הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

בידוד וההעשרה של אדם שומן המופק מתאי סטרומה לOsteogenesis משופר

11.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/52181

⸱

12 בינואר 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Hagey Laboratory for Pediatric Regenerative Medicine, Department of Surgery, Division of Plastic and Reconstructive Surgery, Stanford University School of Medicine, 2Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Stanford University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

ניתן להגדיר את הטרוגניות השעתוק בתוך תאי סטרומה שמקורם בשומן אנושי ברמת התא הבודד באמצעות סמני פני התא וגנים אוסטאוגניים. אנו מתארים פרוטוקול המשתמש בזרימה ציטומטרית לבידוד תת-אוכלוסיות תאים עם פוטנציאל אוסטאוגני מוגבר, אשר עשוי לשמש לשיפור שחזור השלד הגולגולתי.

תקציר

תאי סטרומה מזנכימליים שמקורם במח העצם (BM-MSCs) נחשבים לתקן הזהב ליישומי הנדסת רקמות מבוססי תאי גזע. עם זאת, התהליך שבו יש לקצור אותם יכול להיות קשור לתחלואה משמעותית באתר התורם. לעומת זאת, תאי סטרומה שמקורם בשומן (ASCs) נמצאים בשפע בקלות רבה יותר ונקצרים בקלות רבה יותר, מה שהופך אותם לחלופה אטרקטיבית ל-BM-MSCs. בדומה ל-BM-MSCs, ASCs יכולים להתמיין לתאי שושלת אוסטאוגניים וניתן להשתמש בהם ביישומי הנדסת רקמות, כגון זריעה על פיגומים לשימוש בפגמים בשלד הגולגולת. ASCs מתקבלים משבר כלי הדם הסטרומלי (SVF) של רקמת השומן המעוכלת, שהיא תערובת הטרוגנית של ASCs, תאי אנדותל כלי דם ומורל, תאי שריר חלק, פריציטים, פיברובלסטים ותאים במחזור הדם. ניתוח ציטומטרי זרימה הראה שפרופיל סמן פני השטח עבור ASCs דומה לזה של BM-MSCs. למרות מספר דיווחים שפורסמו הקובעים סמנים לפנוטיפ ASC, עדיין אין הסכמה לגבי פרופילים המזהים תאים אוסטאופרוגניטורים באוכלוסייה הטרוגנית זו. פרוטוקול זה מתאר כיצד לבודד ולהשתמש בתת-אוכלוסייה של ASCs עם יכולת אוסטאוגנית משופרת לתיקון פגמים קלוריאליים בגודל קריטי.

מבוא

האופי ההטרוגני של אוכלוסיות תאי גזע עדיין לא מובן במלואו ונותר מכשול מרכזי לפיתוח יישומים טיפוליים יעילים קלינית מבוססי תאי גזע. אחת הדרכים הנפוצות ביותר לאפיין אוכלוסייה הטרוגנית של תאי גזע היא להשתמש בשיטת מיון תאים, כגון מיון תאים מופעל פלואורסצנטי (FACS), כדי להפריד תאים על סמך פרופילי ביטוי סמני פני השטח שלהם. ככל ששיטות המיון הופכות מורכבות יותר, ניתן לזהות תת-אוכלוסיות תפקודיות מובהקות יותר של תאים. טכנולוגיות מבוססות מיקרופלואידיקה הופכות בשימוש תכוף יותר ויותר בניתוח ביטוי גנים ברמת התא הבודד. תגובת שרשרת פולימראז כמותית מרובה (qPCR) בתוך שבב מיקרופלואידי מאפשרת ניתוח יעיל ואמין ברזולוציה גבוהה, שעתוק של תא בודד. 1-5

במחקר קודם שהשתמש בפרופיל שעתוק של תא בודד של 48 גנים, נצפתה הטרוגניות שעתוק ניכרת בקרב ASCs. 6 עם זאת, התפלגות הגנים MSX2, BMP-5, BMP-7, ALP, OCN, RUNX2 הראתה קשר חזק עם מקבץ תאים בעלי פרופילי שעתוק אוסטאוגניים גבוהים. כדי לבודד תאים על פי פרופיל ביטוי גנים אוסטאוגני זה, דפוסי ביטוי אנטיגן פני השטח היו בקורלציה עם דפוסי שעתוק וביטוי סמני פני השטח של אנדוגלין (CD105) התגלה לאחר מכן כמתאם הדוק עם פוטנציאל התמיינות אוסטאוגני משופר של ASCs. ללא תלות בביטוי CD105, ביטוי של קולטן פני השטח Thy-1 (CD90), חלבון ממברנה המקושר לגליקוזיל-פוספטידילינוזיטול שהוכח בעבר על ידי Chen et al. כקשור לתאי אוסטאופרוגניטור, נמצא בקורלציה גם עם ביטוי גנים אוסטאוגניים. 6,7 ממצאים אלה מספקים הזדמנות לבודד באופן פרוספקטיבי תת-אוכלוסיות בתוך המאגר ההטרוגני הגדול יותר של ASCs עם יכולת אוסטאוגנית מוגברת ליישומי הנדסת רקמת עצם מבוססי תאים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הערה: כל דגימות המטופל התקבלו עם הסכמה מדעת, ופרוטוקולי ניסוי היו נבדקו ואושרו על ידי אוניברסיטת סטנפורד Institutional Review Board (פרוטוקול # 2,188 ו# 9999).

1. בידוד תא ותרבות:

  1. רקמת שומן תת-עורי לקבל אדם ממטופלות בריאה עוברות lipoaspiration בחירה של הבטן, אגף, ו / או באזור הירך בהרדמה הכללית מקומית /. ודא שInstitutional Review Board אישור (IRB) אושר על הפרוטוקול של בידוד ASCs מרקמות אנושיות, ופעל אמצעי בטיחות מוסדי בעת שעבד עם חומרים כאלה.
  2. כדי להשיג את SVF מרקמת שומן lipoaspirated, לשטוף ראשון lipoaspirate שלוש פעמים עם כמויות שווים של פוספט שנאגרו מלוח סטרילית 1x (PBS). בזהירות לשאוב וזורקים את השכבה המימית התחתונה.
  3. הכן את חיץ עיכול collagenase: סוג 0.075% אני Collagenase בהאנק שלפתרון מאוזן מלח (HBSS). הכן חיץ FACS: 2% FBS, P188 1% לבין 1% פן-דלקת בPBS. סנן פתרונות הן באמצעות מסנן זמין מסחרי 0.22 מיקרומטר גודל נקבובית זרימה מהירה polyethersulfone.
  4. לעכל את רקמת השומן נשטפה, להוסיף נפח שווה של חיץ עיכול collagenase ולמקם את כלי עיכול באופן מאובטח באמבט מים רועד במשך 60 דקות ב 37 ° C (כ 180 שייקים / min).
    הערה: עדיף להשתמש בכלי עיכול נפח גדול יותר מהנדרש, כמו זו מאפשרת לעיכול מקסימאלי במהלך רועד (כלומר, 250 מיליליטר של חיץ עיכול collagenase, 250 מיליליטר של רקמת שומן נשטפה בבקבוק 1 ליטר סטרילי).
  5. לנטרל פעילות האנזימטית על ידי הוספת נפח שווה של חיץ FACS ומאפשר לשבת על RT במשך 5 דקות. בשלב הבא, צנטריפוגות ב 233 XG במשך 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
  6. בזהירות לשאוב וזורקים supernatant, נזהרים שלא להפריע את כדור SVF בצפיפות הגבוהה.
  7. Resuspend גלולה ב5-10 מיליליטר של אדום RTתא תמוגה חיץ, המבוסס על גודל גלולה. השאר פתרון לשבת בRT עבור 5 דקות ו צנטריפוגות ב 233 XG במשך 5 דקות בRT.
  8. לשאוב supernatant ו resuspend גלולה ידי הוספת 5-10 מיליליטר של תקשורת צמיחה המסורתית, המבוססים על גודל גלולה (הנשר בינוני השתנה Dulbecco [DMEM] / 10% FBS / 1% [עט-סטרפטוקוקוס] פניצילין, סטרפטומיצין פתרון).
  9. סנן את ההשעיה באמצעות מסננת תא ניילון 100 מיקרומטר להסיר פסולת הסלולר.
  10. צנטריפוגה ב233 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C, וזורקים supernatant מבלי לשבש את גלולה.
  11. Resuspend גלולה ב5-10 מיליליטר של תקשורת צמיחה המסורתית, המבוסס על גודל גלולה.
  12. מקום 2 x 10 6 תאים בצלחת תרבות 15 סנטימטר סטנדרטית ולהקים תרבויות עיקריות O / N ב 37 מעלות צלזיוס / 21% O 2, 5% CO 2. לשמור ברמות תת-ומחוברות למניעת התמיינות ספונטנית על 37 מעלות צלזיוס / 21% O 2, 5% CO 2 בתקשורת צמיחה.
    צפיפות תאים באופן מלא: הערהצלחת 15 סנטימטר ומחוברות היא כ 4-6 x 10 6 תאים.

2. מכתים

  1. ASCs תרבות במדיום גידול מסורתי על 37 מעלות צלזיוס O / 21% 2, 5% CO 2, 36 שעות לפני מכתים / מיון.
  2. ASCs Lift מצלחות התרבות באמצעות Accutase (לפי הפרוטוקול של היצרן).
  3. לשטוף את תאי פעם עם חיץ FACS (PBS עם FBS 2% לבין 1% עט-סטרפטוקוקוס).
  4. צנטריפוגה ב233 XG במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
  5. בטל supernatant מבלי לשבש את גלולה. Resuspend התאים 0.5-1 מיליליטר של חיץ FACS (תלוי במספר תאים וכמות הנוגדנים הרצויים).
    הערה: הנפח של ההשעיה התא, בהתאם להמלצות יצרן נוגדני FACS, קובעת ריכוז נוגדן. עם זאת, טיטרציה של ריכוז נוגדנים, באמצעות ריכוז התחלתי של 1: 100, בדרך כלל מומלץ אם זה בפעם הראשונה להשתמש נוגדן.
  6. לספור את המספר הכולל שלתאים באמצעות hemocytometer.
  7. שמורת 100 aliquots ul בצינורות 1.5 מיליליטר צנטריפוגות כדי לשמש למדגם בלא כתם ובקרות חד-צבע (לפי מספר נוגדני ניאון בשימוש).
  8. הוסף את הנוגדנים חד-שבטיים fluorescently שהכותרת המתאימים (בריכוזים שנקבעו מראש, לפי הוראות יצרן) ו דגירה של 20-30 דקות על קרח, מוגן מפני אור.
    1. לתייג תת-אוכלוסיית osteogenic: לדלל אנטי CD90 (CD90 APC אנטי-אנושי (Thy1)) או אנטי-CD105 (FITC אנטי אנושי CD105 (endoglin)) במאגר FACS לריכוז של 1:50.
    2. לתייג אוכלוסיות תאים אחרות (לדוגמא, hematopoietic ותאי האנדותל): לדלל אנטי CD45 (Anti-האדם CD45 Pacific Blue), אנטי-CD34 (Anti-אדם CD34 APC), ו / או אנטי-CD31 (Anti-האדם CD31 PE ) בFACS חיץ לריכוז של 1:50.
    3. אם לא באמצעות נוגדנים מצומדות ישירות, להשתמש נוגדן ראשוני biotinylated עם שנייה streptavidin מצומדות- מתאימהנוגדן האר"י, כגון streptavidin PE-Cy7, בדילול של 1: 100.
  9. לאחר דגירה, לשטוף את התאים פעמיים: למלא צינורות עם חיץ FACS ו צנטריפוגות ב 233 XG במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס, aspirating supernatant.
  10. Resuspend התאים 400-500 דגימות μl FACS חיץ ומסנן דרך מסננת תא ניילון 70 מיקרומטר להסיר גושי תא.
  11. העבר את התאים שכותרתו לתוך צינורות FACS עם ראש המסנן ולשמור על דגימות קרח למשך ניתוח.

3. מיון תא הקרינה המופעל

הערה: השלבים הבאים מחייבים ידע קודם בתא הקרינה המופעל מיון (FACS) או סיוע של טכנאי מיומן.

  1. שימוש בתוכנת FACS המתאים, מגרשי ניתוח העיצוב לבחון פיזור קדימה (FSC), פיזור צד (SSC), Phycoerythrin (PE) -טקסס אדום, פסיפיק הכחול, והעמסת isothiocyanate (FITC), Allophycocyanin (APC) וכל שימוש אחר fluorophoreד לתייג תאים.
  2. לפני הטעינה לסדרן התא, בקצרה מערבולת מדגם זה לresuspend התאים.
  3. להתחיל עם ניתוח של המדגם בלא כתם כדי להגדיר שערים לכלל אוכלוסיית התא, להוציא פסולת הסלולר, ולקבוע autofluorescence תחילת המחקר.
  4. להוסיף יודיד propidium (PI) למדגם בלא כתם ולנתח אותו כדי להמחיש את האוכלוסייה של תאי חיים בתוך כלל אוכלוסיית התא. לבנות שער סביב אוכלוסייה זו.
  5. ניתוח מדגם שליטה יחיד צבע עבור כל fluorochrome כדי להגדיר פיצוי הקרינה.
  6. לנתח את המדגם המוכתם כדי לקבוע את המיקום של שערים למיון.
  7. להוסיף PI למדגם המוכתם כדי להכתים תאים מתים.
  8. למיין את אוכלוסיות תאים שכותרתו. מיין לתוך או 1.5 מיליליטר צינורות צנטריפוגה או צינורות חרוטי (15 מיליליטר) המכילים מדיום התרבות.
  9. באופן ידני להפסיק מיון פעם אחת הכמות הנדרשת של תאים הושגה.
  10. שלנוing FACS, לבצע בדיקת טוהר על ידי ניתוח חלק קטן (למשל., 500 תאים) של אוכלוסיית התא שנרכשה.
    הערה: שלב זה מאשר את טוהר של אוכלוסיות תאים הממוינים. באופן אידיאלי, טוהר צריך להיות גדול מ 90-95%.
  11. תאי צנטריפוגה ב233 XG במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס מייד לאחר השלמת מיון וגלול ב 1 מיליליטר של מדיום טרי המכיל 10% FBS.
    הערה: הסכום של תקשורת המשמשת עשוי להיות מוגבר המבוסס על גודלו של התא גלולה.
  12. צלחת על צלחות מצופים ג'לטין כדי לשפר את כדאיות תא. בהתאם לתשואה סופית תא, צלחת 300,000 תאים לכל גם בצלחת 6-היטב, 100,000 תאים לכל גם בצלחת 12 גם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

באמצעות CD90 כסמן לתאים עם תוצאות משופרות Osteogenesis בבידוד של אוכלוסיות מועשרות של ASCs האנושי (איור 1 א, 1 ב '). ASCs הוכתמו CD45 פסיפיק בלו-מצומדות אנטי-אנושי, CD105 אנטי אנושי FITC מצומדות-, וCD90 אנטי אנושי APC-מצומדות. לאחר המיון, רמת טוהר הייתה גדול יותר מ- 98%, כפי שלכמת ידי ניתוח שלאחר-מין.

הגדרת קבוצות של תאים המבוססים על פרופילי תעתיק אפשרו לבידוד פוטנציאלי של שתי תת-אוכלוסיות רומן. ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

נכון לעכשיו, את בידודה של תת-אוכלוסיות הומוגניות של ASCs מSVF של רקמת שומן אנושית נותר מאתגר אף מטרה רצויה. בידוד של אוכלוסיות ASC פרו-osteogenic במיוחד רצוי, כפי שניתן להשתמש בם תאים כאלה כדי ללמוד את ההיווצרות והומאוסטזיס של רקמות שלד. עם זאת, SVF של רקמת שומן נמלי הטרוגניות משמעותית בכל קשור לגזע קיבולת תא ופוטנציאל התמיינות. 11 הבסיס המולקולרי להטרוגניות זו לא ניתן להבין מאוכלוסיות משולבות של תאים, ובמקום זאת דורש ניתוח תא בודד. 12 עם גישה זו, סמני משטח ק...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

אף אחד מהמחברים שיש לו אינטרס כלכלי בכל אחד מהמוצרים, המכשירים, או התרופות שהוזכרו בכתב היד הזה. אף אחד מהמחברים לי שום אינטרס כלכלי מתחרה לדווח.

תודות

מחקר זה נתמך על ידי המכון הלאומי לבריאות מחקר המענק R01-DE021683-01 והמכונים הלאומי לבריאות מחקר מענק R01-DE019434 לMTL; מכון הרפואי הווארד יוז מחקר מלגה לMTCDCW נתמכה על ידי ACS פרנקלין מרטין הפקולטה למחקר המלגה, המעבדה Hagey לילדי רפואת רגנרטיבית, והפקולטה Scholar פרס אוניברסיטת סטנפורד מכון מחקר לבריאות הילד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
חד פעמי 250 מ"ל צינורות חרוטייםקורנינג (תומאס סיינטיפיק)2602A43
פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 יח'/מ"ל)Gibco15140-122
DMEM, גלוקוז גבוה, תוסף GlutaMAXGibco10566-016
PBS, pH 7.4Gibco10010-023
Betadine - תמיסת פובידון/יוד אנטיספטיתPurdue PFC-67618015017
תמיסת המלח המאוזנת של האנק, 1XCellgro21-023-CV
סרום בקר עוברי, מאושר, ממקור ארה"בGibco16000-044
קולגנאז מ-  Clostridium histolyticumSigma-AldrichC0130-5G
ACCUTASE תמיסת ניתוק תאיםטכנולוגיות תאי גזע7920
APC עכבר אנטי אנושי CD90BD Pharmingen559869
FITC עכבר אנטי אנושי CD105 (אנדוגלין)BD Pharmingen561443
אנטי אנושי CD45 eFluor 450 (תחליף כחול פסיפי) eBioscience48-9459-41
אנטי אנושי CD34 APCeBioscience17-0349-41
אנטי אנושי CD31 (PECAM-1) PEeBioscience12-0319-41
Streptavidin PE-Cy7eBioscience25-4317-82
BD FACS Aria II instrumentBD Biosciences
BD FACSDiva SoftwareBD Biosciences

מקורות

  1. Narsinh, K. H., et al. Single cell transcriptional profiling reveals heterogeneity of human induced pluripotent stem cells. J Clin Invest. 121, 1217-1221 (2011).
  2. Thorsen, T., Maerkl, S. J., Quake, S. R. Microfluidic large-scale integration. Science. 298, 580-584 (2002).
  3. Warren, L., Bryder, D., Weissman, I. L., Quake, S. R. Transcription factor profiling in individual hematopoietic progenitors by digital RT-PCR. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 17807-17812 (2006).
  4. Warren, L. A., et al. Transcriptional instability is not a universal attribute of aging. Aging Cell. 6, 775-782 (2007).
  5. Aalami, O. O., et al. Applications of a mouse model of calvarial healing: differences in regenerative abilities of juveniles and adults. Plast Reconstr Surg. 114, 713-720 (2004).
  6. Levi, B., et al. CD105 protein depletion enhances human adipose-derived stromal cell osteogenesis through reduction of transforming growth factor beta1 (TGF-beta1) signaling. The Journal of biological chemistry. 286, 39497-39509 (2011).
  7. Chen, X. D., Qian, H. Y., Neff, L., Satomura, K., Horowitz, M. C. Thy-1 antigen expression by cells in the osteoblast lineage. J Bone Miner Res. 14, 362-375 (1999).
  8. Malladi, P., Xu, Y., Yang, G. P., Longaker, M. T. Functions of vitamin D, retinoic acid, and dexamethasone in mouse adipose-derived mesenchymal cells. Tissue engineering. 12, 2031-2040 (2006).
  9. Levi, B., et al. Depot-specific variation in the osteogenic and adipogenic potential of human adipose-derived stromal cells. Plastic and reconstructive surgery. 126, 822-834 (2010).
  10. James, A. W., et al. Estrogen/estrogen receptor alpha signaling in mouse posterofrontal cranial suture fusion. PloS one. 4, e1720(2009).
  11. Locke, M., Feisst, V., Dunbar, P. R. Concise review: human adipose-derived stem cells: separating promise from clinical need. Stem Cells. 29, 404-411 (2011).
  12. Glotzbach, J. P., et al. An Information Theoretic, Microfluidic-Based Single Cell Analysis Permits Identification of Subpopulations among Putatively Homogeneous Stem Cells. PLoS One. 6, e21211(2011).
  13. Zhu, M., Heydarkhan-Hagvall, S., Hedrick, M., Benhaim, P., Zuk, P. Manual isolation of adipose-derived stem cells from human lipoaspirates. J. Vis. Exp. , e50585(2013).
  14. Mitchell, J. B., et al. Immunophenotype of human adipose-derived cells: temporal changes in stromal-associated and stem cell-associated markers. Stem Cells. 24, 376-385 (2006).
  15. McMurray, R. J., et al. Nanoscale surfaces for the long-term maintenance of mesenchymal stem cell phenotype and multipotency. Nat Mater. 10, 637-644 (2011).
  16. Katz, A. J., Tholpady, A., Tholpady, S. S., Shang, H., Ogle, R. C. Cell surface and transcriptional characterization of human adipose-derived adherent stromal (hADAS) cells. Stem Cells. 23, 412-423 (2005).
  17. McIntosh, K., et al. The immunogenicity of human adipose-derived cells: temporal changes in vitro. Stem Cells. 24, 1246-1253 (2006).
  18. Choudhery, M. S., Badowski, M., Muise, A., Pierce, J., Harris, D. T. Donor age negatively impacts adipose tissue-derived mesenchymal stem cell expansion and differentiation. Journal of translational medicine. 12, 8(2014).
  19. Yoshimura, K., Suga, H., Eto, H. Adipose-derived stem/progenitor cells: roles in adipose tissue remodeling and potential use for soft tissue augmentation. Regenerative medicine. 4, 265-273 (2009).
  20. Chung, M. T., et al. CD90 (Thy-1) Positive Selection Enhances Osteogenic Capacity of Human Adipose-Derived Stromal Cells. Tissue Eng Part A. , (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

CD90
בידוד וההעשרה של אדם שומן המופק מתאי סטרומה לOsteogenesis משופר
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.