוכים בביטוי והטיהור של PRMT1 בתאי יונקים. היכולת של PRMT1 המטוהר לזרז מתילציה בראס-GTPase הפעלת חלבון מחייב חלבון 1 (G3BP1), מצע PRMT ידוע ^8, מאוחר יותר העריכה בנוכחות מתיונין S-adenosyl-L- [methyl- ³ ח] כ תורם מתיל. שימוש assay זה, אנו יכולים באופן מהימן להגדיר את היכולות של PRMTs לרומן methylate או מצעים ידועים, שבו הוא צעד ראשוני במחקר של מתילציה ארגינין החלבון.

פרוטוקול

.1 הכנת בונת ביטוי

1. לפני שמתחיל את הפרוטוקול, PRMTs שיבוט לתוך וקטורי ביטוי יונקים עם תג N-מסוף epitope (Myc או HA), ואת המצע במסגרת עם גלוטתיון-S-transferase (GST) לביטוי ברמה הגבוהה של חלבון וטיהור מתא חיידק lysates, תוך שימוש בטכניקות ביולוגיות מולקולריות סטנדרטית.

.2 טיהור PRMTs

1. השתמש 100 תרבות מנות מ"מ כדי לשמור על תאים אנושיים אפיתל הסימפונות (Beas2B). מעבר התאים כל 3 ימים ולא נותן להם לגדול למפגש.
2. ביום שלפני transfection, זרע 7.5 x 10 ⁵ תאים במדיום תרבות 10 מ"ל בצלחת תרבות 100 מ"מ. מערבולת כדי לפזר באופן שווה את התאים, ולדגור על 37 מעלות צלזיוס בCO ₂ באינקובטור humidified 5%.
3. למחרת, לשאוב את התקשורת ולהוסיף 5 מ"ל של תקשורת בתרבות ללא סרום ואנטיביוטיקה. מערבולת ולשאוב את המדיום. חזור על פעולה זו אחתיותר זמן, ולבסוף מוסיף 5 מ"ל של סרום / בינוני אנטיביוטיקה ללא ולהמשיך transfection.
4. לדלל 6 מיקרוגרם של פלסמיד דנ"א לתוך 750 μl של מדיום סרום ללא בצינור צנטריפוגות פלסטיק 1.5 מ"ל סטרילי.
5. בעוד צינור צנטריפוגות פלסטיק 1.5 מ"ל, לדלל 30 μl של מגיב transfection ל750 μl של מדיום חופשי בסרום.
6. מעבירים את הפתרון בדילול מלא מגיב transfection (שלב 2.5) לצינור המכיל DNA בדילול מלא (שלב 2.4). מערבבים בעדינות על ידי pipetting מעלה ומטה מספר פעמים.
7. דגירה את תערובת transfection בטמפרטורת חדר במשך 15 דקות.
8. לאחר 15 דקות, פיפטה תערובת transfection בעדינות על גבי התאים, מערבולת לערבב באופן שווה, ולדגור על 37 מעלות צלזיוס בCO ₂ באינקובטור humidified 5%.
9. אחרי 3 שעות, לשאוב את המדיום המכיל תערובות transfection מהתאים. הוסף בינוני תרבית תאים טריות בתוספת סרום ואנטיביוטיקה.
10. דגירה על 37 מעלות צלזיוס ב5% CO ₂ humidifiedחממה ל48 שעות.
11. לאחר 48 שעה, lyse התאים ב 1 מ"ל של חיץ תמוגה (שנאגרו מלוח 1x פוספט, 1% P-40, 0.5% deoxycholate נתרן, 0.1% סולפט dodecyl נתרן Nonidet, ו1 מיקרוגרם / מ"ל ​​phenlymethyl sulphonyl פלואוריד). לאסוף lysates לתוך צינור צנטריפוגות פלסטיק עם מרים תא דגירה lysates על קרח למשך 30 דקות.
12. צנטריפוגה lysates ב15,000 XG 10 דקות בצנטריפוגה ספסל העליונה כדי לנקות את lysates מפסולת תא. [* מומלץ מאוד כדי לאשר את הביטוי של HA-PRMT1 באמצעות immunoblotting של aliquot של lysates עם אנטי HA נוגדנים, לפני שתמשיך לטיהור של האנזימים עבור assay מתילציה.]
13. לטיהור של PRMTs, דגירה 3 מ"ג של lysates תא עם 30 μl של 50:50 השעיה של אנטי HA מטריצת זיקה שבנאגרה מלוח פוספט (PBS), ולסובב את הלילה ב 4 מעלות צלזיוס במסובבי צינור.
14. למחרת, לסובב את הצינורות ב 14,000 XG בצנטריפוגה ספסל העליון למשך 2 דקות כדי לאסוףחרוזים. בטל supernatant ולשטוף את החרוזים 3x עם 1 מ"ל של Ripa חיץ [20 מ"מ טריס (pH 8.0), 150 mM NaCl, 5 מ"מ EDTA ו1% Triton-X-100] בכל שטיפה אחריו צנטריפוגה ב 14,000 XG עבור 2 דקות. לאחר לשטוף השלישי, לשטוף את החרוזים פעם אחת עם של חיץ מתילציה 100 μl (50 מ"מ טריס pH 8.5, 20 מ"מ KCl, 10 מ"מ MgCl _2, 1 מ"מ β-mercaptoethanol, 100 סוכרוז מ"מ). לאחר צנטריפוגה, להסיר את supernatant. חרוזים המכילים את PRMTs המשותק מוכנים לשימוש assay מתילציה. [* מומלץ מאוד להשתמש PRMTs המשותק באופן מיידי בassay מתילציה.]

.3 טיהור של מצע

1. לחסן מושבה אחת של GST-G3BP1 הפכה BL21 לתוך 5 מ"ל של מדיום לוריא-Bertani (LB) מכיל 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​אמפיצילין. לגדול תרבויות לילה על 37 מעלות צלזיוס עם רעד ב250 סל"ד.
2. למחרת, להעביר את תרבות הלילה ל50 מ"ל של מדיום LB טרי והמשךinue לגדול ל OD ₆₀₀ של 0.5-0.7 (זה לוקח בערך 2 שעות).
3. כאשר OD ₆₀₀ מגיע 0.5-0.7, להוסיף איזופרופיל-β-D-thiogalactoside (IPTG) לריכוז סופי של 1 מ"מ ולהמשיך לתרבות ל4 שעות נוספות על 37 מעלות צלזיוס עם רעד ב250 סל"ד.
4. לקצור את התאים על ידי צנטריפוגה ב1,500 XG עבור 10 דקות, ולעבד את גלולה לטיהור GST או בחנות ב -80 מעלות צלזיוס.
5. להשעות Re גלולה חיידקים ב5 מ"ל של חיץ תמוגה (1x PBS עם מעכבי פרוטאז, 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​של ליזוזים, ו0.1% Triton-X-100) ו דגירה lysates ב37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. בשלב זה lysates יופיע עכור וצמיג עקב השחרור של הדנ"א הגנומי חיידקים.
6. גזירה הדנ"א הגנומי ידי sonication (10 פעימות של 1 שניות כל אחד עם משרעת של 30%).
7. נקה את lysates על ידי צנטריפוגה ב15,000 XG 10 דקות ולהעביר את supernatant ברור לצינור 15 מ"ל. אם supernatant לא ברור לחזור על centrifuתהליך gation עוד פעם אחת.
8. בינתיים, לשטוף את חרוזי GST-sepharose פעמיים עם PBS הקר כקרח ולהפוך את ההשעיה 50:50 של GST-sepharose בPBS. הוסף 200 μl של ההשעיה GST-sepharose לlysate תא החיידק פינה ולסובב על 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
9. אחרי שעה 1, צנטריפוגה הצינורות ב XG 500 במשך 3 דקות כדי לאסוף את חרוזים. שטוף את החרוזים 3x עם קרח הקר PBS.
10. לאחר לשטוף הסופי, resuspend את החרוזים של חיץ elution (50 מ"מ טריס pH 8.0, 150 mM NaCl, גלוטתיון 30 מ"מ) 100 μl ולסובב על 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
11. צנטריפוגה הצינורות ב 15,000 XG למשך 2 דקות ולהעביר את supernatant המכיל חלבון המטוהר לעוד צינור צנטריפוגות פלסטיק. לבצע אלקטרופורזה SDS ג'ל polyacrylamide (SDS-PAGE) ניתוח על 5 μl של החלבון המטוהר יחד עם סכומים ידועים של אלבומין בסרום שור (BSA) להעריך את הריכוז של החלבון המטוהר.

.4 מתילציה Assay

הערה: בצע את השלבים הבאים באזור נפרד המיועד לעבודת רדיואיזוטופים ובהתאם לפרוטוקולים של המוסד בביצוע ניסויים עם איזוטופים רדיואקטיביים.

1. הוסף 2 מיקרוגרם של GST-מצע מטוהר ותערובת אב המכילה מאגר מתילציה 1x (50 מ"מ טריס pH 8.5, 20 מ"מ KCl, 10 מ"מ MgCl _2, 1 מ"מ β-mercaptoethanol, סוכרוז 100 מ"מ), 1 μCi של S-adenosyl- L- [methyl- ³ H] מתיונין, ומים לנפח סופי של 10 μl לPRMTs המשותק (שלב 2.13) ו דגירה התגובה ב30 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
2. אחרי שעה 1, לעצור את התגובה על ידי הוספת 10 μl של חיץ מדגם 2x SDS. לאחר denaturation של הדגימות על 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, להפריד את הדגימות על ג'ל SDS-PAGE.
3. מאוחר יותר, להעביר את החלבונים הופרדו מג'ל SDS על קרום nitrocellulose באמצעות העברת electrophoretic חצי יבשה.
4. לאחר ההעברה, לכסות עם הקרוםutofluor (מגבר תמונת autoradiographic), ובעדינות רוק עבור 2 שעות בטמפרטורת חדר. , לאחר 2 שעות לשפוך את autofluor ולשמור לשימוש מאוחר יותר. [* תווית הצינור כחומר רדיואקטיבי]
5. אוויר במהירות לייבש את הקרום על נייר סינון, לאטום אותו בשקית ניילון ולחשוף את הקרום לסרט X-ray ב -20 מעלות צלזיוס. זמן חשיפה מספיק נע בין 5-30 ימים.

.5 אישור ביטוי PRMT וטוען שווים של מצע

1. לאחר שהשיג חשיפות מספיק, להעביר את הקרום לקופסא פלסטיק המכילה חיץ חסימה [שנאגר מלוח טריס עם 20-Tween (TBST + חלב 3% דלי שומן)] ועדינות רוק עבור שעה 1.
2. מחק את חיץ החסימה כפסולת רדיואקטיבית. דגירה הממברנה עם אנטי HA נוגדן (1: 1,000 דילול) בTBST הלילה בשעה 4 מעלות צלזיוס, עם נדנדה עדינה.
3. לשטוף את הממברנה עם 3x TBST דגירה הממברנה עם נוגדן המשני אנטי עכבר שכותרת HRP(1: 5,000 דילול) בTBST בטמפרטורת חדר למשך שעה 1 עם נדנדה עדינה.
4. אחרי שעה 1, לשטוף את הממברנה עם 3x TBST, ולבצע זיהוי chemiluminiscence של חלבונים עם מצע HRP.
5. לאחר זיהוי של PRMTs מתויג-HA, דגירה הקרום עם פתרון מכתים Ponseau-S למשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. מהר לשטוף 3x הקרום במים כדי לאתר את מצעים מתויג GST. סרוק את התמונה.

תוצאות

היכולות של HA-PRMT1 לmethylate GST-G3BP1 נקבעו על ידי במבחנה assay מתילציה. PRMT1 מתויג-HA מטוהר מlysates תא Beas2B הועסק בתגובת מתילציה המכילה GST-G3BP1, ו1 μCi של S-adenosyl-L- מתיונין [methyl- ³ H], כתורם מתיל. PRMT1 יכול ביעילות לזרז מתילציה של GST-G3BP1 (איור 1, פנל עליון). תגובות מתילציה באמצעות משיכה ומורדות שבוצעו על lysates של תאי Beas2B transfected וקטור ריק שימשו כביקורת שלילית (איור 1, פנל עליון, מסלול 1). Imm...

דיון

הפרוטוקול המתואר במסמך זה משמש באופן שגרתי לביסוס מעמדה מתילציה של מצעי PRMT המזוהים. assay חזק, ועולה בקנה אחד זה יהיה גם לספק ראיות מוחלטות על הספציפיות של PRMTs למצעים שלהם. רכיבי מפתח להצלחה של assay זה הם: .1 ביטוי של PRMTs בתאי יונקים, 2 פעילות של PRMTs המטוהר, 3 ביטוי וטיהור של מצע, ו.4 העברה מערבית מלאה של חלבוני קרום nitrocellulose.

PRMTs רקומביננטי הביע, וגם מטוהרים מחיידקים יכולים לשמש בתגובות מתילציה ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
S-אדנוזיל-L-[מתיל-3H] מתיונין	פרקין אלמר
Ecoscint ultra	National Diagnostics	LS-270
מתקן עליון לבקבוקים	National Diagnostics	LS-900
AutoFluor	National Diagnostics	LS-315
6 מ"ל בקבוקוני נצנוץ	National Diagnostics מק	"ט:SVC-06
GST-sepharose	GE Life Sciences
L-גלוטתיון מופחת	Sigma	G4251
Lipofectamine	Invitrogen		Transfection Reagent
Beas2B	ATCC
Optimem	Invitrogen
NP-40	US-Biologicals
SDS	Sigma
נתרן דאוקסיכולאט	Sigma
PMSF	Sigma
מטריצת זיקה נגד HA	Roche
Tris	Sigma
Nacl	Sigma
Bio-rad ג'ל דוק	Bio Rad
נוגדן נגד HA	Roche
Ponseau S	Fisher Scientific