מאמר שיטה

זיהוי וניתוח של נזק לדנ"א בשרירי שלד עכבר באתר שימוש בשיטת TUNEL

DOI:

10.3791/52211

⸱

16 בדצמבר 2014

 , 
1Division of Neuropathology, Department of Pathology, Pathobiology Graduate Program, Johns Hopkins School of Medicine

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סרטון זה מתאר דיסקציה, עיבוד רקמות, חתך ותיוג TUNEL מבוסס פלואורסצנטי של שריר השלד של העכבר. הוא גם מתאר שיטה לניתוח אוטומטי למחצה של תיוג TUNEL.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) היא השיטה לשימוש באנזים TdT כדי לחבר קוולנטית צורה מתויגת של dUTP לקצוות 3' של שברי DNA כפולים וחד-גדיליים בתאים. זוהי שיטה אמינה ושימושית לאיתור נזק ל-DNA ומוות תאים באתרו. סרטון זה מתאר דיסקציה, עיבוד רקמות, חתך ותיוג TUNEL מבוסס פלואורסצנטי של שריר השלד של העכבר. הוא גם מתאר שיטה של כימות אותות TUNEL חצי אוטומטי. תכונות רקמה תקינות אינהרנטיות ותנאי עיבוד רקמות משפיעים על יכולתו של אנזים TdT לתייג DNA ביעילות. עיבוד רקמות עלול גם להוסיף אוטופלואורסצנטיות לא רצויה שתפריע לזיהוי אותות TUNEL. לכן, חשוב לקבוע באופן אמפירי שיטות עיבוד רקמות ותיוג TUNEL שיניבו את יחס האות לרעש האופטימלי לכימות שלאחר מכן. הבדיקה מבוססת הקרינה המתוארת כאן מספקת דרך לשלול אות אוטופלואורסצנטי על ידי חיסור ערוץ דיגיטלי. בדיקת TUNEL, המשמשת עם טכניקות ובקרות מתאימות לעיבוד רקמות, היא שיטה כמותית מהירה יחסית, ניתנת לשחזור לזיהוי אפופטוזיס ברקמות. ניתן להשתמש בו כדי לאשר נזק ל-DNA ואפופטוזיס כמנגנונים פתולוגיים, לזהות סוגי תאים מושפעים ולהעריך את יעילותם של טיפולים טיפוליים in vivo.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

dUTP Terminal transferase deoxynucleotidyl (TDT) תיוג ניק הסוף (TUNEL) הוא התהליך של שימוש באנזים TDT לצרף dUTP 3 'מסתיים כפול ודנ"א חד-גדילים שוברים 12,23. שיטת TUNEL לגילוי נזק אפופטוזיס ו- DNA דווחה לראשונה לפני למעלה מ -20 שנים על ידי et al גבריאלי. 1,12,24. זה מאז העריך ומותאם בהכנות רקמות שונות 7,23,27,40. TUNEL נעשה שימוש כדי ללמוד מוות מושרה איסכמיה תא של הנוירונים 6,14,29 וcardiomyocytes 43,44, מוות של תאים עצביים הפעלת יתר רעיל 30,31, וכסמן ביולוגי לטיפול בדלקת פרקים 39. כמו כן, שמש כגורם מנבא וסמן תאים סרטניים בסרטן בבני אדם שונים 2,3,15,32,37,38,42.

שיטות אלטרנטיביות קיימות לנזק לדנ"א וגילוי מוות של תאים, אבל יש להם אתגרים ואזהרות טכניים. סופג דרום עשוי לשמש לquantifנזק y DNA בlysates רקמות השלם 7,9-11, אך שיטה זו אינו מספקת רזולוציה ברמה התאית וקשה לכמת. Assay השביט הוא שיטה מבוססת תאים חלופי שדורשת חילוץ גרעינים השתמרו מתאי 4,20,28,36. למרות assay השביט עובד היטב בתאים מבודדים בתרבית, זה הרבה יותר קשה להכין גרעינים שלמים מרקמת שריר שלד 8,21. כמו עם כתם דרום, assay השביט אינו מספק מידע תא מסוג ספציפי מhomogenate רקמת שריר כולו. חלופה נוספת לשיטת TUNEL היא אימונוהיסטוכימיה באמצעות נוגדנים נגד DNA חד-גדילי 25,33,41 או נגד חלבונים המשתתפים במסלולי תגובת נזק ל- DNA ומוות של תאים (לדוגמא p53, H2AX, וcaspases) 13,17,22,40. שיטות המבוססים על נוגדנים אלה נדרשים אפיון יסודי של נוגדנים וספציפיות נוגדן מצוין להניב יחס אות ל- רקע גבוה. גם כאשר מפרטנוגדני ific קיימים, הם עשויים לדרוש denaturation של חלבון המטרה באמצעות הליכי אחזור אנטיגן 34,35. כפי שאנו דנים כאן, אחזור אנטיגן בתוצאות רקמת שריר גבוה בלתי מתקבל על הדעת autofluorescence. בניגוד לשיטות חלופיות, TUNEL משיג גילוי נזק ל- DNA עם אות גבוהה ורקע נמוך, סגוליות מעולה שיכול להיבדק עם פקדים פשוטים חיוביים ושליליים, חדירת רקמה טובה שאינו דורשים אחזור אנטיגן, ורזולוציה ברמה תאית. בנוסף, שיטת TUNEL לוקחת בערך 4 שעות כדי להשלים, ואילו בדרך כלל שיטות חלופיות דורשות incubations הלילה.

אנחנו לומדים מוות של תאי שריר שלד במודל עכבר של ניוון שרירים (SMA) 10 שנוצר על ידי Hsieh-לי ועמיתים 16. כדי לכמת תאים אפופטוטיים בשריר, פיתחנו שיטה של ​​הכנת רקמה, צביעה, וquantitation שעובדת וחסונה על פני skele שונהקבוצות שרירים טל בנקודות זמן התפתחותיים שונות בעכברים. אנו משתמשים בערכת TUNEL תיוג זמינה מסחרי ותוכנת ניתוח תמונה זמינה מסחרי. יש לנו גם השתמשתי בהצלחה assay TUNEL בשילוב עם מכתים immunofluorescent בחוט השדרה 10.

השיטות שתוארו כאן הן שימושיות לחוקרים שרוצים להעריך פתולוגיה רקמה, מנגנונים של מחלה, מנגנונים של הזדקנות, והתפתחותית (לפני ואחרי לידה) מוות של תאים בשריר שלד. טכניקת TUNEL שימושית במיוחד עבור מחקרים של נזק לדנ"א ותיקון ומוות של תאים במערכות מודל שבו רק קבוצת משנה של תאים הוא רזולוציה רמה מושפעת וסלולרית היא הכרחית.

וידאו זה מתאר לנתיחה, עיבוד רקמות, חתך, ותיוג TUNEL הקרינה מבוססת של שרירי שלד עכבר. הוא גם מתאר שיטה של ​​quantitation אות TUNEL חצי אוטומטי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: נהלי כל החיה שתוארו בפרוטוקול זה בוצעו בהתאם להמלצות במדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה של המכון הלאומי לבריאות 26. הפרוטוקול (MO13M391) אושר על ידי ועדת אוניברסיטת הטיפול בבעלי חיים והשימוש בג'ונס הופקינס.

קורבן 1. ילודי עכבר, Dissection, וקיבוע

  1. להקריב את העכבר בילוד משאיפת CO 2.
  2. מנותק מייד hindlimb מעל הברך. עד שיום כ 7 לאחר הלידה, עצמות הרגל רכות מספיק כדי לחתוך דרך במספריים מעבדה גדולים או סכין חד ולאחר מכן קטע על cryostat.
  3. הנח את hindlimb ב 10 מיליליטר של paraformaldehyde 4% קרים כקרח שבנאגר מלוח פוספט (PBS) בצינור 15 מיליליטר.
  4. טבילה לתקן hindlimb בparaformaldehyde ל4-24 שעות על 4 מעלות צלזיוס. רקמה עוברית דורשת כמה שעות בלבדים של קיבעון.
    1. הימנע מקיבעון יותר מ 24 שעות, מכיוון שהדבר עלול להפחית את יעילות assay TUNEL.
  5. Cryoprotect hindlimb ידי טבילתו בתמיסת סוכרוז.
    1. לשנות paraformaldehyde לסוכרוז 10% ב- PBS באותו הצינור 15 מיליליטר, דגירה הלילה ב 4 מעלות צלזיוס.
    2. שינוי לסוכרוז 30% ב- PBS, דגירה הלילה ב 4 ° C או עד כיורים hindlimb לחלק התחתון של הצינור. רקמה ניתן להשאיר בסוכרוז% 30 לתקופה ארוכה יותר, ובלבד שסוכרוז כבר מסונן סטרילי.

2. רקמות הטבעה

  1. מלא שכותרתו חצי דרך עובש הטבעה עם ההטבעה בינונית.
  2. הנח hindlimb על גבי מדיום ההטבעה, עם הצד החתוך הקרוב ככל האפשר לקיר אחד של העובש. סמן את הכיוון של hindlimb בצד החיצוני של העובש.
    1. להטביע כמה hindlimbs ולחתוך באותו הבלוק. עם זאת, חשוב להבטיח כי כל היןdlimbs בבלוק מכוון מקביל זה לזה כדי לקבל חלקים ברמות תואמות לאורך הציר של הגפיים.
  3. לכסות hindlimbs עם ההטבעה בינונית. אם hindlimbs Shift לחוץ בזמן השפיכה הבינוני, מחדש מכוונים אותם עם מלקחיים קהים שקצהו או קיסם.
  4. לאפשר הטמעה בינונית לחדור את הרקמה בטמפרטורת חדר למשך לפחות 15 דקות.
  5. תבניות מקום ישירות על קרח יבש או באיזופנטאן על קרח יבש להקפיא הטבעה בינונית. הקפד לשמור על רמת התבניות בכל העת ולהימנע מהסטה של ​​הרקמה המוטבעת.
  6. שמור תבניות קפוא ב -80 ° C עד מוכן לחתוך, לתקופה של עד מספר חודשים.

3. איברים Cryosectioning Embedded

  1. טמפרטורה שנקבעה cryostat הקאמרית ל-20 ° C, טמפרטורת אובייקט ל-18 מעלות צלזיוס; להתאים טמפרטורת אובייקט למטה לפי צורך.
  2. לאזן את גוש הרקמה בתוך חדר cryostat לפחות 30 דקות. טמפ 'בלוק הנכוןerature הוא קריטי לאיכות סעיף.
  3. לחתוך חלקים רוחביים בעובי של 10 מיקרומטר או פחות. חלקים עבים יותר לא חדרו באופן מלא על ידי חומרים כימיים TUNEL. השתמש בצלחת אנטי-רול, להבים, וזווית להב (בדרך כלל 5 מעלות) מומלצים לcryostat.
  4. לאסוף חלקים על gelatin- או שקופיות זכוכית vectabond מצופים בטמפרטורת חדר. הנח מייד לתיבה להחליק על קרח יבש. שמור את תיבת השקופיות במכל נפרד עם קרח יבש ממוקם ליד cryostat בהישג יד.
    1. לחתוך חלקים רוחביים סידוריים דרך ציר הגפה הארוך, דילוג 100-200 מיקרומטר. לאסוף לפחות 3 חלקים סמוכים בכל רמת סדרתי.

4. TUNEL Assay על סעיפים Hindlimb באמצעות ערכה זמינה מסחרי (בכל הצעדים בטמפרטורת חדר אלא אם צוין)

  1. להפשיר שקופיות עם חלקים לטמפרטורת חדר ולילה יבש או בסוף השבוע.
  2. רעננותם סעיפים על ידי immersinשקופיות g בPBS עבור 2 x 10 דקות בצנצנת Coplin. יבש עם מעבדה לנגב, הסרת כמה שיותר נוזל סביב הסעיף ככל האפשר.
  3. חלקי Permeabilize
    1. השתמש באחת שאינו מפרקי חלבונים, מגיב מבוסס saponin מסחרי או 0.5% Tween20 ו0.05% Triton X100 בPBS.
    2. מניחים את השקופית לתוך תא לחות. תא לחות פשוט הוא תיבת קצה פיפטה ריקה עם מכסה הדוק, עם הוסיפו מספיק מים כדי לכסות את החלק התחתון של התיבה.
    3. מספיק מגיב פיפטה לשקופית כדי לכסות את הסעיף (50 μl מספיק עבור גפיים עכבר בילוד). אל פיפטה ישירות על הסעיף, כפי שתסיסה חוזרת ונשנית עלולה לגרום לסעיף להרים את השקופית.
    4. בעזרת מלקחיים קהים שקצהו, למקם את המלבן קטן של parafilm על גבי הסעיף להתפזר הירידה של מגיב ולכסות את הסעיף לחלוטין. אם כל בועות יוצרות תחת parafilm, בעדינות להרים אותו, יבש, ולהחיל מחדש.
    5. דגירה שקופיות עם permeabiliמגיב zation עבור שעה 1 בתא לחות מכוסה. אם חלקים מתחילים להמריא מהשקופיות, זמן permeabilization עשוי להיות מופחת עד 30 דקות.
    6. לשטוף שקופיות בPBS בדקות 2 x 5 צנצנת Coplin. המלבנים parafilm צריכים לצוף למעלה ולאחר מכן ניתן להסיר ומבוטל.
    7. באמצעות מעבדה לנגב, לייבש כמה שיותר נוזל סביב הסעיפים ככל האפשר.
  4. תיוג הפסקת DNA בתיווך TDT
    1. בצע את הוראות הערכה לעשות חיץ 1x TDT תיוג, תיוג חיץ מספיק פיפטה לשקופית כדי לכסות קטע רקמה (50 μl מספיק עבור גפיים עכבר בילוד). דגירה בתא לחות במשך 5 דקות. לחלופין, לטבול את השקופית במאגר תיוג TDT בצנצנת coplin.
    2. עקוב אחר הוראות ערכה לעשות תערובת תיוג TDT. הערכה כוללת קובלט, מגנזיום, מנגן וקטיונים; קטיון מנגן עובד היטב במגוון רחב של רקמות, כולל שרירי שלד, Tiss מערכת עצביםUES, כבד, עור, ועצם.
    3. לביקורת חיובית, להוסיף DNase (שכותרתו "nuclease" בערכה) לתערובת תיוג TDT. לחלופין, טרום לטפל סעיף בקרה חיובי עם DNase במאגר nuclease עבור שעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס, בהתאם להוראות ערכה. שמור על פתרון DNase וחתכים שטופל DNase מסעיפים ניסיוניים אחרים כדי למנוע זיהום צולב.
    4. לביקורת שלילית, להשמיט אנזים TDT מתערובת התיוג.
    5. השתמש במעבדה לנגב כדי להסיר כמה שיותר חיץ תיוג TDT משקופית ככל האפשר. תערובת תיוג פיפטה TDT לשקופית (50 μl לכל סעיף), מכסה במלבן חדש של parafilm, ודגירה בתא לחות על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
    6. בצע את הוראות הערכה לעשות חיץ תחנת 1x. השתמש במעבדה לנגב כדי להסיר תערובת תיוג TDT מהשקופיות, ולהוסיף 200-300 חיץ תחנת μl כדי לכסות את קטע הרקמה, דגירה בתא לחות במשך 5 דקות. אל ternatively, לטבול את השקופית במאגר תחנה בצנצנת Coplin.
    7. שטוף את שקופיות דקות 2 x 2 בPBS. השתמש במעבדה לנגב כדי להסיר כמה שיותר PBS מהשקופית ככל האפשר.
  5. תיוג פלורסנט
    1. עקוב אחר הוראות ערכה להכנת פתרון תיוג והעמסת לתייג dNTPs בהפסקות DNA. פתרון פיפטה לשקופית (50 μl לכל סעיף), מכסה במלבן חדש של parafilm, ודגירה בתא לחות למשך 20 דקות.
    2. שקופית לשטוף עבור 2 דקות ב PBS בצנצנת Coplin. השתמש במעבדה לנגב כדי להסיר כמה שיותר PBS ככל האפשר מהשקופיות.
    3. לדלל Hoechst 33258 גרעיני כתם עד 1 מיקרוגרם / מיליליטר PBS ופיפטה לשקופית (100-200 μl מספיק לכסות סעיף). דגירה בתא לחות במשך 5 דקות.
    4. לשטוף 3x במשך 5 דקות בPBS.
    5. Coverslip עם antifade תקשורת הרכבה הקרינה ולאטום קצוות עם לק.
> 5 רכישת jove_title ". דיגיטלית תמונה

  1. לרכוש תמונות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונבנציונלי עם DAPI, FITC, ומסנני טקסס אדומים (או שווה ערך). השתמש במטרה גבוהה יותר הגדלה (20X או 40X) כדי לוודא שהתיוג היה מוצלח וגרעינים (שלמים או מקוטעים) תויגו. מטרת 10X מספיק כדי לכמת את puncta TUNEL-החיובי.
  2. לאסוף תמונות של צביעת Hoechst, מכתים TUNEL, ואות autofluorescent כשלושה ערוצים בצבעים מלאכותיים נפרדים בשילוב בתמונה אחת. אם תווית fluorophore TUNEL היא ירוקה, אות autofluorescent תמונה במסנן האדום, ולהפך.
    1. שמור את כל הגדרות ההדמיה שווה בין השקופיות לthresholding וquantitation שלאחר מכן. עבור כל מסנן, זמנים מוגדרים מראש וחשיפת שיא, רווח, וbinning (לא binning הוא הטוב ביותר); לא להשתמש בהגדרות חשיפה או רווח אוטומטיות.
    2. השתמש בניסוי וטעייה כדי למצוא הגדרות חשיפה ורווח שיהיה ללכוד הטוב ביותר בטווח של intensities בכל השקופיות המוכתמות. ודא שאין פיקסלים רוויים בתמונות שנרכשו, כquantitation הטיה רצון זה.
  3. קח תמונות של כל קבוצת השרירים של עניין. זה עשוי לדרוש מספר רב של תמונות ש" תפור "ביחד.

ניתוח 6. תמונה

  1. להשתמש בתוכניות ניתוח תמונה זמינות מסחרי כדי לנתח תמונות דיגיטליות של מכתים TUNEL. ניתוח באמצעות תוכנה מסחרית מוצג כאן. לחלופין, ImageJ התוכנה החופשי מNIH ניתן להשתמש כדי לנתח מכתים TUNEL.
  2. כתם סעיף סמוך לסעיף מוכתם TUNEL עם hematoxylin ו eosin (H & E) ולקחת תמונה דיגיטלית מלא קטע עם מיקרוסקופ brightfield קונבנציונלי. השתמש בתמונה זו H & E בשילוב עם אטלס האנטומיה 5,18,19 לאתר את המבנים אנטומיים שיש לכמת.
  3. עם ערוץ TUNEL כבוי, להתחקות באופן ידני את קווי המתאר של האזור שיש לכמת, באמצעותHoechst וערוצי autofluorescence להדרכה. להמיר את האזור איתר לתוך מסכה (סט של פיקסל נבחר מרכז להיות מנותח).
  4. הפעל את ערוץ TUNEL. שימוש בעוצמת thresholding פונקציה בתכנית ניתוח תמונה, לקבוע את הסף התחתון שלא לכלול את כל אות autofluorescence.
  5. להחיל את אותן הגדרות סף לכל התמונות בסט המחקר. המרת בחירות thresholded למסכות.
  6. עבור כל תמונה, לשלב את מסכת אזור השריר ומסכת TUNEL. מסכת השילוב החדשה תייצג אות TUNEL בתוך אזור השריר לייחס רק.
  7. לבצע quantitation מסכה על מסכת שילוב לקבוע מספר האובייקטים ומתנגדים אזור של אות TUNEL בתוך אזור השריר איתר. לבצע את זה באמצעות פונקצית החלקיקים Analyzer בImageJ.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עם כתמים מוצלחים, אות TUNEL החיובי צריכה להיות בהירה מספיק כדי לבודד מautofluorescence על ידי קביעת סף עוצמה. אובייקטי TUNEL החיוביים בהגדלה נמוכה עשויים להופיע ברים סדירים בהירים כמו בשרירי שלד (איור 1 א). עם זאת, בהגדלה גבוהה יותר, כמה חפצי TUNEL חיובי עם המורפולוגיה אפופטוטיים הקלאסית יש לשים לב, אם סוג המוות של תאים המעורבים הוא אפופטוזיס (איור 1). הבקרה החיובית (DNase הוסיף) צריכה להפגין אות TUNEL החיובי בשפע, מפוזרת באופן אחיד על פני כל הרקמ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיטה לאיתור ולכמותית לנתח אפופטוזיס הקשורים נזק ל- DNA בשרירי שלד עכבר מתואר. ההליך כולל קצירת רקמה, צביעת TUNEL, רכישת תמונה דיגיטלית, וניתוח תמונה. אספקה ​​היסטולוגית משותפת וכלים נחוצים, וערכת TUNEL מסחרית מיוחדת היא הכרחית. פריטי הציוד הגדולים החיוניים הדרושים הם מערכת מחשב לניתוח תמונה cryostat, מיקרוסקופ epifluorescent עם יכולת תמונה דיגיטלית, ו.

הנסיין צריך להיות מודע לבעיות פוטנציאליות. autofluorescence ר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מענק NIH-NINDS RO1-NS065895 ומענק NIH-NINDS 5-F31-NS076250-02.

אנו מודים למתקן המיקרוסקופ JHU SOM על השימוש בקריוסטט.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
4% פרפורמלדהיד במי מלח חוצץ פוספטמיקרוסקופיה אלקטרונית19202עבור הליכים המתוארים כאן, תמיסה של 4% הוכנה טרייה מאבקה. ניתן להשתמש בפרפורמלדהיד מכל ספק. יש לאחסן תמיסת פורמלדהיד מוכנה בטמפרטורה של 4 מעלות; C ואין להשתמש בו לאחר תאריך התפוגה שלו (עד מספר חודשים). פרפורמלדהיד הוא חומר מסרטן ורעלן בשאיפה ובמגע עם העור. אנא פעל לפי אמצעי הזהירות המפורטים ב-MSDS בעת טיפול בפרפורמלדהיד.
סוכרוזסיגמאS0389משמש להגנה על רקמות בהקפאה לפני הקפאה. ניתן להשתמש בסוכרוז מכל ספק.
תרכובת O.C.T.Tissue-Tek4583מדיום הטמעה להקפאה.
CryostatLeicaCM 3050Sקריוסטט CM3050S Leica שימש להכנות המתוארות כאן. כל קריוסטט המסוגל לחתוך 10 μ ניתן להשתמש במקטעים מ '.
מגלשות זכוכית, 25 x 75 x 1 מ"מפישר12-552-3ניתן להשתמש בשקופיות מכל ספק.
ג'לטיןסיגמאG-9391ג'לטין משמש לקידום הידבקות חתך רקמות לשקופיות זכוכית. לציפוי שקופיות זכוכית בג'לטין, ממיסים 2.75 גרם ג'לטין ו-0.275 גרם אלום כרום ב-500 מ"ל מים מזוקקים, חמים ל-60 מעלות; ג, טובלים שקופיות למשך מספר שניות ומניחים להתייבש. ניתן להשתמש בג'לטין מכל ספק. לחלופין, ניתן לרכוש שקופיות מצופות ג'לטין.
כרום (III) אשלגן גופרתי דודקהידראט (אלום כרום)סיגמא243361אלום כרום מתווסף לתמיסת ג'לטין כדי לקדם הידבקות רקמות על שקופיות זכוכית. זהו חומר מסרטן אפשרי ורעלן בשאיפה ובמגע עם העור. אנא פעל לפי אמצעי הזהירות המפורטים ב-MSDS בעת טיפול באלום כרום.
מגיב הידבקות רקמות VectabondVector LabsSP-1800מצע אופציונלי להדבקה טובה יותר של רקמות לשקופיות זכוכית; ניתן להשתמש במקום זאת בשקופיות מצופות ג'לטין.
Tween20SigmaP9416חומר ניקוי המשמש לחדירת רקמות. ניתן להשתמש ב-Tween20 מכל ספק.
Triton X100SigmaT8787חומר ניקוי המשמש לחדירת רקמות. ניתן להשתמש ב-Triton X100 מכל ספק.
ערכת זיהוי אפופטוזיס TACS 2 TdT fluorescein in situTrevigen4812-30-Kלתיוג TUNEL מבוסס פלואורסצנטי.
DNase/nucleaseTrevigen4812-30-K(כלול בערכה)
DNase/nuclease bufferTrevigen4812-30-K(כלול בערכה)
10x פוספט חוצץ מלח (PBS), pH 7.4Amresco780הכינו 1x PBS לשטיפות ודילול. ניתן להשתמש ב-PBS מכל ספק.
מים ללא DNaseאיכות ביולוגית351-029-131ניתן להשתמש במים מכל ספק.
Hoechst 33258Sigma94403צבע גרעיני. ניתן להשתמש בכל צבע גרעיני פלואורסצנטי כחול. כצבע קושר DNA, הוכסט חשוד כמסרטן ויש לטפל בו עם ציוד מגן כדי למזער מגע עם העור.
Parafilm Mמרובה807ניתן להשתמש בכל סרט הידרופובי אחר או פתק כיסוי. זמין ממספר ספקים.
במיקרוסקופ פלואורסצנטי עם מצלמה דיגיטלית  --ניתן להשתמש בכל מיקרוסקופ פלואורסצנטי המסוגל ללכוד דיגיטלית פלואורסצנטיות אדומה, ירוקה וכחולה בערוצים נפרדים.
במדיה נגד דהייה של VectashieldVector LabsH-1000Antifade Media מכל ספק.
כיסויי זכוכית, עובי מס' 1מעבדות מחקר מוח2222-1ניתן להשתמש בפתקי כיסוי מכל ספק. הגודל הקטן ביותר של 22 על 22 מ"מ מספיק לקטעי רגלי עכבר יילודים.
לקטד פלה114-8משמש לאיטום כיסויים. ניתן להשתמש בלק מכל ספק (כולל קמעונאים רגילים). הימנע משימוש בלק עם צבע או תוספים שעלולים להחזיר אור במהלך הדמיית פלורסנט.
מדעי ערכה מסחרית ניתן להשתמש --ניתן להשתמש

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ansari, B., Coates, P. J., Greenstein, B. D., Hall, P. A. In situ end-labelling detects DNA strand breaks in apoptosis and other physiological and pathological states. 170 (1), 1-8 (1993).
  2. Ben-Izhak, O., Laster, Z., Akrish, S., Cohen, G., Nagler, R. M. TUNEL as a tumor marker of tongue cancer. Anticancer Res. 28 (5B), 2981-2986 (2008).
  3. Colecchia, M., et al. Detection of apoptosis by the TUNEL technique in clinically localised prostatic cancer before and after combined endocrine therapy. 50 (5), 384-388 (1997).
  4. Collins, A. R. The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations. Mol. Biotechnol. 26 (3), 249-261 (2004).
  5. Delaurier, A., et al. The Mouse Limb Anatomy Atlas: an interactive 3D tool for studying embryonic limb patterning. 8, 83(2008).
  6. Torres, C., Munell, F., Ferrer, I., Reventos, J., Macaya, A. Identification of necrotic cell death by the TUNEL assay in the hypoxic-ischemic neonatal rat brain. Neurosci. Lett. 230 (1), 1-4 (1997).
  7. Didenko, V. V. In Situ Detection of DNA Damage : Methods and Protocols. , Humana Press. 978-970 (2002).
  8. Edelman, J. C., Edelman, P. M., Kniggee, K. M., Schwartz, I. L. Isolation of skeletal muscle nuclei. J. Cell Biol. 27 (2), 365-378 (1965).
  9. Facchinetti, A., Tessarollo, L., Mazzocchi, M., Kingston, R., Collavo, D., Biasi, G. An improved method for the detection of DNA fragmentation. J. Immunol. Methods. 136 (1), 125-131 (1991).
  10. Fayzullina, S., Martin, L. J. Skeletal muscle DNA damage precedes spinal motor neuron DNA damage in a mouse model of spinal muscular atrophy (SMA). PLoS.One. 9 (3), e93329(2014).
  11. Ferrer, I., et al. Naturally occurring cell death in the developing cerebral cortex of the rat. Evidence of apoptosis-associated internucleosomal DNA fragmentation. Neurosci. Lett. 182 (1), 77-79 (1994).
  12. Gavrieli, Y., Sherman, Y., Ben-Sasson, S. A. Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation. J. Cell Biol. 119 (3), 493-501 (1992).
  13. Gown, A. M., Willingham, M. C. Improved detection of apoptotic cells in archival paraffin sections: immunohistochemistry using antibodies to cleaved caspase 3. J. Histochem. Cytochem. 50 (4), 449-454 (2002).
  14. Hara, A., et al. Neuronal apoptosis studied by a sequential TUNEL technique: a method for tract-tracing. Brain Res. Brain Res. Protoc. 4 (2), 140-146 (1999).
  15. Harn, H. J., et al. Apoptosis occurs more frequently in intraductal carcinoma than in infiltrating duct carcinoma of human breast cancer and correlates with altered p53 expression: detected by terminal-deoxynucleotidyl-transferase-mediated dUTP-FITC nick end labelling (TUNEL). Histopathology. 31 (6), 534-539 (1997).
  16. Hsieh-Li, H. M., et al. A mouse model for spinal muscular atrophy. Nat. Genet. 24 (1), 66-70 (2000).
  17. Huerta, S., Goulet, E. J., Huerta-Yepez, S., Livingston, E. H. Screening and detection of apoptosis. J. Surg. Res. 139 (1), 143-156 (2007).
  18. Iwaki, T., Yamashita, H., Hayakawa, T. A color atlas of sectional anatomy of the mouse. 1, 1st edn, Braintree Scientific. Japan. (2001).
  19. Kaufman, M. H. The atlas of mouse development. , 1st edn, Academic Press. London. (1992).
  20. Koppen, G., Angelis, K. J. Repair of X-ray induced DNA damage measured by the comet assay in roots of Vicia faba. Environ. Mol. Mutagen. 32 (2), 281-285 (1998).
  21. Kuehl, L. Isolation of skeletal muscle nuclei. Methods Cell Biol. 15, 79-88 (1977).
  22. Kuo, L. J., Yang, L. X. Gamma-H2AX - a novel biomarker for DNA double-strand breaks. In Vivo. 22 (3), 305-309 (2008).
  23. Labat-Moleur, F., et al. TUNEL apoptotic cell detection in tissue sections: critical evaluation and improvement. J. Histochem. Cytochem. 46 (3), 327-334 (1998).
  24. Modak, S. P., Bollum, F. J. Detection and measurement of single-strand breaks in nuclear DNA in fixed lens sections. Exp. Cell Res. 75 (2), 307-313 (1972).
  25. Naruse, I., Keino, H., Kawarada, Y. Antibody against single-stranded DNA detects both programmed cell death and drug-induced apoptosis. Histochemistry. 101 (1), 73-78 (1994).
  26. National Research Council (US) Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , 8th edn, National Research Council. Washington, D.C.. (2011).
  27. Negoescu, A., et al. In situ apoptotic cell labeling by the TUNEL method: improvement and evaluation on cell preparations). J. Histochem. Cytochem. 44 (9), 959-968 (1996).
  28. Ostling, O., Johanson, K. J. Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 123 (1), 291-298 (1984).
  29. Phanithi, P. B., Yoshida, Y., Santana, A., Su, M., Kawamura, S., Yasui, N. Mild hypothermia mitigates post-ischemic neuronal death following focal cerebral ischemia in rat brain: immunohistochemical study of Fas, caspase-3 and TUNEL. Neuropathology. 20 (4), 273-282 (2000).
  30. Portera-Cailliau, C., Price, D. L., Martin, L. J. Excitotoxic neuronal death in the immature brain is an apoptosis-necrosis morphological continuum. J. Comp Neurol. 378 (1), 70-87 (1997).
  31. Portera-Cailliau, C., Price, D. L., Martin, L. J. Non-NMDA and NMDA receptor-mediated excitotoxic neuronal deaths in adult brain are morphologically distinct: further evidence for an apoptosis-necrosis continuum. J. Comp Neurol. 378 (1), 88-104 (1997).
  32. Ravi, D., Ramadas, K., Mathew, B. S., Nalinakumari, K. R., Nair, M. K., Pillai, M. R. De novo programmed cell death in oral cancer. Histopathology. 34 (3), 241-249 (1999).
  33. Sakaki, T., Kohmura, E., Kishiguchi, T., Yuguchi, T., Yamashita, T., Hayakawa, T. Loss and apoptosis of smooth muscle cells in intracranial aneurysms. Studies with in situ DNA end labeling and antibody against single-stranded DNA. Acta Neurochir.(Wien). 139 (5), 469-474 (1997).
  34. Shi, S. R., Cote, R. J., Taylor, C. R. Antigen retrieval immunohistochemistry: past, present, and future. J. Histochem. Cytochem. 45 (3), 327-343 (1997).
  35. Shi, S. R., Imam, S. A., Young, L., Cote, R. J., Taylor, C. R. Antigen retrieval immunohistochemistry under the influence of pH using monoclonal antibodies. J. Histochem. Cytochem. 43 (2), 193-201 (1995).
  36. Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Exp. Cell Res. 175 (1), 184-191 (1988).
  37. Sirvent, J. J., Aguilar, M. C., Olona, M., Pelegri, A., Blazquez, S., Gutierrez, C. Prognostic value of apoptosis in breast cancer pT1-pT2). A TUNEL, p53, bcl-2, bag-1 and Bax immunohistochemical study. Histol.Histopathol. 19 (3), 759-770 (2004).
  38. Skyrlas, A., Hantschke, M., Passa, V., Gaitanis, G., Malamou-Mitsi, V., Bassukas, I. D. Expression of apoptosis-inducing factor (AIF) in keratoacanthomas and squamous cell carcinomas of the skin. Exp. Dermatol. 20 (8), 674-676 (2011).
  39. Smith, M. D., Weedon, H., Papangelis, V., Walker, J., Roberts-Thomson, P. J., Ahern, M. J. Apoptosis in the rheumatoid arthritis synovial membrane: modulation by disease-modifying anti-rheumatic drug treatment. Rheumatology.(Oxford). 49 (5), 862-875 (2010).
  40. Stadelmann, C., Lassmann, H. Detection of apoptosis in tissue sections). Cell Tissue Res. 301 (1), 19-31 (2000).
  41. Schans, G. P., van Loon, A. A., Groenendijk, R. H., Baan, R. A. Detection of DNA damage in cells exposed to ionizing radiation by use of anti-single-stranded DNA monoclonal antibody. Int. J. Radiat. Biol. 55 (5), 747-760 (1989).
  42. Watanabe, I., et al. Detection of apoptotic cells in human colorectal cancer by two different in situ methods: antibody against single-stranded DNA and terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end-labeling (TUNEL) methods. Jpn. J. Cancer Res. 90 (2), 188-193 (1999).
  43. Watanabe, T., et al. Apoptosis signal-regulating kinase 1 is involved not only in apoptosis but also in non-apoptotic cardiomyocyte death. Biochem. Biophys. Res. Commun. 333 (2), 562-567 (2005).
  44. Yaoita, H., Ogawa, K., Maehara, K., Maruyama, Y. Attenuation of ischemia/reperfusion injury in rats by a caspase inhibitor. Circulation. 97 (3), 276-281 (1998).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

DNAIn Situ

מאמרים קשורים