מאמר שיטה

Colorimetric Assay שמודד את הפעילות באופן ספציפי Granzyme B מפרקי חלבונים: הידרוליזה של הבוק-עלא-עלא-Asp-S-Bzl

DOI:

10.3791/52419

⸱

28 בנובמבר 2014

 ,  , 
1Cancer Immunology Program, Peter MacCallum Cancer Centre

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים בדיקה קולורימטרית כמותית פשוטה המודדת באופן ספציפי את הפעילות הפרוטאוליטית של אדם, עכבר או חולדה Granzyme B (GzmB). ניתן להתאים פרוטוקול זה בקלות לקביעת פעילות הפרוטאז של פרוטאזות סרין גרגירים אחרות על ידי הידרוליזה של מצעי פפטידים סינתטיים אחרים עם רצף זיהוי מתאים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הסרין פרוטאז גרנזים B (GzmB) מתווך אפופטוזיס של תאי מטרה כאשר הוא משתחרר על ידי לימפוציטים ציטוטוקסיים מסוג T (CTL) או תאי הרג טבעי (NK). GzmB הוא הגרנזים הנחקר ביותר בבני אדם ובעכברים ולכן חוקרים זקוקים לכלים ספציפיים ואמינים כדי לחקור את תפקודו ותפקידו בפתופיזיולוגיה. זה מחייב במיוחד בדיקות שאינן מזהות פרוטאזות כגון קספזות או גראנזימים אחרים הקשורים מבחינה מבנית או תפקודית. כאן, אנו מיישמים את ההעדפה של GzmB למחשוף לאחר שאריות חומצה אספרטית בבדיקה קולורימטרית באמצעות הפפטיד תיואסטר Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl. GzmB הוא פרוטאז הסרין היחיד ביונקים המסוגל לבקע את המצע הזה. המצע נחתך ביעילות דומה על ידי GzmB של אדם, עכבר וחולדה, תכונה שאינה משותפת למצעי פפטידים אחרים הזמינים מסחרית, אפילו כאלה שמפורסמים כמתאימים למטרה זו. פרוטוקול זה מודגם באמצעות ליזטים לא מקוטעים מתאי NK מופעלים או CTL ומתאים גם לפרוטאזות רקומביננטיות הנוצרות במגוון מערכות פרוקריוטיות ואאוקריוטיות, בתנאי שנעשה שימוש בבקרות הנכונות. בדיקה זו היא שיטה ספציפית ביותר לבירור הפעילות הפרו-אפופטוטית הפוטנציאלית של מולקולות ציטוטוקסיות בלימפוציטים של יונקים, ושל עמיתיהם הרקומביננטיים המתבטאים במגוון מתודולוגיות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Granzymes היא משפחה של סרין פרוטאזות נמצאה בlysosomes ההפרשה של רוצח טבעי (NK) תאים ולימפוציטים מסוג T ציטוטוקסי (CTL) 1. חמש granzymes שונה קיימים בבני אדם (A, B, H, K ו- M), ועשרה בעכברים (- G, K, M ו- N) 2,3. Granzyme וGranzyme B (GzmA, GzmB) הם הנפוצים ביותר ונחקר בהרחבה בהגדרה האנושית ומכרסמת.

הפונקציה הקלאסית של GzmB היא האינדוקציה של אפופטוזיס בתאי מטרת להורג בשיתוף עם perforin חלבון יוצרים הנקבובית, המאפשר לgranzyme לגשת cytosol תא המטרה 4. למרות שביטוי GzmB נמצא באופן חד משמעי בלימפוציטים מסוג רעיל לתאים, מחקרים שנעשו לאחרונה שטיפול במגוון של סוגי תאים להביע GzmB אחרים, לרבות אך לא רק לקרטינוציטים 5, בזופילים 6, 7 תאי פיטום, תאים דנדריטיים plasmacytoid 8, ותאי B 9, 10.בהקשר זה, פונקציות GzmB אינן אפופטוטיים נחשפו החל מההשתתפות בתהליכים דלקתיים, שיפוץ רקמות ומאפיינים אחרים immunoregulatory 11-14.

בהתחשב בכך שתפקיד ביולוגי רחב יותר הוצע לGzmB מאשר חשדו בעבר, חוקרים דורשים כלים אמינות וספציפיים לגילויה. יתרון הוא הדרישה הספציפית של GzmB לדבוק בצד carboxyl של שאריות חומצה אספרטית, נכס ייחודיים בין פרוטאזות סרין אוקריוטים 15. עכבר, אנושי וGzmB החולדה הם מבני דומים מאוד, עם זאת סגוליות המצע המורחב של GzmB העכבר שונה בעדינות מזה של שני בני האדם והעכברים 16, מה שאומר שמצעים מסוימים גנריות עם ASP במסוף (P1) ניתן ביקעו ביעילות על ידי GzmB מכל שלושת המינים, ואילו מצעים אחרים עם רצפים מורכבים יותר במעלה הזרם של P1 עשוי לתת תוצאות משתנים באופן נרחב. בעבר ובli האחרון יותרterature, עובדה זו גרמה לבלבול ופירוש לא נכון של המשמעות הביולוגית של כמה ממצאים ניסיוניים רבים, אף על פי שמבוקרת בקפידה, מחקרים הקינטית ביקשו לתקן את המצב 17.

במאמר זה אנו בקשנו להמחיש נקודות אלה באמצעות שני מצעים זמינים מסחרי, כלומר בוק-עלא-עלא-Asp-SBzl וN-אצטיל-איל-Asp-p-nitroanilide Glu-Pro. שני ריאגנטים לעשות ליצור קבוצות תגובתי שונות הבאות מחשוף (sulphydryl חופשי מול paranitroanilide חופשי ניאון), אבל אין לכך שום השפעה על מה שמחשוף פרוטאוליטים. הפרוטוקול המתואר הוא adaption מודרנית של פרוטוקול ישן מאוד 18, אבל צריך לעזור לחוקרים להשתמש במצעי GzmB השונים כראוי, גם בעת מתן מסגרת המתודולוגית לאיתור הפעילות של granzymes האחר, כגון GzmA וGzmH.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: טחולים נגזרו מעכברים (6-10 שבועות של גיל) וכל ניסויים בבעלי החיים בוצעו בהתאם להנחיות האתיקה של בעלי החיים של פיטר MacCallum מרכז הסרטן (E486).

1. הכנת דוגמאות.

  1. הכנת תאי NK העכבר מופעלים.
    1. בודד תאי NK נאיביים עיקריים מתא בודד השעיות של הטחולים של C57BL / 6 או B6.GrzmB - / - עכברים (null גן GzmB) על ידי סלקציה שלילית באמצעות ערכות זמינות מסחרי.
    2. עקוב פרוטוקול של היצרנים. בקצרה, מגנטי תווית תאים "הלא NK" כמו T ותאי B, תאים דנדריטיים, גרנולוציטים, מקרופאגים, תאי דם אדומים באמצעות נוגדני ביוטין מצומדות- נגד סמני המשטח הספציפיים שלהם. השתמש בהפרדה מגנטית עם חרוזים אנטי-ביוטין לרוקן תאים "הלא NK".
    3. תרבות מבודדת תאי NK 5-7 ימים במדיה המכילה IL-2 (1000 U / ml) ב700,000 תאים / מיליליטר בצלחות 24 גםב 37   מעלות צלזיוס.
    4. לחלופין, שימוש הופעל תאי T 19, CTL המוגבל אנטיגן העיקרי מעכברים מהונדסים 20 קולט תא ההארכה הזמן 1 T, CTL שנוצרו בתרבויות מעורבות הלימפוציטים 21, או supernatants מתאי NK מופעלים כדי לקבוע את הפעילות של GzmB המופרש 19.
  2. תחזוקה של קו אדם NK תא ובידוד של תאי NK עיקריים.
    1. שמור לוקמיה NK (תאי יט) בRoswell Park זיכרון מכון בינוני (RPMI) בתוספת 10% בסרום עגל עוברי. לחלופין, לטהר את תאי NK עיקריים מהדם ההיקפי של נבדקים בריאים ולעורר במשך 2-3 ימים במדיום המכיל IL-2 ב 100 U / ml כפי שתואר קודם לכן 22.
  3. דור של lysates תא.
    1. שטפו תאים שלוש פעמים PBS (pH 7.4), ואז להשעות במאגר תמוגה P-40 Nonidet (0.1% NP-40, 250 מ"מ NaCl, 25 מ"מ Hepes, 2.5 mM EDTA). באופן אידיאלי, lyse מינימום של 5 x 10 6 תאי NK, או 1 x 10 7 תאים T ב 100 חיץ μl. אל תוסיפו מעכבי פרוטאז, כפי שרבים הם מעכבים בלתי הפיכים של פרוטאזות סרין, ובtryptases מסוים כגון GzmA. דגירה על קרח למשך 20 דקות, ולאחר מכן גלולה את הגרעינים בmicrocentrifuge ב 15,000 XG במשך 10 דקות. זורק את הכדור הגרעיני ולהעביר את supernatant לצינור טרי.
  4. קבע את ריכוז החלבון של lysates.
    1. משתמש בפרוטוקול זמין מסחרי של בחירה כגון, ברדפורד או חומצת bicinchoninic (BCA) ולקבוע את ריכוז החלבון. ודא שהריכוז הוא ~ 2 מ"ג מינימום / מיליליטר. lysates החנות ב -20 ° C עד נדרשת (פעילות granzyme יציב במשך חודשים רבים ב -20 ° C).

2. Granzyme B פעילות Assay

  1. הכנת ריאגנטים
    1. הכן מלאי מ"מ 10 של מצעים (בוק-AAD-S-Bzl או AC-IEPD-PNA) בDMSO (~ 5 מ"ג / מיליליטר) ולאחסן בaliquots ב -20 & #176; C. הכן דילול עובד טרי וזורקים אחרי כל יום, כמו הבוק-AAD-S-Bzl hydrolyzes באופן חלקי על האחסון בDMSO.
    2. הכן מלאי 250 מ"מ של מגיב colorimetric (5,5'-dithio-bis (חומצת 2-nitrobenzoic), DTNB) בDMSO (0.09 גר '/ מיליליטר) ולאחסן ב -20 ° C. הכן דילול עבודה טרי בכל יום. מגיב זה נדרש רק למצעים עם קבוצות SBzl מחוון, לא הרשות הפלסטינית.
    3. מרכיבים את החיץ טרי (0.1M HEPES, 0.05 M MgCl 2, pH 7.3) בכל 2-3 שבועות.
  2. להביא DTNB ומצעים סינטטיים לטמפרטורת חדר. מצעים לדלל (01:16, למשל ב1.6 מיליליטר של חיץ 100 μl) וDTNB (1: 250, לדוגמא 10 μl ב2.5 מיליליטר חיץ) ומערבבים היטב.
  3. לדלל מינימום של 100 מיקרוגרם lysate חלבון של כל דגימה במאגר לנפח סופי של 160 μl. בעזרת פיפטה רבה להוסיף 50 μl לכל גם בשלושה עותקים (~ 33.3 מיקרוגרם / טוב) ב''U' 'צלחת 96-היטב ויניל התחתון.כולל "חיץ בלבד" שליטה (גם בשלושה עותקים).
  4. הוספה של DTNB המדולל 100 μl לשליטת דגימות / חיץ (להשמיט את הצעד הזה בעבודה עם Ac-IEPD-PNA.
    הערה: מחשוף של Ac-IEPD-ידי הרשות הפלסטינית GzmB ישירות משחרר fluorogenic PNA (איור 4).
  5. השתמש בפיפטה רבה כדי להוסיף במהירות 50 μl של מצעים מדוללים לכל סט של triplicates, החל במאגר אז כל בקרות שליליות וסיים עם דגימות חיוביות צפויות.
  6. מניחים את הצלחת בקורא הצלחת. למדוד את פעילות Asp-ASE ידי הידרוליזה של בוק-עלא-עלא-Asp-S-Bzl / Ac-IEPD-הרשות הפלסטינית בקורא microplate בננומטר OD 405. משתמש בפרוטוקול assay הקינטית, לקחת 25 קריאות, בכל 15 שניות (זמן קריאה כוללת 6 דקות בערך).
  7. השתמש בקריאות ספיגה שנוצרה בכל נקודת זמן כדי לחשב באופן ידני את שיעור מחשוף מצע אם התוכנה של הצלחת-הקורא לא יכולה ליצור ערך עבור Vmax.

3. ניתוח של Data

הערה: הנתונים המופקים מוצג כמהירות המרבית, מוגדר כשינוי של OD לאורך זמן (mod / min).

  1. כדי לנתח את הנתונים, לקבוע את השיעור המרבי של מחשוף מצע, המחושב משיעור השינוי בספיגה. לעשות את זה באופן אוטומטי באמצעות תוכנת צלחת קורא, אשר בדרך כלל יש באפשרות זו.
  2. לחלופין לאחר צפייה בחלקות הקינטית של שינוי בספיגה, אשר נוצר במהלך assay הקינטית על קורא הצלחת, בחר ידני נקודות נתונים שנותנים הקו הישר התלול ביותר. עבור רוב מבחני השיעור המרבי מושגת בתוך 2 דקות הראשונות של assay.
  3. לחסר קריאת OD הראשונית מקריאת OD הגבוהה ביותר בקו הזה ישר ולחלק את מרווח הזמן. העבר את הנתונים גולמיים לכרית Microsoft Excel / גרף לניתוח סטטיסטי ותצוגה גרפית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מצע הבוק-AAD-S-Bzl הוא ספציפי לGzmB

GzmB פרוטאז סרין הוא מרכיב עיקרי של לימפוציטים ציטוטוקסיות (תאי CTL וNK) והוא בעיקר אחראי לגרימת מוות אפופטוטיים מהיר בתאי מטרה, כגון תאים או הפך נגוע בנגיף. זה נובע במידה רבה העדפת המצע שלה למחשוף אחרי שאריות aspartate ספציפיות מסוימות בחלבונים שנבחרו, תכונה משותפת עם caspases, שגם לדבוק אחרי שאריות aspartate אבל הם ממעמד שונה של פרוטאזות, משפחת פרוטאז ציסטאין...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מבחינה הסטורית granzymes זוהו כמולקולות מפעיל עיקריות של לימפוציטים מסוג רעיל לתאים (תאי NK וCTL) מסוגל גרימת מוות אפופטוטיים מהיר בתאי מטרה. זה היה בעיקר בגלל הפעולה של GzmB, שהבקיעה מולקולות מצע היעד בaspartate שאריות (ד ') ובכך הייתה מסוגל להפעיל את מפל caspase על ידי שני פרו-caspases ביקוע, כמו גם כמה מהיעדים במורד הזרם שלהם. עם זאת, הוא העריך כי עכשיו ביטוי GzmB אינו מוגבל לתאי הלימפה ציטוטוקסיות ותפקודו ניתן להאריך גם מעבר להכרת תא המטרה ומוות של תאים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו קיבלה תמיכה באמצעות מענק HA 6136/1-1 מ-Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, קרן המחקר הגרמנית) ל-MH. JAT נתמך על ידי מענקי תוכנית ופרויקטים מהמועצה הלאומית לבריאות ומחקר רפואי של אוסטרליה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Boc-Ala-Ala-Asp-S-BzlSM Biochemicals LLC, CASMSB05מצע גרנזים B (עכבר ואדם)
Ac-IEPD-pNA SM Biochemicals LLC, CASMPNA009מצע גרנזים B (אנושי בלבד)
N-α-CBZ-L-ליזין-S-Bzlסיגמא-אולדריץ'C3647מצע גרנזים A
Suc-Phe-Leu-Phe-S-BzlSM Biochemicals LLC, CASB025מצע גרנזים H
5,5'-dithio-bis (2-חומצה ניטרובנזואית) סיגמא-אולדריץ'D8130DTNB, אלמן' s Reagent
NK Cell isolation kit II עכברMiltenyi Biotec GmbH130-096-892ערכת בחירה שלילית
ערכת בידוד תאי NK אנושיתMiltenyi Biotec GmbH130-092-657ערכת בחירה שלילית
קורא צלחותBiorad iMarkBiorad Microplate Manager גרסת תוכנה MPM6.3
Serocluster U-bottom ויניל 96 בארות צלחתקורנינג, MA, ארה"ב2797

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Trapani, J. A., Browne, K. A., Dawson, M., Smyth, M. J. Immunopurification of functional Asp-ase (natural killer cell granzyme B) using a monoclonal antibody). Biochem Biophys Res Commun. 195 (2), 910-920 (1993).
  2. Ewen, C. L., Kane, K. P., Bleackley, R. C. A quarter century of granzymes. Cell Death Differ. 19 (1), 28-35 (2012).
  3. Hoves, S., Trapani, J. A., Voskoboinik, I. The battlefield of perforin/granzyme cell death pathways. J Leukoc Biol. , (2009).
  4. Peters, P. J., et al. Cytotoxic T lymphocyte granules are secretory lysosomes, containing both perforin and granzymes. J Exp Med. 173 (5), 1099-1109 (1991).
  5. Berthou, C., et al. Acquisition of granzyme B and Fas ligand proteins by human keratinocytes contributes to epidermal cell defense. J Immunol. 159 (11), 5293-5300 (1997).
  6. Tschopp, C. M., et al. Granzyme B, a novel mediator of allergic inflammation: its induction and release in blood basophils and human asthma. Blood. 108 (7), 2290-2299 (2006).
  7. Strik, M. C., et al. Human mast cells produce and release the cytotoxic lymphocyte associated protease granzyme B upon activation. Mol Immunol. 44 (14), 3462-3472 (2007).
  8. Jahrsdorfer, B., et al. Granzyme B produced by human plasmacytoid dendritic cells suppresses T cell expansion. Blood. , (2009).
  9. Hagn, M., et al. Human B cells secrete granzyme B when recognizing viral antigens in the context of the acute phase cytokine IL-21. J Immunol. 183 (3), 1838-1845 (2009).
  10. Hagn, M., et al. Human B cells differentiate into granzyme B-secreting cytotoxic B lymphocytes upon incomplete T-cell help. Immunol Cell Biol. 90 (4), 457-467 (2012).
  11. Froelich, C. J., Pardo, J., Simon, M. M. Granule-associated serine proteases: granzymes might not just be killer proteases. Trends Immunol. 30 (3), 117-123 (2009).
  12. Hagn, M., Jahrsdorfer, B. Why do human B cells secrete granzyme B? Insights into a novel B-cell differentiation pathway. Oncoimmunology. 1 (8), 1368-1375 (2012).
  13. Susanto, O., Trapani, J. A., Brasacchio, D. Controversies in granzyme biology. Tissue Antigens. 80 (6), 477-487 (2012).
  14. Walch, M., et al. Cytotoxic cells kill intracellular bacteria through granulysin-mediated delivery of granzymes. Cell. 157 (6), 1309-1323 (2014).
  15. Odake, S., et al. Human and murine cytotoxic T lymphocyte serine proteases: subsite mapping with peptide thioester substrates and inhibition of enzyme activity and cytolysis by isocoumarins. Biochemistry. 30 (8), 2217-2227 (1991).
  16. Casciola-Rosen, L., et al. Mouse and human granzyme B have distinct tetrapeptide specificities and abilities to recruit the bid pathway. J Biol Chem. 282 (7), 4545-4552 (2007).
  17. Kaiserman, D., et al. The major human and mouse granzymes are structurally and functionally divergent. J Cell Biol. 175 (4), 619-630 (2006).
  18. Powers, J. C., Kam, C. M. Peptide thioester substrates for serine peptidases and metalloendopeptidases. Methods Enzymol. 248, 3-18 (1995).
  19. Hagn, M., et al. Activated mouse B cells lack expression of granzyme. B. J Immunol. 188 (2), 3886-3892 (2012).
  20. Konjar, S., et al. Human and mouse perforin are processed in part through cleavage by the lysosomal cysteine proteinase cathepsin L. Immunology. 131 (2), 257-267 (2010).
  21. Sutton, V. R., et al. Residual active granzyme B in cathepsin C-null lymphocytes is sufficient for perforin-dependent target cell apoptosis. J Cell Biol. 176 (4), 425-433 (2007).
  22. Trapani, J. A., Smyth, M. J., Apostolidis, V. A., Dawson, M., Browne, K. A. Granule serine proteases are normal nuclear constituents of natural killer cells. J Biol Chem. 269 (28), 18359-18365 (1994).
  23. Cullen, S. P., Adrain, C., Luthi, A. U., Duriez, P. J., Martin, S. J. Human and murine granzyme B exhibit divergent substrate preferences. J Cell Biol. 176 (4), 435-444 (2007).
  24. Thornberry, N. A., et al. A combinatorial approach defines specificities of members of the caspase family and granzyme B. Functional relationships established for key mediators of apoptosis. J Biol Chem. 272 (29), 17907-17911 (1997).
  25. Bird, C. H., et al. Selective regulation of apoptosis: the cytotoxic lymphocyte serpin proteinase inhibitor 9 protects against granzyme B-mediated apoptosis without perturbing the Fas cell death pathway. Mol Cell Biol. 18 (11), 6387-6398 (1998).
  26. Bots, M., Medema, J. P. Serpins in T cell immunity. J Leukoc Biol. 84 (5), 1238-1247 (2008).
  27. Sun, J., et al. A new family of 10 murine ovalbumin serpins includes two homologs of proteinase inhibitor 8 and two homologs of the granzyme B inhibitor (proteinase inhibitor 9). J Biol Chem. 272 (24), 15434-15441 (1997).
  28. Bird, C. H., Hitchen, C., Prescott, M., Harper, I., Bird, P. I. Immunodetection of granzyme B tissue distribution and cellular localisation. Methods Mol Biol. 844, 237-250 (2012).
  29. Jenkins, M. R., et al. Visualizing CTL activity for different CD8+ effector T cells supports the idea that lower TCR/epitope avidity may be advantageous for target cell killing. Cell Death Differ. 16 (4), 537-542 (2009).
  30. Edwards, K. M., Kam, C. M., Powers, J. C., Trapani, J. A. The human cytotoxic T cell granule serine protease granzyme H has chymotrypsin-like (chymase) activity and is taken up into cytoplasmic vesicles reminiscent of granzyme B-containing endosomes. J Biol Chem. 274 (43), 30468-30473 (1999).
  31. Sutton, V. R., et al. Initiation of apoptosis by granzyme B requires direct cleavage of bid, but not direct granzyme B-mediated caspase activation. J Exp Med. 192 (10), 1403-1414 (2000).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Granzyme BNKDTNBMicroplate ReaderKnockout Granzyme B

מאמרים קשורים