עשה ואל תעשה של מיקרוסקופ אלקטרוני cryo-: פריימר על הכנת דוגמאות וגבוהה איסוף נתונים איכות לשיקום Macromolecular 3D

סיכום

מאמר זה מתאר את מתודולוגיית המיקרוסקופיה הקריו-אלקטרונית, המשמשת להשגת תמונות מיקרוסקופיות באיכות גבוהה של מקרומולקולות במצבן הכמעט טבעי. השיטה מניבה תמונות המתאימות לעיבוד ממוחשב נוסף בגישת החלקיק הבודד, שתוכננה ליצירת שחזור תלת מימדי של מקרומולקולה.

תקציר

מיקרוסקופ אלקטרונים קריו-אלקטרונים (cryoEM) כרוך בהקפאת הבזק של שכבה דקה של דגימה על תומך, ולאחר מכן הדמיה של הדגימה במצב הקפוא שלה על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים שידור (TEM). ניתן להשיג זאת עם כמות נמוכה מאוד של חלבון ובמאגר הבחירה, ללא שימוש בכתמים כלשהם, וזה שימושי מאוד לקביעת מתאמים בין מבנה-תפקוד של מקרומולקולות. בשילוב עם עיבוד תמונה של חלקיק בודד, הטכניקה מצאה תועלת נרחבת לקביעה מבנית תלת מימדית של מקרומולקולות מטוהרות.

הפרוטוקול המוצג כאן מסביר כיצד לבצע cryoEM ובוחן את הגורמים לבעיות הנפוצות ביותר לפתרון בעיות רציונליות; ביצוע כל השלבים הללו אמור להוביל לרכישת תמונות cryoEM באיכות גבוהה. הטכניקה דורשת גישה למכשיר מיקרוסקופ אלקטרונים ולמכשיר זיגוג. יש צורך בידע במושגים ובתוכנות של שחזור תלת מימד גם לעיבוד תמונה ממוחשב. חשוב לציין, תוצאות באיכות גבוהה תלויות במציאת תנאי הטיהור הנכונים המובילים לאוכלוסייה אחידה של מקרומולקולות שלמות מבחינה מבנית.

היכולת של cryoEM לדמיין מקרומולקולות בשילוב עם הרבגוניות של עיבוד תמונה של חלקיק בודד הוכחה כמוצלחת מאוד לקביעה מבנית של חלבונים גדולים ומכונות מקרו-מולקולריות במצבם הכמעט טבעי, זיהוי מרכיביהם המרובים על ידי מיפוי הפרשים תלת מימדי, ויצירת מבנים פסאודו-אטומיים על ידי עגינה של מבני רנטגן. הפיתוח הבלתי פוסק של מכשור cryoEM וטכניקות עיבוד תמונה ב-30 השנים האחרונות הביא לאפשרות ליצור שחזורים תלת מימדיים דה נובו ברמת רזולוציה אטומית.

מבוא

המטרה של cryoEM היא להשיג תמונות מיקרוסקופיות אלקטרונים של מקרו-מולקולות במצב התייבשות האם שלהם. מכוח הטבעת מקרומולקולה במים מזוגגים, מדגם קפוא hydrated יכול להיות הציג ישירות ומדמיין במכשיר TEM. Vitrification, השיג הבזק הקפאה (10,000 C / sec ^o) על ידי, מקפיא את המדגם מבלי התגבשות מים ומבטיח כי ארגון מחדש מולקולרי במהלך ההקפאה הוא חסרי משמעות. העודף של פיזור אלקטרונים של המדגם ביחס לחיץ סביב מספק ניגוד קטן אבל מספיק לראות את מקרומולקולה בהעדר כל כתם ^1. עיבוד תמונה ממוחשב לאחר מכן ניתן להשתמש כדי לשחזר מבנה 3D של מקרומולקולה. מקרו-מולקולות גדולות בטווח ~ 500 מד"א הרב kDa- הן דוגמאות אידיאליים עבור cryoEM (המייצגות למעלה מ- 80% מהגדה נתונים מיקרוסקופית אלקטרונים (EMDB) כניסות); אלה כוללים חלבונים, קומפלקסי חלבונים, חלבון חומצות גרעין גomplexes, וחלבוני קרום משובצים בbilayer. מקרו-מולקולות אלה הם פחות סיכוי להיות מגובש (עם פחות מ -2% ערכים במסד נתוני PDB) עדיין זה קורה לעתים קרובות שחתיכות קטנות יותר לפתרון על ידי קריסטלוגרפיה רנטגן או NMR ניתן לעגן למעטפת 3D נוצרה על ידי cryoEM. מצד השני, חלק מהמבנים הגדולים ביותר נפתרו על ידי cryoEM ניתן לזהות בתוך התא המלא בסעיף דק TEM ^2. לפיכך, cryoEM יעילות מגשר על הגודל ורזולוציה הפער בין מבני subcellular והאטומיים.

CryoEM משקף מבנה טוב יותר של מקרומולקולה ילידים מאשר בשיטה הקלאסית יותר של מכתים שלילי (NS), שבו מקרומולקולה מיובש ומוקף בשכבה של כתם מתכת כבד לפי אזור הדרת כתם יוצר תמונה מאוד בניגוד "שלילית" ^3. בשני המקרים אלומת האלקטרונים מפיקה תמונות 2D השלכה של מקרו-המולקולות, חלקיקים הנקראים, שבו יםhape תלוי בכיוון של מקרומולקולה ביחס לאלומת האלקטרונים. חלקיקים רבים, לפחות ~ 1000 וללא גבול עליון, ניתן לנתח במחשב עם 'ניתוח יחיד חלקיקים "(SPA) תוכנה כדי להגדיל את יחס האות לרעש (SNR) אם כי מיצוע, ולמצוא פרמטרים ההתמצאות במרחב של החלקיקים צורך לשחזר 3D המבנה של הפולימר מצוי על ידי ^4-7 הקרנה אחורית. NS, עם יחס אות לרעש גבוה יותר, משמש לאפיון מדגם ראשוני וליצור דה נובו שחזור 3D; הרזולוציה שלה לעתים רחוקות עולה על 20 א ', שמוטל על ידי ההתייבשות והגודל של גרגר המתכת הכבד. באופן כללי, לקביעה מבנית cryoEM 3D, שחזור 3D ברזולוציה נמוכה מתקבל ראשונה מNS ולאחר מכן cryoEM משמש כדי לחדד את המפה ראשונית ברזולוציה נמוכה זה כדי ללמוד עוד מקרומולקולה במדינת hydrated המקורי שלו, כדי לראות את המבנה הפנימי שלה, וכדי להגדיל את הרזולוציה שלה. לאte שאם מודל NS היה מעוות (הדוגמא הנפוצה ביותר היא ההשטחה כתוצאה מהתייבשות ⁸⁾ והיו לי חלקיקי cryoEM SNR הנמוך, אז העיוות יכולה לשאת לתוך מודל cryoEM (חפץ המודל-משוא פנים, שהוא נפוץ בSNR הנמוך מערכי נתונים ^9). עיוות מבנית תביא לחוסר התאמה בין NS וחלקיקי גלם cryoEM ובין חלקיקי cryoEM גלם והתחזיות מקבילה של מודל 3D מאונך לכיוון השיטוח. הטיה דגם עשויה לפתור בעצמו כמודל 3D עובר מחזורים רצופים עידון. צריך שלא יתרחש, שיזוהה כחוסר התאמה בין חלקיקי גלם cryoEM ותחזיות המקבילה ממודל 3D, אז מודל דה נובו צריך להיות בנוי מנתוני cryoEM. גישה טובה יכולה להיות לשימוש באלגוריתם הזוויתי הכינון מחדש ^10, אשר עשוי להניב כמה כרכי 3D אפשריים, ולאחר מכן להשתמש במודל NS 3D כדי לבחור את מודל cryoEM הטוב ביותר האפשרישיהיה מעודן ¹¹ נוסף. אסטרטגיה אפילו טובה יותר היא להגדיל את יחס האות לרעש של בסיס נתוני cryoEM (ראה סעיף ייעודי בדיון).

יש האיכות ביוכימיים של מקרומולקולה המטוהר השפעה מירבית בתוצאה הסופית. מקרומולקולה, מטוהר מרקמות או באו לידי ביטוי במערכות Heterologous, צריך להיות ברמה גבוהה של טוהר ולהיות מבני בשלמותה. זה צריך לא ליצור אגרגטים ולא צריך את זה disaggregate. כדי להגדיר קונפורמציה מסוימת, תנאי ההכנה צריכים לקדם מדינת קונפורמציה אחידה. ללמוד מתחמים, זה אופטימלי _שD k הוא בטווח ננומטר, אחרת fixatives שימש בהצלחה לייצוב אינטראקציות זיקה נמוכה ^12,13.

תמונות cryoEM לא מעובדות להניב מידע רב ערך על הממדים, קווי המתאר כלליים, מצב צבירה / multimerization, הומוגניות, ומבנה פנימי של macromolecule. אף על פי כן את הפוטנציאל של הטכניקה הוא משופר בהרבה עם עיבוד תמונה. מבנה 3D מגלה ארכיטקטורה הכוללת של מקרומולקולה, מיקום 3D של הליגנדים ויחידות משנה, שינויי קונפורמציה, ומאפשר עגינה של מבנים אטומיים נקבעו על ידי קריסטלוגרפיה רנטגן או NMR. כמות המידע של שחזור 3D מגדילה בשלבים כפי שהרזולוציה גדלה: ברזולוציה גנרל 15-20 מאפשרת עגינה חד-משמעית של מבנים אטומיים, ב9-10 סלילי אלפא נראה כמוטות, בשעה 5 Å ניתן להבחין גיליונות בטא, ובהחלטות של 3.5 ויותר טובים שאפשר לבנות מודל אטומי ^14.

האפשרות לקבל תמונות אינפורמטיבי ושחזור 3D באמצעות SPA מכמויות קטנות יחסית של מדגם לעשות cryoEM טכניקה אטרקטיבית, כמו 3-5 μl של לפחות 0.05 מ"ג / מיליליטר מספיקים כדי להכין את רשת TEM אחד. דרישות מינימום אינסטרומנטלילcryoEM הם cryo-בוכנת תוצרת בית או מסחרי, מיקרוסקופ אלקטרונים עם ואקום גבוה במיוחד, תקשורת הקלטת תמונה וערכה במינון נמוך, cryo-בעל עם תחנת השאיבה שלו, מנגנון הפרשות זוהרים, ומאייד. תכונות שאינן חיוניות, אך רצויות נוסף על TEM הן מצלמת CCD (קיים בכל TEMs המודרני) או גלאי אלקטרונים ישירים, אקדח פליטת שדה (FEG), סינון אנרגיה, ותוכנה לאיסוף נתונים תפוקה גבוהה. תוכנה בעיקרון זה מאפשרת איסוף עשרות אלפי חלקיקים במושב cryoEM יחיד ^15, אולם לצרכי אחסון נתונים המוגבר וצורך זמן שלאחר עיבוד בפיקוח לאחר להילקח בחשבון. FEG בשילוב עם פונקצית העברה בניגוד תיקון (CTF) עומד בבסיס רוב שחזורי 3D שהגיעו רזולוציה מספיקה כדי להמחיש סלילי אלפא. בשלב זה, את רמת הרזולוציה היא גם מדגם תלויה: הגיע 10 רזולוציה A הוא פחות נפוצה לחלבוני קרום ואילו אםסדר גבוה של סימטריה קיים אז הרזולוציה אטומית היא ברת השגה יותר. הפיתוח האחרון של גלאי אלקטרונים ישירים אפשר רזולוציה אטומית אפילו למקרו-מולקולות עם סימטריה נמוכה (4x) או לא, שבו האיכות של מפות צפיפות האלקטרונים cryoEM תואמת נגזרים אלה מנתוני רנטגן עקיפה ^16,17.

דוגמאות מעשיות הממחישות את היכולות של הטכניקה מובאות כאן כארבעה סוגים חשובים של מקרו-מולקולות שבי cryoEM יש תפקיד ראשי בהמשך הנחישות המבנית שלהם. (I) עם הסימטריה icosahedral שמגדילה את בסיס הנתונים של פי 60 וגודל שלהם גדול המאפשר נאמן ויישור לשחזור, המבנים של כמה וירוסי icosahedral נפתרו לרזולוציה כמעט אטומית על ידי cryoEM אחרי SPA ^18. אנחנו מראים דוגמא של כיתה של וירוסי icosahedral, adeno הקשורים וירוסים (AAVs), שלמבנים ליד-אטומיים על ידי cryoEM ועל ידי HY / רנטגן cryoEMשיטות Brid קיימות ^19,20. (Ii) מקרומולקולות עם מבנה סליל כוללת microtubules, חוטים ווירוסים. יחידות החוזרות על עצמן לאורך ציר הסליל יכולות להיות מנותחות על ידי גרסה מורכבת יותר של SPA המותאם לגיאומטרית הסליל ^21. בדוגמא שאנו מציגים וירוס טבק פסיפס (TMV), וירוס RNA שנפתר לרזולוציה אטומית על ידי ²² cryoEM. (Iii) חלבונים מסיסים גדולים נחקרו בשפע. בין אלה, מקרו-מולקולות ויוצרות גלילי Multimeric סימטריים מהוות ארכיטקטורה חוזרת לעתים קרובות לפתור ברזולוציה subnanometer ^23,24. כאן אנו מראים תמונות של KLH, מוביל חמצן חסר חוליות, שבו מודל מולקולרי היברידי נוצר משיטות היברידיות קריסטלוגרפיה cryoEM / רנטגן ^25. (Iv) חלבוני ממברנה הם מעמד חשוב של חלבונים; הם מהווים כ- 1/3 מהחלבונים מקודדים על ידי הגנום האנושי, אך הם קשים לאפיון מבני בשל מורכבות הקשורים trייצוב ansmembrane תחום ^26, ומהווה פחות מ -1.5% מהמבנים נפתרו על ידי כל טכניקה מבנית בשילוב. התפקיד של שיקום cryoEM ו3D בנחישות המבנית שלהם בא לידי ביטוי עם קולט ryanodine (RyR), Ca ^{2 +} ערוץ תאיים אוקריוטים גדול חשוב בהתכווצות שרירים ואיתות המוח. מבני cryoEM הרזולוציה הגבוהים ביותר עד כה, עם 10 רזולוציה Å, לחשוף מבנה משני ^27.

פרוטוקול

1. קריו בעל הכנה ותחזוקה

הערה: תחנת השאיבה היבשה, בהיקף של תחנת שאיבה טורבו ובקרים קרים שלב אחד או יותר, משמשת בעיקר לשלוש מטרות: א) זה הוא מקום בטוח לאחסון בעלי cryo כאשר הם לא בשימוש. הדרך הנכונה כדי לאחסן את הבעלים היא להשאיר אותם בתחנה תחת ואקום. ב) כדי להתאדות הצטברות הכפור ולחות המתרחשת כאשר החנקן הנוזלי הוא להסיר את דיואר וקצו של בעל cryo חשוף; זו מושגת עם מחזור החימום. ג) כדי להתחדש יבוש זאוליט, וכדי להשיג את ואקום גבוה בDewars cryoholder. זה הכרחי לקיום טמפרטורה קבועה כאשר עושה במיקרוסקופ האלקטרונים cryo.

1. מחזור חימום.
   1. הכנס את בעל cryo לאחת מיציאות השאיבה של תחנת השאיבה. להתחבר אחד צינורות הפינוי לשקע מתכת מתחת לשסתום הוואקום של בעל. הפוךבטוח שכל השסתומים בתחנה (V1, V2, וV3) ועל בעל cryo סגורים.
   2. הפעל את בקר השלב הקר ולחבר אותו לבעל באמצעות כבל השליטה. הפעל את מתג ההפעלה של תחנת השאיבה טורבו.
   3. התחל את אפשרות מחזור ההתחממות בבקר השלב הקר. כאשר הוואקום בתחנת השאיבה טורבו קורא 10 ^-3 Torr או טוב יותר, לפתוח את V2 שסתום הפרפר, לחכות עד שהאבק יתייצב, ולאחר מכן פתח את V1 שסתום פרפר.
   4. הפעל את המחזור החם לכ -30 דקות עד שהטמפרטורה בבעל יציבה מעל C ° 20. V1 הקרוב, ולאחר מכן להפסיק את המעגל.
2. מחזור זאוליט. הפעל את מחזור זאוליט בין 4 שעות וO / N לפני מושב CryoEM, ופעם בשבוע אם לא בשימוש.
   1. התחל את אפשרות מחזור זאוליט ובחר את הזמן הדרוש כדי להגיע לואקום טוב, בטווח של 1-2 x 10 ^-4 Torr, וזמן המתנה ארוך ובכך. כאשר הוואקום מגיע 10 ^-3Torr, פתח את שסתום פינוי דיואר, V3. אז תחנת השאיבה תפנה את הקו לבעל; לחכות עד שהאבק יתייצב.
   2. פתח את השסתום על בעל cryo. כאשר המחזור יושלם, לסגור את השסתומים בסדר ההפוך שבו הם נפתחו: השסתום על בעל, אז V3, V2, ולבסוף V1. כבה את תחנת השאיבה טורבו ובקר השלב הקר, ונתק את בעל cryo מן הבקר השלב הקר ותחנת השאיבה טורבו.

2. הכנת רשת

1. ניקוי.
   הערה: בעת שימוש רשתות מחוררות מסחריות, מומלץ לנקות אותם לפני השימוש, כדי להסיר כל פולימר שייר ששימש בתהליך הייצור. לעשות את זה בצלחת פטרי מזכוכית עם 5 שכבות של נייר סינון הניחו בתחתית.
   1. הנח את הרשתות על נייר הסינון עם צד פחמן המחורר פונה כלפי מעלה.
   2. בעזרת פיפטה פסטר זכוכית, להרטיב את הנייר עם כמה טיפות oכלורופורם f סביב הרשתות עד שהם פשוט להתחיל צפים.
   3. מכסה את צלחת פטרי עם המכסה פתוח מעט בN / O מנדף.
2. הערה: תמיכת פחמן הדק (שלבים 2.2-2.3) ניתן להשמיט כשכבת הקרח יכולה להיווצר ישירות מול החורים הקטנים בפחמן הרשת המחוררת.
   1. באמצעות פינצטה, לדבוק פיסה נציץ לחשוף שני משטחים חדשים. מניחים את המשטחים החשופים החדשים של פנים כלפי מעלה נציץ על פיסת נייר לבנה בצלחת פטרי.
   2. מניחים את צלחת פטרי בצנצנת הפעמון של מאייד פחמן. התחל רצף המשאבה למטה עד ואקום הוא מתחת ל -2 x 10 ^-6 Torr. להתאדות כל זיהומים על פני השטח של מוט פחמן, לבצע מראש אידוי עם צלחת פטרי המכוסה. לאחר מכן ישודר צנצנת הפעמון והסיר את הכיסוי מצלחת פטרי.
   3. בצע את רצף המשאבה למטה עד הוואקום הוא מתחת ל -10 ^-6 ומעיל Torr נציץ בשכבה דקה (~ 5 ננומטר) של פחמן. השתמש במשקפי מגן במהלך פחמןאידוי. לפקח על העובי של סרט פחמן על ידי החושך וכתוצאה מכך על הנייר שהונח מתחת לסדינים נציץ.
3. העבר את פחמן הדק לרשת TEM.
   1. חותכי פיסת נציץ מצופה 0.5 x 1 סנטימטר ולרחף מעל פחמן על גבי המשטח השטוח של מים מסוננים דה המיונן,. השתמש בנייר עדשה אופטי כדי לקבל פני מים שטוחים. באמצעות פינצטה, לשים בצד פחמן המחוררת של הרשת במגע עם פני השטח העליונים של שכבת פחמן צף ולהרים אותו.
   2. חזור על שלבי 2.3.1 ו2.3.2 עד מספר מספיק של רשתות מוכנים.
4. זוהר פריקה.
   הערה: ההפרשות זוהרת ממירה את שכבת פחמן ציפוי טבעי הידרופובי של הרשתות להידרופילי. שלב זה הוא אופציונאלי.
   1. הנח את הרשתות עם צד פחמן פונה כלפי מעלה בשקופית זכוכית 7.5 x 2.5 סנטימטר מכוסה Parafilm. למקם אותו לתוך התא של ציוד זוהר פריקה ולסגור את התא.
   2. משאבהצנצנת הפעמון וזוהר פריקה למשך 20 שניות במהירות של 25 מילי-אמפר ו -7 x 10 ^-2 mbars.
      הערה: במהלך תקופה זו זוהר סגול אור הופך לגלוי. הסר את שקופיות זכוכית עם הרשתות ולהשתמש בם בתוך שעות 1, אחרת, הם יצטרכו להיות זוהר שוחרר שוב.

לצלול-הקפאת 3. דוגמא

הערה: השתמש במשקפי מגן ונעליים מתאימות בעת שימוש במכשיר זה כדי להגן מפני כתמי חנקן ואתאן נוזליים.

1. הפעל את מנגנון הקפאה-לצלול. מלא מאגר אדים עם מים מזוקקים. הגדר את הטמפרטורה הרצויה, לחות היחסית ותנאי צלילה לזמן כתם, כוח למחוק וזמן ספיחה (22 ° C, 95%, 2 שניות, 2 ו -40 שניות בדוגמא המובאת כאן). מניחים נייר סינון סופג חדש.
2. לקרר את מיכל אתאן על ידי מילוי המאגר החיצוני עם חנקן נוזלי עד יציבות מושגת (כ -10 דקות). ברגע שהחנקן הנוזלי מפסיק רתחg, מקום הקצה של הצינור המגיע ממכל אתאן בחדר הפנימי ולפתוח את השסתום באיטיות רבה. נזל אתאן בחדר הפנימי ולמלא אותו עד 1 מ"מ מהחלק העליון. הימנע מהקפאת אתאן. זהירות: אתאן מאוד דליק ונפיץ.
3. הפוך פינצטה בטוחה מיושרות בתוך מנגנון ההקפאה לצלול.
4. הפעל לחות. לטעון רשת על פינצטה, ולטעון 3-5 μl של מדגם על פני השטח פחמן (צד משעמם) של הרשת המחוררת. חכה למדגם לספוג לרשת ולבצע הסופג כדי להשיג שכבת נוזל דקה.
5. Flash-להקפיא את הרשת על ידי צולל אותו לאתאן הנוזלי. הסר את מכלול פינצטה-הרשת מאתאן הנוזלי מחזיק פינצטה בהתמדה, ולהעביר אותו לחדר החיצוני עם חנקן נוזלי. העבר את הרשת לתיבת רשת קטנה שקועה בחנקן הנוזלי. הקפד לשמור מדגם המזוגג בחנקן נוזלי כל הזמן בזמן העברה או מיכל האחסוןאו לבעל cryo.
   ניתן לאחסן קופסות רשת בדיואר חנקן נוזלי קיבולת גדולה (35-50 ליטר) במשך לפחות 1 שנה: הערה. לאחסון נוח הם יכולים להיות ממוקמים בשפופרת 50 מיליליטר פלקון עם שני חורים שנקדחו בראש וחוט דיג המחובר לכובע שלה שיכול להיות משך מפיו של דיואר.

4. מעבירים את קריו הרשת לTEM

1. הכנס את בעל cryo לתחנת העבודה cryo-ההעברה. הקפד שלא לפגוע בקצו של בעל במהלך החדרה. לבדוק את קיומו של סיבים קטנים ואבק על המוט וO-הטבעת של בעל cryo באמצעות זכוכית מגדלת, אם יש להסיר אותו עם נייר עדשה אופטי.
2. מלא את דיואר של בעל cryo וכלי העבודה עם חנקן נוזלי. הימנע משפיכת החנקן הנוזלי על ידי שימוש במשפך הלכודים שמגיע עם תחנת העבודה.
3. חבר את בעל cryo לבקר שלב הקר כדי לפקח על הטמפרטורה, ולשמור על הוספת נוזל חנקן & #160; עד שהטמפרטורה מתייצבת בסביבות -194 מעלות צלזיוס. ודא שרמת החנקן הנוזלי היא מתחת לרמה של חותם הוואקום הן בכלי העבודה ודיואר בעל cryo. טרום מגניב פינצטה הרשת, טבעת קליפ והקצה הקהה של כלי טבעת קליפ בתחנת העבודה. גם טרום מגניב סט של פינצטה הגדולה ומברג בדיואר נוסף מלא עם חנקן נוזלי.
4. במהירות להעביר את תיבת רשת cryo המכילה רשתות hydrated קפואות לחנקן הנוזלי בתחנת העבודה באמצעות פינצטה הגדולה. פתח את תיבת רשת cryo עם המברג, לקחת את רשת hydrated קפואה ולמקם אותו לתוך חריץ בעל מדגם.
5. מניחים את טבעת קליפ על גבי הרשת ולחץ בעדינות אותו עם הקצה הקהה של כלי טבעת קליפ עד אשר תתייצב במקום. סגור את cryo-התריס. הסר את תיבת כלים וcryo רשת מתחנת העבודה.
6. להעביר את כל תחנת העבודה עם בעל ורשת לקונסולת מיקרוסקופ כדי מינימייז זמן ההעברה של הרשת באוויר חדר.
7. הדף את אנטי-contaminator TEM עם חנקן נוזלי, שהיה מלא בעבר והתקרר לפחות 20 דקות. Pre-להטות את הבמה מיקרוסקופ ל -60 מעלות.
   הערה: זה יהיה למזער אובדן של חנקן נוזלי כבעל מוכנס לתוך מנעל האוויר.
8. להתחיל את מחזור מנעל אוויר מראש משאבה במיקרוסקופ. ודא שהסתום לתותח האלקטרונים סגור (במיוחד אם היא TEM FEG). חכה לרצף מנעל האוויר מראש המשאבה לסיים (כ -2 דקות) לפני הכנסת בעל cryo.
   הערה: זה מצויינים על ידי האור האדום שבכיבו את הבמה.
9. הכנס את בעל למנעל האוויר ולסובב אותו 90 מעלות בכיוון השעון; חבור את כבל בקר שלב הקר לבעל cryo כדי לפקח על הטמפרטורה. חכה שוב עד שהנורית האדומה היא כיבתה ולסובב שתי במה ובעל בחזרה למצב של 0 ° להכניס את בעל להיי של TEMטור ואקום GH.
10. לוודא כי הטמפרטורה לא עולה מעל -160 ° C, כדי למנוע היווצרות של גבישי קרח.
11. למלא את דיואר של בעל cryo. חכה 15-45 דקות, עד שבעלה equilibrated תרמית וואקום TEM התאושש לפני הקלטת תמונות.
12. אם מבעבע של החנקן הנוזלי מזוהה, לשנות את גובה מילוי חנקן הנוזלי, או לגעת בעדינות במקור המבעבע עם מקלון צמר גפן.

איסוף נתוני 5. במינון נמוך

הערה: טכניקת איסוף הנתונים במינון הנמוך משמשת כדי למזער את נזקי קרינת אלקטרונים לדוגמה על ידי הגבלת החשיפה לאלקטרוני ^20/2. זו מושגת על ידי לסירוגין בין שלוש תצורות: "חיפוש", עם ההגדלה נמוכה (~ 5,000X) ושדה ראיה רחב, "פוקוס", עם ההגדלה גבוהה (~ 150,000X) ושדה קטן של תצוגה, ו" חשיפה ", עם Magni הסופי הרצויfication ומכיל השטח של עניין שיירשם. בלנק הקורה בין מצבים.

1. הגדרת TEM ותכנית במינון נמוך
   1. לחזור בי cryo-התריס ולפתוח את שסתומי העמודה.
   2. מרכז את הבמה ולהגדיר את גובה eucentric (Z) באמצעות wobbler אלפא לטלטל את הבמה ± 15 °. להתאים את מיקום Z עד אין תנועה ניכרת ואילו השלב מתנדנד. הפעל את התכנית במינון הנמוך ובחר את הגלאי לכל מצב.
   3. במצב חשיפה למצוא שטח של הרשת שאין לו פחמן, להתאים את התאורה על ידי בחירת גודל צמצם הקבל ונקודה האופטימלי, כך שהאזור שיירשם מואר באופן מלא. הקפד להפיץ את הקורה בכיוון overcondensation.
   4. במצב חיפוש, למצוא תכונה קטנה שתהיה קל לזיהוי בהגדלה גבוהה יותר. במצב חשיפה, מרכז תכונה זו עם ג'ויסטיק (בקר שלב XY). התחל בהגדלה נמוכה יותר אם featיור הוא לא בשדה הראייה.
   5. במצב חיפוש, להביא בתכונה זו למרכז השדה באמצעות פקדי שינוי תמונת XY במינון הנמוכים. עבור למצב חשיפה ולהעביר את התכונה לאורך ציר ההטיה באמצעות ג'ויסטיק עד שהוא מחוץ לאזור שיירשם (0.5-3 מיקרון). עבור למצב להתמקד ולמרכז את התכונה באמצעות פקדי שינוי תמונת XY. התחל בהגדלה נמוכה יותר אם התכונה היא לא בשדה הראייה.
   6. שמור את הקרן מרוכזת בכל העת.
2. איסוף נתונים
   1. לחזור בי cryo-התריס ולפתוח את שסתומי העמודה. הפעל את התכנית במינון הנמוכה.
   2. במצב חיפוש, לזהות רבוע רשת המכיל קרח דק ואחיד.
   3. בחר חור מתאים ולמקם אותו במרכז השדה. לעבור להתמקד במצב ולמקד את התמונה. אז underfocus התמונה בין 0.5-4.5 מיקרון.
   4. עבור למצב חשיפה ולהקליט את התמונה.
   5. תעבור למצב חיפוש ולחזור על צעדים 5.2.3-5.2.4.לנוע על פני כיכר רשת הימנעות מראש לחשוף חורים טובים שיירשם.
   6. לסיים את כיכר הרשת ולעבור לעוד אחד טוב.
   7. להתקין מחדש גובה (Z) ולהמשיך איסוף הנתונים.

תוצאות

ביצוע מדוקדק של כל שלבי הפרוטוקול שתוארו באיור 1 מאפשר הדמיה של מקרו-מולקולות קפוא התייבשות, שאינן מוכתם. תוצאות עבור ארבע דגימות נציג עם מאפיינים מבניים שונים מוצגות. התמונות המיקרוסקופיות שלהם מתקבלות על ידי השיטות של NS וcryoEM מושוות (איור 2). תמונות (i) NS של AAV5 לחשוף חלקיקים כמו וירוס-של כ -130 קוטר Å. דו-הקיום של מבנים ריקים ומלאים מתאים לשבור (המאפשר כניסת כתם) וcapsids מבני בשלמות, בהתאמה. CryoEM תערוכות מבנים אחיד ריקים; אכן חלקיקים הנגיפיים אלה אינם מכילים חומר גנטי ^28. NS תערוכות חלקיקים עגולים בולטים ואילו cryoEM תערוכות חלקיקים בעיקר משושה, המשקפות צורת icosahedral. (Ii) תמונות של מוטות תכנית TMV סליל בקוטר 180 A ואורך משתנה, לעתים קרובות יותר מ -0.1 מיקרומטר, עם חוזר סליל של 23 גלוי שניבNS ובcryoEM. הערוץ המרכזי 40 מלא בכתם בתמונות NS וריק בתמונות cryoEM. (Iii) Native KLH, didecamer של 8 מד"א, מרכיב בחביות אופייניות של 350 קוטר A ואורך 400. NS וcryoEM לחשוף KLH של צד נופים מלבניים ועגול סוף על-נוף. שני הטכניקות לחשוף שישה פסים בניצב לציר הסימטריה ויחידות מורפולוגיים במרווחים שווה בשווה בכל רובד. CryoEM מגלה מבנה פנימי ריק. (Iv) קולט Ryanodine, ערוץ תאיים tetrameric גדול של 2.26 מד"א, נתפס כריבוע של 275 x 275 ^2. תכונות פני השטח מורכבות כגון צלב מרכזי ודיכאון מרכזי מניפסט כהצטברות כתם על ידי NS, וכאזורי צפיפות נמוכים יותר על ידי cryoEM. בעוד NS תערוכות ניגוד דומה בכל ארבע דגימות שנבדקו, השוואה של לוחות cryoEM חושפת את יחס האות לרעש הנמוך (בניגוד) של RyR1 בשל נוכחותם של חומרי ניקוי לsolubilize חלבון קרום זה.

דוגמאות אופייניות של חפצי cryoEM מוצגות לRyR1: קרח גבישים, זיהום קרח, אסטיגמציה, ומבנים-כמו אינטרנט (איור 3). הסיבות שלהם ומניעה מתוארות נוספות בסעיף הדיון.

שחזור SPA ו3D של RyR1 קפוא hydrated חושף את המבנה שלה פי ארבעה סימטרי, המשקף הארגון של החלבון homotetrameric (איור 4 א). תחום cytoplasmic מהווה פריזמה מרובעת של 275 x 275 x 120 ³ ומכיל מספר תחומים כדוריים לשחזור יוצרים מבנה דמוי פיגום. תחום הטרנסממברני מהווה פריזמה מרובעת מחודדת קטנה יותר בממדים מרביים 115 x 115 x 60 ^3. בשעת 10 ברזולוציה Å אפשר לדמיין סלילי אלפא (איור 4). מיפוי הבדל 3D יכול לחשוף את המיקום של ligands החשוב, במקרה זה הבדל מפת 3D של FKBP12, conside 12 חלבון KDאדום למקטע של RyR1, הוא על גבי RyR1 (איור 4C) ^29. לבסוף, שינויי קונפורמציה לספק תצוגה דינאמית של מקרומולקולה. במקרה זה RyR1 התייצב בעבר בתנאים או סגורים או פתוחים מגלה טרנסלוקציה המונית מהסגורה למצב הפתוח (איור 4D) ^27.

באיור 1. תרשים זרימה של הטכניקה במיקרוסקופ האלקטרונים cryo. התרשים מדגיש את השלבים העיקריים של הפרוטוקול.

איור 2. השוואה של NS וcryoEM עבור מגוון רחב של דוגמאות. () AAV5, וירוס icosahedral. (B) TMV, וירוס סליל. ריבועים להראות חוזר הסליל, 23 א '. (ג) Native KLHRyR1 (D).; צפיות נציג מודגשות (ו, השקפה פי ארבעה ושל, מבט מצד). כל הדגימות הם צילמו בתנאים במינון נמוכים ובו בהגדלה של 50,000X תחת מתח מאיץ של 200 וולט. ברים סולם, 10 ננומטר. כל דגימות NS הן על תמיכת פחמן, דגימות cryoEM, C, D נמצאים על פחמן דק מעל quantifoil, ומדגם cryoEM B הוא ישירות על חורי quantifoil. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3. גלריה של תמונות מראים ממצאי cryoEM נפוצים על מדגם RyR1 cryoEM. (א) קרח. זיהום קרח (B) גבישים (חיצים). אסטיגמציה (C). RyR1s בתמונה astigmatic הם בקושי נראה. הבלעה בצד הימין מראה את הכח SPECTרום של התמונה עם טבעות Thon א-סימטריים. הבלעה משמאל מראה את כוח הספקטרום של תמונה שאינה astigmatic להתייחסות. מבנים (D) כמו אינטרנט. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4. שחזור CryoEM ו3D של הקולטן ryanodine. . (א) ייצוג Isosurface (B) עגינה של מבנה הגבישי של של RyR1 N-סופית ³⁰ מראה הסכם טוב בין הקואורדינטות האטומיות ואת מעטפת cryoEM; חיצים מצביעים על שני סלילי אלפא שיבלטו מהמבנה. ראש החץ מצביע על אחד מהסלילים ארבעת המקיפים את חור של ערוץ היון. הקווים מקווקווים מציינים את הגבולות של הקרום. (C) RyR1 ו3D loקטיון של יגנד FKBP12 (הצבע כתום). (ד) שינויי קונפורמציה של RyR1 בהולכים מסגור (הכתום) לקונפורמציה הפתוחה (השחורה רשת). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

דיון

TEM ואחרי SPA תרם רבים מבני 3D macromolecular, מתקרב 2,000 ערכים בEMDB עד אמצע 2014. באופן כללי, למקרומולקולה נתון, מבנה 3D ברזולוציה נמוכה נקבע תחילה מנתוני NS, אשר עשוי להיות מלווה גבוה יותר מבנה הרזולוציה cryoEM 3D. ניגודיות הגבוה של הגבולות המולקולריים הניתנים על ידי NS, המאפשר שחזור 3D הראשון, הוא מעודן מאוחר יותר על ידי cryoEM עם יכולתה כדי למפות את המבנה הפנימי של הפולימר מצוי במצב התייבשות המלאה שלה, וכן את האפשרות להגיע לרזולוציה גבוהה הרבה יותר. יתרון נוסף של cryoEM הוא החיסול של מתח התייבשות שעלולה לגרום לקריסה של מקרומולקולה. בנוסף, קיים האפשרות להשמיט את תמיכת פחמן, אשר מבטלת השפעות קליטת משטח אפשרי ומציגה את קונפורמציה שמקרומולקולה מאמץ בפתרון. צביעת קריו שלילית, שילוב של cryoEM וNS, מעניקה ניגודיות גבוהה בhyd מלאדירוג דגימה וגם יכול להוביל לשחזור 3D באמצעות SPA, אולם זה כבר נעשה שימוש בתדירות נמוכה יותר, עם פחות מ -10 ערכי EMDB, בין שאר משום שהכתם עצמו עלול להפריע לשלמות מקרומולקולה ^31. שתי טכניקות TEM אחרות תורמים לשחזור 3D הן קריסטלוגרפיה אלקטרון 2D וטומוגרפיה של האלקטרון. קריסטלוגרפיה אלקטרון 2D דורשת גביש מישוריים או צינורי; התאבכות האלקטרונים של הגביש המשמשת לשחזור 3D שעלול לגרום לרזולוציה אטומית ^32. בטומוגרפיה של האלקטרון של דגימות קבועות מזוגגות או מסורתיים, מרכיב מקרומולקולה או תת-תאי הוא הסתובב בתוך TEM לשיקום טומוגרפית הבא ^33, עם היתרון שניתן לשחזר אובייקטים ייחודיים; עם זאת כיום בטכניקה זו יש מגבלת רזולוציה נעה 40-20 Å ^34,35. בין כל טכניקות TEM מולקולריות אלה, SPA של נתונים NS וcryoEM היה נרחב ביותרבשימוש. הפרוטוקול המאויר כאן מוקדש לקבלת תמונות cryoEM מתאימות לניתוח SPA; אף על פי כן רוב הפרוטוקול גם לגבי גבישים ודגימות טומוגרפית cryoEM של 2D.

מושב cryoEM מוצלח תלוי בהצלחה בשילובם של רבים שלבים קריטיים; היבטים חשובים לזכור, הסבר של חפצי cryoEM הנפוץ וכיצד להימנע מהם מתוארים בסעיפים הבאים. סעיף זה מתאר גם הנחיות לאיסוף נתונים להשגת שחזורי 3D באיכות גבוהה תוך שימוש בשיטת SPA.

הימנע ממעבר לצח קרח. היבט מרכזי הוא שהמדגם צריך להישאר במדינת זגוגית מרגע לאורך תצפית TEM צולל-cryo. כך לאחר ירידה חדה במדגם אתאן הנוזלי בכל הצעדים הבאים מבוצעים בחנקן נוזלי (-196 ° C) או הליום נוזלי (-269 ° C) טמפרטורות. התחממות לעיל -135 מעלות צלזיוס הופכת מים זגוגית בלמים גבישים; אז שחלופי macromolecular עשויים להתרחש וגבישי מים שולטים בתמונה (איור 3 א); המדגם צריך להיות מושלך. מדגם חימום מקרי יכול לקרות אם cryo-צולל, העברת הרשת הקפואה בין מכולות (גם אם מוגן על ידי gridbox), ו / או הכנסת בעל cryo לTEM היא איטית מדי, או אם פינצטה הטיפול היתה מספיק מראש מקורר. הרעה משמעותית בואקום TEM על cryo-העברה (אוויר הנכנס מלכודות מדגם קרות חם יותר) יכולה גם לחמם את המדגם. לבסוף, על-הקרנה של המדגם יכול גם לגרום למעבר לצח, קרח.

למזער את זיהום קרח. בהתחשב בנפח הדגימה הקטן (3-5 μl) פנה לרשת TEM, אידוי יכול להתרכז רכיבי חיץ (מלח, חומרי ניקוי) ובכך להשפיע על שלמות macromolecular לרבות אובדן מדינת Multimeric. לעקוף או מייקרו-סביבת תא לחות היחסית גבוהה (RH)של בעיה זו. לחלופין cryo-צולל ניתן לעשות זאת בחדר קר סביבתי מאוורר במידה מספקת. לאחר RH צולל-cryo צריך להיות נמוך ככל האפשר על מנת למנוע זיהום קרח, או התעבות של לחות סביבה בcryo-הרשת, כמו cryo-הרשת עצמו פועל כמלכודת קרה. זיהום קרח מורכב מחלקיקים עם ניגודיות גבוהה ולא מסד עם גדלים הנעים בין 5 ~ ננומטר וכמה מיקרונים שמפריעים או אפילו לחלוטין לחסום את התמונה. הימנע טיוטות אוויר, מדבר / נשימה לקראת cryo-הרשת במהלך העברת אוויר, ולהפחית RH הסביבה. מכולות פתוחות חנקן נוזליים עם מים תמצית (נראים כמו חלקיקים מרחפים לבנים) גם צריכה להיות מושלכות.

מקסם אוריינטציות / צפיות macromolecular. לתמיכת מדגם, בחירה להתבצע היא בין רשתות המחוררת האמיתיות ופחמן דק על רשתות מחוררות. זה תלוי ב( i) איך המדגם משתרע על פני סרט פחמן לעומת חורי פחמן, (ii) conce מדגם זמיןntration, כמו חורים חשופים עשויים לדרוש ריכוז 100X גבוה מתמיכת פחמן לצפיפות חלקיקים דומה בתמונה (מ~ 0.02-2 מיקרומטר), ו- (iii) כיצד אקראי היא ההפצה של אוריינטציות מקרומולקולה. שים לב שהפרשות זוהרת, מה שהופך את הידרופילי פחמן, תהיה לכך השפעה חשובה בכל שלושת היבטים ושזה יהיה מדגם תלוי. לגבי הכיוון של מקרומולקולה, תוך מבט חוזר רצוי לקביעה המבנית הראשונית על ידי שחזור חרוטי אקראי, אקראית דעות macromolecular רצויה בעת שיפור שחזור 3D לרזולוציות גבוהות יותר. בדוגמא שלנו, RyR1 אינטראקציה עם פחמן עם נוף אהוב "פי ארבעה" (איור 2 ד) ודורש רשתות מחוררות לאקראיות של אוריינטציות ורזולוציה גבוהה יותר ^36.

למקסם את יחס אות לרעש. האסטרטגיה הטובה ביותר כדי להגדיל את יחס האות לרעש הוא להפחית את מקורות רקע של רעש. קרח מוגזםעובי ו( אם קיים) עובי סרט פחמן מעבר למה שנדרש כדי לתמוך ולהטביע את החלבון יוסיף רעש נוסף. כך עובי קרח צריך להיות מופחת למינימום הנדרש על ידי שליטה בזמן, לחץ, RH, ואיכות נייר סינון סופג. לתמיכת פחמן, (~ 5 ננומטר) סרט פחמן דק מונח על פני סרט פחמן המחורר העבה: פחמן המחורר העבה מספק התנגדות מכאנית ואילו המדגם צילם מעל החור מכוסה פחמן הדק. מצד השני, שימו לב שמאוד קרח דק ו / או פחמן עלולה לגרום לתמיכה נשברה בקלות שיכול להפוך לאינטרנט (איור 3D). על מנת למקסם את יחס האות לרעש, יש להימנע בכל רכיבי חיץ מיותרים. לחלבוני קרום, חומרי הניקוי לוקח אגרה משמעותית על ניגוד (ראה איור 2 ד, פנל מימין). בנוסף על ידי הפחתת מתח פן חומר הניקוי משנה את האופן שבו המדגם מתפשט על התמיכה. חלבוני קרום מסוימים דורשים נוכחות של שומנים בדם, בנוסף לDetergent, אשר מפחית את הניגוד נוסף. כדי להתגבר על זה המדגם יכול להיות מדולל בחיץ עם ריכוז חומר ניקוי נמוך יותר וללא שומנים רק לפני cryo-צולל ^37. חומרי ניקוי חדש חלופי ¹⁶ והשימוש בnanodisks ³⁸ כדי לייצב את מרכיב תחום הטרנסממברני נראים גישות מוצלחות לחלבוני קרום הדמיה על ידי cryoEM.

לשאוף לתמונות באיכות גבוהות ולהתכונן לתיקון CTF. מזוגגות דגימות דורשות ערכי defocus גבוהים כדי ליצור תמונה מספיק (שלב) לעומת זאת יש בי CTF, הפונקציה המתייחסת עוצמה לתדר, כמה אפס מעברים, ובנקודה אין מידע. בעוד תיקון CTF אין צורך לשחזור 3D ברזולוציה נמוכה, כאשר מכוונים לרזולוציה גבוהה יותר, כדי להתאושש ייצוג מדויק של אובייקט 3D, תמונות עם defoci שונה צריכה להיות שנאספו כך שתיקון CTF חישובית ניתן לעשות.נחישות CTF ותיקון כלולה בחבילות תוכנת SPA הגדולות ^4-7; ניתן למצוא את פרטים במקומות אחרים ^39. לתיקון CTF אופטימלי, משתמש במגוון של defoci. אסטרטגיה טובה היא להחליף בין 3-4 ערכי defocus. הערכים תלויים בגודל של מקרומולקולה (גדלים גדולים יותר דורשים פחות defocus), עובי קרח / פחמן (לדוגמא דקה יותר דורשת פחות defocus), והמתח (מתח נמוך דורש פחות defocus). עבור 200 וולט, טווח התחלה טוב של ערכים הוא 2.5, 3, 3.5 ו -4 מיקרומטר defocus. CTF בא לידי ביטוי לסירוגין טבעות של אינטנסיביות גבוהה ונמוכה (Thon מצלצל ⁴⁰⁾ בייצוג המרחב ההדדי, ספקטרום הכח. מציג את ספקטרום הכח יגלה את הפוטנציאל להחלטה; התדירות של טבעת Thon הגלוי הרחבה ביותר היא הקרובה ביותר הערכה מראש של ההחלטה ברת-השגה. ספקטרום הכח צריך להיבדק מעת לעת, וטבעות astigmatic (מעגלי שאינו) Thon (איור 3C) צריך להיות מתוקן עם stigmator האובייקטיבי. טבעות Thon צריכה להיות גלויות לפחות עד הרזולוציה הרצויה.

בסיס נתוני cryoEM שהושג באמצעות פרוטוקול זה יכול להיות מעובד ישירות על ידי SPA על מנת ליצור שחזור 3D. אפילו עם מדגם אידיאלי, איכות שחזור 3D תהיה תלויה בביצועים והמפרטים של ציוד TEM, ועל עיבוד התמונה. עם השיפורים המשיכו בשתי החזיתות הללו, ועם אזכור מיוחד לגלאי אלקטרונים הישירים שפותחו לאחרונה, את האפשרות להשיג שחזורי 3D ברזולוציה אטומית יותר באופן עקבי היא קרוב יותר ממה שהיה אי פעם.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
אתאן	איירגז	371745	טוהר של 99.99% חשוב מאוד, זיהומים עלולים להוביל למזהמים בעלי ניגודיות גבוהה ברשת. זהירות:
חנקן נוזלי	Airgas	27135	99% טוהר. זהירות: טיפול בחנקן נוזלי בחדר קירור מהווה סכנת חנק חמורה מכיוון שחנקן מעביר חמצן ללא כל סימני אזהרה.
Dumont מס' 5 פינצטה אנטי מגנטית	טד פלה	5326
יריעות נציץ, 1 x 4 ס"מ	מוטות גרפיט טד פלה	54
גודל מושחז מראש 1/8 אינץ' קוטר x 2 ¼ ” קצה ארוך 0.039 אינץ' סוג צוואר קוטר	מדעי מיקרוסקופיה	אלקטרונית 70220-45
350 מ"ל קריו-דווארס	אפיפיור	8600
Cu 400 רשת רשתות חורים  Quantifoil	Quantifoil	Q10525
Cu 400 רשתות חורים רשת C-Flat	Protochips	CF-1.2/1.3-4C
מכשיר פריקה זוהר	מדעי מיקרוסקופיה	אלקטרונית דגם E7620
תחנת שאיבה טורבו	גטאן	דגם 655
מאייד פחמן	דנטון ואקום	דגם 502B
בוכנה להקפאה	FEI	Vitrobot Mark IV
שידור מיקרוסקופ אלקטרונים 200 kV	FEI	דגם Tecnai F20
CCD מצלמה 4k x 4k	Gatan	UltraScan 4000 UHS
תוכנת עיבוד תמונה CTFFIND3 / CTFTILT			http://grigoriefflab.janelia.org/ctf
תוכנת עיבוד תמונה EMAN			http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2
תוכנה לעיבוד תמונה Spider			http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html
תוכנה לעיבוד תמונה Freealign
http://grigoriefflab.janelia.org/frealign תוכנת הדמיה תלת מימדית Chimera			http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/
חור מנעול מקורי Limpet Hemocyanin	Biosyn