זיהוי וניתוח של נזק לדנ"א בשרירי שלד עכבר באתר שימוש בשיטת TUNEL

סיכום

סרטון זה מתאר דיסקציה, עיבוד רקמות, חתך ותיוג TUNEL מבוסס פלואורסצנטי של שריר השלד של העכבר. הוא גם מתאר שיטה לניתוח אוטומטי למחצה של תיוג TUNEL.

תקציר

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) היא השיטה לשימוש באנזים TdT כדי לחבר קוולנטית צורה מתויגת של dUTP לקצוות 3' של שברי DNA כפולים וחד-גדיליים בתאים. זוהי שיטה אמינה ושימושית לאיתור נזק ל-DNA ומוות תאים באתרו. סרטון זה מתאר דיסקציה, עיבוד רקמות, חתך ותיוג TUNEL מבוסס פלואורסצנטי של שריר השלד של העכבר. הוא גם מתאר שיטה של כימות אותות TUNEL חצי אוטומטי. תכונות רקמה תקינות אינהרנטיות ותנאי עיבוד רקמות משפיעים על יכולתו של אנזים TdT לתייג DNA ביעילות. עיבוד רקמות עלול גם להוסיף אוטופלואורסצנטיות לא רצויה שתפריע לזיהוי אותות TUNEL. לכן, חשוב לקבוע באופן אמפירי שיטות עיבוד רקמות ותיוג TUNEL שיניבו את יחס האות לרעש האופטימלי לכימות שלאחר מכן. הבדיקה מבוססת הקרינה המתוארת כאן מספקת דרך לשלול אות אוטופלואורסצנטי על ידי חיסור ערוץ דיגיטלי. בדיקת TUNEL, המשמשת עם טכניקות ובקרות מתאימות לעיבוד רקמות, היא שיטה כמותית מהירה יחסית, ניתנת לשחזור לזיהוי אפופטוזיס ברקמות. ניתן להשתמש בו כדי לאשר נזק ל-DNA ואפופטוזיס כמנגנונים פתולוגיים, לזהות סוגי תאים מושפעים ולהעריך את יעילותם של טיפולים טיפוליים in vivo.

מבוא

dUTP Terminal transferase deoxynucleotidyl (TDT) תיוג ניק הסוף (TUNEL) הוא התהליך של שימוש באנזים TDT לצרף dUTP 3 'מסתיים כפול ודנ"א חד-גדילים שוברים ^12,23. שיטת TUNEL לגילוי נזק אפופטוזיס ו- DNA דווחה לראשונה לפני למעלה מ -20 שנים על ידי et al גבריאלי. ^1,12,24. זה מאז העריך ומותאם בהכנות רקמות שונות ^7,23,27,40. TUNEL נעשה שימוש כדי ללמוד מוות מושרה איסכמיה תא של הנוירונים ^6,14,29 וcardiomyocytes ^43,44, מוות של תאים עצביים הפעלת יתר רעיל ^30,31, וכסמן ביולוגי לטיפול בדלקת פרקים ^39. כמו כן, שמש כגורם מנבא וסמן תאים סרטניים בסרטן בבני אדם שונ....

פרוטוקול

הערה: נהלי כל החיה שתוארו בפרוטוקול זה בוצעו בהתאם להמלצות במדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה של המכון הלאומי לבריאות ^26. הפרוטוקול (MO13M391) אושר על ידי ועדת אוניברסיטת הטיפול בבעלי חיים והשימוש בג'ונס הופקינס.

קורבן 1. ילודי עכבר, Dissection, וקיבוע

1. להקריב את העכבר בילוד משאיפת CO _2.
2. מנותק מייד hindlimb מעל הברך. עד שיום כ 7 לאחר הלידה, עצמות הרגל רכות מספיק כדי לחתוך דרך במספריים מעבדה ....

תוצאות

עם כתמים מוצלחים, אות TUNEL החיובי צריכה להיות בהירה מספיק כדי לבודד מautofluorescence על ידי קביעת סף עוצמה. אובייקטי TUNEL החיוביים בהגדלה נמוכה עשויים להופיע ברים סדירים בהירים כמו בשרירי שלד (איור 1 א). עם זאת, בהגדלה גבוהה יותר, כמה חפצי TUNEL חיובי עם המורפולוגיה אפופטוטיים הקלאסית יש לשים לב, אם סוג המוות של תאים המעורבים הוא אפופטוזיס (איור 1). הבקרה החיובית (DNase הוסיף) צריכה להפגין אות TUNEL החיובי בשפע, מפוזרת באופן אחיד על פני כל הרקמ.......

דיון

שיטה לאיתור ולכמותית לנתח אפופטוזיס הקשורים נזק ל- DNA בשרירי שלד עכבר מתואר. ההליך כולל קצירת רקמה, צביעת TUNEL, רכישת תמונה דיגיטלית, וניתוח תמונה. אספקה ​​היסטולוגית משותפת וכלים נחוצים, וערכת TUNEL מסחרית מיוחדת היא הכרחית. פריטי הציוד הגדולים החיוניים הדרושים הם מערכת מחשב לניתוח תמונה cryostat, מיקרוסקופ epifluorescent עם יכולת תמונה דיגיטלית, ו.

הנסיין צריך להיות מודע לבעיות פוטנציאליות. autofluorescence ר.......

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
4% פרפורמלדהיד במי מלח חוצץ פוספט	מיקרוסקופיה אלקטרונית	19202	עבור הליכים המתוארים כאן, תמיסה של 4% הוכנה טרייה מאבקה. ניתן להשתמש בפרפורמלדהיד מכל ספק. יש לאחסן תמיסת פורמלדהיד מוכנה בטמפרטורה של 4 מעלות; C ואין להשתמש בו לאחר תאריך התפוגה שלו (עד מספר חודשים). פרפורמלדהיד הוא חומר מסרטן ורעלן בשאיפה ובמגע עם העור. אנא פעל לפי אמצעי הזהירות המפורטים ב-MSDS בעת טיפול בפרפורמלדהיד.
סוכרוז	סיגמא	S0389	משמש להגנה על רקמות בהקפאה לפני הקפאה. ניתן להשתמש בסוכרוז מכל ספק.
תרכובת O.C.T.	Tissue-Tek	4583	מדיום הטמעה להקפאה.
Cryostat	Leica	CM 3050S	קריוסטט CM3050S Leica שימש להכנות המתוארות כאן. כל קריוסטט המסוגל לחתוך 10 μ ניתן להשתמש במקטעים מ '.
מגלשות זכוכית, 25 x 75 x 1 מ"מ	פישר	12-552-3	ניתן להשתמש בשקופיות מכל ספק.
ג'לטין	סיגמא	G-9391	ג'לטין משמש לקידום הידבקות חתך רקמות לשקופיות זכוכית. לציפוי שקופיות זכוכית בג'לטין, ממיסים 2.75 גרם ג'לטין ו-0.275 גרם אלום כרום ב-500 מ"ל מים מזוקקים, חמים ל-60 מעלות; ג, טובלים שקופיות למשך מספר שניות ומניחים להתייבש. ניתן להשתמש בג'לטין מכל ספק. לחלופין, ניתן לרכוש שקופיות מצופות ג'לטין.
כרום (III) אשלגן גופרתי דודקהידראט (אלום כרום)	סיגמא	243361	אלום כרום מתווסף לתמיסת ג'לטין כדי לקדם הידבקות רקמות על שקופיות זכוכית. זהו חומר מסרטן אפשרי ורעלן בשאיפה ובמגע עם העור. אנא פעל לפי אמצעי הזהירות המפורטים ב-MSDS בעת טיפול באלום כרום.
מגיב הידבקות רקמות Vectabond	Vector Labs	SP-1800	מצע אופציונלי להדבקה טובה יותר של רקמות לשקופיות זכוכית; ניתן להשתמש במקום זאת בשקופיות מצופות ג'לטין.
Tween20	Sigma	P9416	חומר ניקוי המשמש לחדירת רקמות. ניתן להשתמש ב-Tween20 מכל ספק.
Triton X100	Sigma	T8787	חומר ניקוי המשמש לחדירת רקמות. ניתן להשתמש ב-Triton X100 מכל ספק.
ערכת זיהוי אפופטוזיס TACS 2 TdT fluorescein in situ	Trevigen	4812-30-K	לתיוג TUNEL מבוסס פלואורסצנטי.
DNase/nuclease	Trevigen	4812-30-K	(כלול בערכה)
DNase/nuclease buffer	Trevigen	4812-30-K	(כלול בערכה)
10x פוספט חוצץ מלח (PBS), pH 7.4	Amresco	780	הכינו 1x PBS לשטיפות ודילול. ניתן להשתמש ב-PBS מכל ספק.
מים ללא DNase	איכות ביולוגית	351-029-131	ניתן להשתמש במים מכל ספק.
Hoechst 33258	Sigma	94403	צבע גרעיני. ניתן להשתמש בכל צבע גרעיני פלואורסצנטי כחול. כצבע קושר DNA, הוכסט חשוד כמסרטן ויש לטפל בו עם ציוד מגן כדי למזער מגע עם העור.
Parafilm M	מרובה	807	ניתן להשתמש בכל סרט הידרופובי אחר או פתק כיסוי. זמין ממספר ספקים.
במיקרוסקופ פלואורסצנטי עם מצלמה דיגיטלית		-	-ניתן להשתמש בכל מיקרוסקופ פלואורסצנטי המסוגל ללכוד דיגיטלית פלואורסצנטיות אדומה, ירוקה וכחולה בערוצים נפרדים.
במדיה נגד דהייה של Vectashield	Vector Labs	H-1000	Antifade Media מכל ספק.
כיסויי זכוכית, עובי מס' 1	מעבדות מחקר מוח	2222-1	ניתן להשתמש בפתקי כיסוי מכל ספק. הגודל הקטן ביותר של 22 על 22 מ"מ מספיק לקטעי רגלי עכבר יילודים.
לק	טד פלה	114-8	משמש לאיטום כיסויים. ניתן להשתמש בלק מכל ספק (כולל קמעונאים רגילים). הימנע משימוש בלק עם צבע או תוספים שעלולים להחזיר אור במהלך הדמיית פלורסנט.

מדעי ערכה מסחרית ניתן להשתמש --ניתן להשתמש