אנו מתארים בדיקה קולורימטרית כמותית פשוטה המודדת באופן ספציפי את הפעילות הפרוטאוליטית של אדם, עכבר או חולדה Granzyme B (GzmB). ניתן להתאים פרוטוקול זה בקלות לקביעת פעילות הפרוטאז של פרוטאזות סרין גרגירים אחרות על ידי הידרוליזה של מצעי פפטידים סינתטיים אחרים עם רצף זיהוי מתאים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
Colorimetric Assay שמודד את הפעילות באופן ספציפי Granzyme B מפרקי חלבונים: הידרוליזה של הבוק-עלא-עלא-Asp-S-Bzl
במאמר זה
סיכום
תקציר
הסרין פרוטאז גרנזים B (GzmB) מתווך אפופטוזיס של תאי מטרה כאשר הוא משתחרר על ידי לימפוציטים ציטוטוקסיים מסוג T (CTL) או תאי הרג טבעי (NK). GzmB הוא הגרנזים הנחקר ביותר בבני אדם ובעכברים ולכן חוקרים זקוקים לכלים ספציפיים ואמינים כדי לחקור את תפקודו ותפקידו בפתופיזיולוגיה. זה מחייב במיוחד בדיקות שאינן מזהות פרוטאזות כגון קספזות או גראנזימים אחרים הקשורים מבחינה מבנית או תפקודית. כאן, אנו מיישמים את ההעדפה של GzmB למחשוף לאחר שאריות חומצה אספרטית בבדיקה קולורימטרית באמצעות הפפטיד תיואסטר Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl. GzmB הוא פרוטאז הסרין היחיד ביונקים המסוגל לבקע את המצע הזה. המצע נחתך ביעילות דומה על ידי GzmB של אדם, עכבר וחולדה, תכונה שאינה משותפת למצעי פפטידים אחרים הזמינים מסחרית, אפילו כאלה שמפורסמים כמתאימים למטרה זו. פרוטוקול זה מודגם באמצעות ליזטים לא מקוטעים מתאי NK מופעלים או CTL ומתאים גם לפרוטאזות רקומביננטיות הנוצרות במגוון מערכות פרוקריוטיות ואאוקריוטיות, בתנאי שנעשה שימוש בבקרות הנכונות. בדיקה זו היא שיטה ספציפית ביותר לבירור הפעילות הפרו-אפופטוטית הפוטנציאלית של מולקולות ציטוטוקסיות בלימפוציטים של יונקים, ושל עמיתיהם הרקומביננטיים המתבטאים במגוון מתודולוגיות.
מבוא
Granzymes היא משפחה של סרין פרוטאזות נמצאה בlysosomes ההפרשה של רוצח טבעי (NK) תאים ולימפוציטים מסוג T ציטוטוקסי (CTL) 1. חמש granzymes שונה קיימים בבני אדם (A, B, H, K ו- M), ועשרה בעכברים (- G, K, M ו- N) 2,3. Granzyme וGranzyme B (GzmA, GzmB) הם הנפוצים ביותר ונחקר בהרחבה בהגדרה האנושית ומכרסמת.
הפונקציה הקלאסית של GzmB היא האינדוקציה של אפופטוזיס בתאי מטרת להורג בשיתוף עם perforin חלבון יוצרים הנקבובית, המאפשר לgranzyme לגשת cytosol תא המטרה 4. למרות שביטוי GzmB נמצא באופן חד משמעי בלימפוציטים מסוג רעיל לתאים, מחקרים שנעשו ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הערה: טחולים נגזרו מעכברים (6-10 שבועות של גיל) וכל ניסויים בבעלי החיים בוצעו בהתאם להנחיות האתיקה של בעלי החיים של פיטר MacCallum מרכז הסרטן (E486).
1. הכנת דוגמאות.
- הכנת תאי NK העכבר מופעלים.
- בודד תאי NK נאיביים עיקריים מתא בודד השעיות של הטחולים של C57BL / 6 או B6.GrzmB - / - עכברים (null גן GzmB) על ידי סלקציה שלילית באמצעות ערכות זמינות מסחרי.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
מצע הבוק-AAD-S-Bzl הוא ספציפי לGzmB
GzmB פרוטאז סרין הוא מרכיב עיקרי של לימפוציטים ציטוטוקסיות (תאי CTL וNK) והוא בעיקר אחראי לגרימת מוות אפופטוטיים מהיר בתאי מטרה, כגון תאים או הפך נגוע בנגיף. זה נובע במידה רבה העדפת המצע שלה למחשוף אחרי שאריות aspartate ספציפיות מסוימות בחלבונים שנבחרו, תכונה משותפת עם caspases, שגם לדבוק אחרי שאריות aspartate אבל הם ממעמד שונה של פרוטאזות, משפחת פרוטאז ציסטאין.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
מבחינה הסטורית granzymes זוהו כמולקולות מפעיל עיקריות של לימפוציטים מסוג רעיל לתאים (תאי NK וCTL) מסוגל גרימת מוות אפופטוטיים מהיר בתאי מטרה. זה היה בעיקר בגלל הפעולה של GzmB, שהבקיעה מולקולות מצע היעד בaspartate שאריות (ד ') ובכך הייתה מסוגל להפעיל את מפל caspase על ידי שני פרו-caspases ביקוע, כמו גם כמה מהיעדים במורד הזרם שלהם. עם זאת, הוא העריך כי עכשיו ביטוי GzmB אינו מוגבל לתאי הלימפה ציטוטוקסיות ותפקודו ניתן להאריך גם מעבר להכרת תא המטרה ומוות של תאים.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
עבודה זו קיבלה תמיכה באמצעות מענק HA 6136/1-1 מ-Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, קרן המחקר הגרמנית) ל-MH. JAT נתמך על ידי מענקי תוכנית ופרויקטים מהמועצה הלאומית לבריאות ומחקר רפואי של אוסטרליה.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl | SM Biochemicals LLC, CA | SMSB05 | מצע גרנזים B (עכבר ואדם) |
| Ac-IEPD-pNA | SM Biochemicals LLC, CA | SMPNA009 | מצע גרנזים B (אנושי בלבד) |
| N-α-CBZ-L-ליזין-S-Bzl | סיגמא-אולדריץ' | C3647 | מצע גרנזים A |
| Suc-Phe-Leu-Phe-S-Bzl | SM Biochemicals LLC, CA | SB025 | מצע גרנזים H |
| 5,5'-dithio-bis (2-חומצה ניטרובנזואית) | סיגמא-אולדריץ' | D8130 | DTNB, אלמן' s Reagent |
| NK Cell isolation kit II עכבר | Miltenyi Biotec GmbH | 130-096-892 | ערכת בחירה שלילית |
| ערכת בידוד תאי NK אנושית | Miltenyi Biotec GmbH | 130-092-657 | ערכת בחירה שלילית |
| קורא צלחות | Biorad iMark | Biorad Microplate Manager גרסת תוכנה MPM6.3 | |
| Serocluster U-bottom ויניל 96 בארות צלחת | קורנינג, MA, ארה"ב | 2797 |
מקורות
- Trapani, J. A., Browne, K. A., Dawson, M., Smyth, M. J. Immunopurification of functional Asp-ase (natural killer cell granzyme B) using a monoclonal antibody). Biochem Biophys Res Commun. 195 (2), 910-920 (1993).
- Ewen, C. L., Kane, K. P., Bleackley, R. C. A qu....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
