Method Article

טכניקות לניתוח של תאית שלפוחית ​​שימוש cytometry הזרימה

DOI:

10.3791/52484

⸱

March 17th, 2015

 ,  , 
1Blood Systems Research Institute, 2Department of Medicine, University of California, San Francisco, 3Department of Laboratory Medicine, University of California, San Francisco

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיטות שונות רבות קיימות למדידה של שלפוחית ​​תאית (EVS) באמצעות cytometry זרימה (FCM). כמה היבטים יש לשקול בעת קביעת השיטה המתאימה ביותר לשימוש. שני פרוטוקולים לכלי רכב חשמליים מדידה מוצגים, או באמצעות זיהוי אדם או גישה מבוססת חרוז.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי שלפוחית ​​(EVS) היא שלפוחית ​​שנמצאה בנוזלי גוף, כי הם מעורבים מאוד בתקשורת בין תאים ומסייעים בויסות מגוון רחב של תהליכים ביולוגיים קטנה, המופק מקרום. ניתוח של כלי רכב חשמליים באמצעות cytometry זרימה (FCM) כבר קשה לשמצה בשל גודלם הקטן וחוסר אוכלוסיות בדידות חיוביות לסמנים של עניין. שיטות לניתוח EV, תוך שיפור ניכר בעשור האחרון, עדיין בתהליך עבודה. למרבה הצער, אין אף אחד בגודל שמתאים לכל פרוטוקול, וכמה היבטים יש לקחת בחשבון בעת ​​קביעת השיטה המתאימה ביותר לשימוש. מוצג כאן מספר טכניקות שונות לכלי רכב חשמליים עיבוד ושני פרוטוקולים לניתוח כלי רכב חשמליים או באמצעות זיהוי אדם או גישה מבוססת חרוז. השיטות שתוארו כאן יסייע בביטול מצרפי הנוגדן נמצאים בדרך כלל בהכנות מסחריות, יחס אות לרעש גובר, ושערים הגדרה בf רציונליםashion שממזער גילוי של הקרינה רקע. הפרוטוקול הראשון משתמש בשיטת זיהוי אישית שמתאים במיוחד לניתוח נפח גבוה של דגימות קליניות, בעוד שהפרוטוקול השני משתמש בגישה מבוססת חרוז כדי ללכוד ולזהות כלי רכב חשמליים וexosomes קטנים יותר.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי שלפוחית ​​(EVS) היא שלפוחית ​​שנמצאה בנוזלי גוף, כי הם מעורבים מאוד בתקשורת בין תאים ומסייעים בויסות מגוון רחב של תהליכים ביולוגיים קטנה, המופק מקרום. ניתוח של כלי רכב חשמליים באמצעות cytometry זרימה (FCM) כבר קשה לשמצה בשל גודלם הקטן וחוסר אוכלוסיות בדידות חיוביות לסמנים של עניין. שיטות לניתוח EV, תוך שיפור ניכר בעשור האחרון, עדיין בתהליך עבודה. למרבה הצער, אין אף אחד בגודל שמתאים לכל פרוטוקול, וכמה היבטים יש לקחת בחשבון בעת ​​קביעת השיטה המתאימה ביותר לשימוש. מוצג כאן מספר טכניקות שונות לכלי רכב חשמליים עיבוד ושני פרוטוקולים לניתוח כלי רכב חשמליים או באמצעות זיהוי אדם או גישה מבוססת חרוז. השיטות שתוארו כאן יסייע בביטול מצ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: הפרוטוקולים הבאים בוצעו בהתאם לכל הנחיות מוסדיות, לאומיות ובינלאומיות לרווחת אדם. כל דגימות הסובייקט האנושיות נבדקו תחת לוח מוסדי סקירה (IRB) פרוטוקול -approved ועם הסכמה מדעת של הנושאים.

1. שיטה: פרט איתור שיטה

1.1) עיבוד לדוגמא / בידוד דם של כלי רכב חשמליים

  1. להקיז דם מתורם / מטופל לשני 10 מיליליטר צינורות זכוכית המכילים 1.5 מיליליטר של ACD-פתרון או נוגד קרישה מתאימה ותהליך מייד אחרות (תוך 30 מקסימום....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איור 1 מתאר את התכנית הכוללת לעיבוד הבידוד וזיהוי של כלי רכב חשמליים או באמצעות השיטה המבוססת על חרוז או שיטת זיהוי אישית. זיהוי אישי של כלי רכב חשמליים באמצעות FCM עובד היטב לניתוח רכב חשמלי גדול יותר אבל רוב cytometers אינו מסוגל בנפרד גילוי חלקיקים קטנים כמו exosomes. גישה מבוססת חרוז מאפשרת כלי רכב חשמליים קטנים כדי להתגלות, עם זאת, יש חסרונות הקשורים בשימוש בשיטה זו, כפי שמתוארים בטבלה 1. באופן כללי, בידוד של כלי רכב חשמליים באמצעות ultracent.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שני פרוטוקולים שונים לבידוד, הטיפול והניתוח של כלי רכב חשמליים הוצגו, תוך שימוש בזיהוי אדם או גישה מבוססת חרוז. בחירה בשיטה המתאימה ביותר לשימוש היא לא תמיד פשוטה ודורש הבנה של המדגם נבדק, כמו גם תת-האוכלוסיות בודדות של עניין. יתר על כן, את הרגישות של cytometer שימש לרכישה יש לקחת בחשבון בעת ​​בחירת השיטה המתאימה ביותר. לעתים קרובות אין פרוטוקול בודד הטוב ביותר לשימוש, ולא, בשילוב של שיטות מספק מידע נוסף על מדגם מכל שיטה אחת בלבד. באופן אידיאלי, יש להעריך כמה טכניקות בידוד וזיהוי .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אי לנו ניגוד עניינים לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מבקשים להודות לדייל הירשקורן מהדם מערכות מכון מחקר על עזרתו עם cytometer זרימת הגדרות מכשיר. עבודה זו נתמכה על ידי NIH מענקי HL095470 וHL072268 U01 וחוזי DoD W81XWH-10-1-0023 וW81XWH-2-0028.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
LSR II ציטומטר זרימה שולחניתBD Biosciences3 לייזר (20 mW ספיר קוהרנטי 488 ננומטר כחול, 25 mW קוהרנטי Vioflame 405 ננומטר סגול ו-17 mW JDS חד פאזי HeNe 633 ננומטר אדום)
תוכנת FACS Diva BD BiosciencesPC גרסה 6.0
תוכנת FlowJo Treestar USMac גרסה 9.6.1 או PC גרסה 7.6.5
חלקיקי פלואורסצנט Sphero RainbowBD Biosciences556298 משמש להתאמת כל מתחי הערוץ כדי לשמור על עקביות עוצמת הקרינה 
חלקיקים פלואורסצנטיים אולטרה ריינבו SpherotechURFP-10-5משמש בנוסף לחרוזי SSC של Megamix-Plus כדי להבטיח עקביות שער EV מאצווה לאצווה
חרוזי Megmix-Plus SSCBiocytex7803משמש להתאמת מתחי FSC ו-SSC  לשמירה על עקביות  בין ריצות. יכול לשמש גם לניטור קצב הזרימה וחוגת קצב הזרימה המדויקת על מנת להבטיח שאותו קצב זרימה משמש בכל הריצות
AbC Anti-Mouse Bead KitLife TechnologiesA-10344המשמש לבקרות פיצוי וחרוזי AbC שליליים המשמשים לשיטה מבוססת חרוזים
Nonidet P-40 Alternative (NP-40) (CAS 9016-45-9)סנטה קרוז SC-281108משמש בשיטת הזיהוי הפרטנית רק כדי ליז דגימות לאחר קריאה ראשונית לשימוש כבקרות שליליות. ניתן לדלל את המלאי ל-1:10 ב-PBS ולאחסן במקרר עד חודש.
340334 להשתמש בצינורות BD TruCOUNTBiosciencesבכל פעם שיש צורך בריכוזי EV מוחלטים
Ultrafree-MC, GV 0.22 ומיקרו; מ יחידות סינון צנטריפוגליותMillipore UFC30GVNBמשמש לשטיפה לאחר כתמים של Evs ו/או לפיצול EVs על סמך גודל
צינורות דם מלא מזכוכית Vacutainer ACD-ABD Biosciences364606
צינורות Facs 12x75 polystreneBD Biosciences352058
50 מ"ל מאגרים עטופים בנפרדPhoenixRR-50-1s
Green-Pak פיפט טיפים - 10 ומיקרו; lקצות פיפט RaininGP-L10S
Green-Pak -200 ומיקרו; l RaininGP-L250S
ירוק - קצות פיפט פאק - 1,000 ומיקרו; l RaininGP-L1000S
מחסנית יציבה L300 טיפים מעוקרים מראשRaininSS-L300S
Pipet-Lite XLS 8 ערוצים LTS  מתכוונן  מרווח RaininLA8-300XLS
96 צלחות תרבית רקמותבאר E& K ScientificEK-20180
RPMI 1640 מדיה (ללא Hepes)מתקן תרבית תאים UCSFCCFAE001מדיה המשמשת לשיטת זיהוי מבוססת חרוזים
Dulbeccos PBS D-PBS, ללא CaMg, 0.2 ומיקרו; מתקןתרבית תאים UCSFCCFAL003
צינור אולטרה-צנטריפוגה, קיר דק, אולטרה-ברורBECKMAN COULTER INC
פאנל I
CD3 PerCP-Cy5.5Biolegend3448082 ומיקרו; l
CD14 APC-Cy7Biolegend3018202 ומיקרו; l
CD16 V450BD Biosciences5604742 ומיקרו; l
CD28 FITCbiolegend3029062 ומיקרו; l
CD152 APCBD Biosciences5558552 ומיקרו; l
CD19 A700Biolegend3022262 ומיקרו; l
PANEL II
CD41a PerCP-Cy5.5BD Biosciences3409302 ומיקרו; l
CD62L APCBiolegend3048102 ומיקרו; l
CD108 PE BD Biosciences5528302 ומיקרו; l
CD235a FITCbiolegend3491042 ומיקרו; l
פאנל III
CD11b PE-Cy7Biolegend3013222 ומיקרו; l
CD62p APCBiolegend3049102 ומיקרו; l
CD66b PE Biolegend3051062 ומיקרו; l
CD15 FITCexalphaX1496M5 ומיקרו; l
CD9 PEBiolegend555372
CD63 APCBiolegend353008
APC-Cy7 Ms IgG2a, κביולג'נד400230
BD מסונן 344058

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Andaloussi, S., Mäger, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. A. Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 12 (5), 347-357 (2013).
  2. Sugawara, A., Nollet, K. E., Yajima, K., Saito, S., Ohto, H.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Extracellular VesiclesFlow CytometryBead Based DetectionIndividual DetectionPlatelet Poor PlasmaAntibody StainingCytometer SetupFluorescent ParticlesPolystyrene BeadsForward Scatter

Related Articles