ממוקד DNA מתילציה ניתוח על ידי רצף של הדור הבא

סיכום

Bisulfite amplicon sequencing (BSAS) היא שיטה לכימות מתילציה של ציטוזין באזורים גנומיים ממוקדים של עניין. שיטה זו משתמשת בהמרת ביסולפיט בשילוב עם הגברת PCR של אזורי יעד לפני ריצוף הדור הבא כדי לייצר כימות מוחלט של מתילציה של DNA ברמה ספציפית לבסיס.

תקציר

תפקידם של תהליכים אפיגנטיים בשליטה על ביטוי גנים ידוע מזה מספר שנים. מתילציה של DNA בשאריות ציטוזין מעניינת במיוחד עבור מחקרים אפיגנטיים מכיוון שהיא הוכחה כמווסתת ארוכת טווח ודינמית של ביטוי גנים. המאמצים לבחון שינויים אפיגנטיים בבריאות ובמחלות נפגעו בשל היעדר שיטות מדויקות כמותית בעלות תפוקה גבוהה. עם הופעתן והפופולריות של טכנולוגיות ריצוף מהדור הבא (NGS), כלים אלה מיושמים כעת על אפיגנומיקה בנוסף למתודולוגיות גנומיות ותעתיק קיימות. לצורך חקירות אפיגנטיות של מתילציה של ציטוזין בהן זוהו אזורים מעניינים, כגון מקדמי גנים ספציפיים או איי CpG, ויש צורך לבחון מספר משמעותי של דגימות ברמת דיוק כמותית גבוהה, פיתחנו שיטה הנקראת ריצוף אמפליקון ביסולפיט (BSAS). שיטה זו משלבת המרת ביסולפיט עם הגברה ממוקדת של אזורי עניין, בניית ספרייה בתיווך טרנספוזום ו-NGS על שולחן. BSAS מציעה שיטה מהירה ויעילה לניתוח של עד 10 קילו-בייט של אזורים ממוקדים בעד 96 דגימות בכל פעם, שיכולה להתבצע על ידי רוב קבוצות המחקר עם כישורי ביולוגיה מולקולרית בסיסיים. התוצאות מספקות כימות מוחלט של מתילציה של ציטוזין עם ספציפיות בסיס. ניתן ליישם BSAS על כל אזור גנומי מכל מקור DNA. שיטה זו שימושית למחקרי בדיקת השערות של אזורי יעד מעניינים, כמו גם לאישור אזורים שזוהו בניתוחי מתילציה ברחבי הגנום כגון ריצוף ביסולפיט גנומי שלם, ריצוף ביסולפיט ייצוג מופחת וריצוף חיסוני של DNA שעבר מתילציה.

מבוא

זה כבר יותר ממחצית המאה מאז הדו"ח הראשון של מתרחש באופן טבעי שינויי DNA בצורה של מתילציה ציטוזין ^1. מתילציה ציטוזין היא בסיס נוקלאוטיד ציטוזין שונה בי פחמן 5 ^th על טבעת הבסיס יש קבוצה מתיל (5-MC), שכיחה ביותר במוטיב dinucleotide CPG בגנומים של יונקים. הנוכחות הפונקציונלית של 5-MC ביזמי גן מזוהית בדרך כלל עם דיכוי תעתיק, ואילו ההעדר קשור פעילות תעתיק ^2.

התקדמות עצומה נעשתה בהבנה של תפקיד המתילציה של הדנ"א בפיתוח ^3, התפשטות transgeneration פרופילים אפיגנטיים ^4, פתוגנזה סרטן ^5,6, ומספר תחומי מחקר האחרים שלנו. רבים מפיתוחים אלו הגיעו בשנים האחרונות כמתודולוגיות חדשות פותחו לפרופיל מתילציה DNA ^7. עם כניסתו ופופולריזציה של טכניקות של הדור הבא רצף (NGS) יש כיום מספר השיטות לפרופיל מתילציה DNA על פני הגנום כולו או אזורים גדולים של הגנום ^8. גישות אלו פותחות את האפשרות של לימודי גילוי שלכמת דפוסי מתילציה DNA והבדלים במתילציה DNA. בנוסף לגישות השערת מניבה אלה, יש צורך משמעותי לשיטות לכמת מתילציה DNA בדיקות ממוקדות / השערה.

Pyrosequencing, PCR הספציפי מתילציה, וסנגר רצף ישיר של ה- DNA המרה bisulfite היה השיטות הנפוצות ביותר לניתוח של אזורים ממוקדים (כלומר, אזור אמרגן של גן יחיד או אי CPG) ^9-12. כל השיטות האלה מסתמכים על המרת bisulfite, תגובה כימית שבי דיאמינציה ציטוזין unmethylated של מומרות לאורציל של, בעוד ציטוזין מפוגל של להישאר ^13,14 ללא פגע. ההגברה PCR של bisulfite-תוצאות המרה DNA בהחלפת אורציל של עם תימין ¹⁵ מאפשרות מתילציה ההפרש לקרוא את דרכו כהבדל בסיס. אמנם שימושי מאוד, המגבלות לשיטות אלה כוללות דיוק נמוך כמותי, אורך קריאה קצר, ותפוקת מדגם נמוכה. כדי לתת מענה למגבלות אלה פיתחנו שיטה שכינינו Bisulfite Amplicon רצף (BSAS) ^16. מטרתה של שיטה זו היא להיות מסוגלת לנתח אזורים הגנומי היעד של עניין במספר גדול של דגימות עם דיוק כמותית גבוה.

BSAS משתמש באלמנטים של שיטות קיימות (המרה bisulfite והגברת PCR ספציפית לאזור) ומשלב אותם עם בנייה פשוטה של הדור הבא ספרייה (בתיווך transposome) ¹⁷ וbenchtop NGS ¹⁸ (איור 1). גישה זו מספקת לשיטת תפוקה יותר גבוהה כמותי ולבחון את מתילציה ציטוזין בכל אזור של עניין. כאן אנו מציגים אתשיטה בפירוט ותיאור גישות לפתרון בעיות ובדיקת איכות תהליך BSAS.

פרוטוקול

1. בידוד חומצות גרעין מרקמות

הערה: Co-בידוד של DNA ו- RNA מאותה דגימת הרקמה מציעה את ההזדמנות כדי לאסוף DNA לניתוח אפיגנטיים וRNA לזווג לניתוח ביטוי גנים. הדוגמא שניתנה כאן היא סוג של טיהור טור מהרקמה ניסיונית אך גישות חלופיות לסוגי מדגם שונים או שיטות בידוד אחרות יכול להיות מועסק. הדרישה העיקרית היא לחומצת גרעין נקיה במיוחד בלי לזהם חלבון או בממסים אורגניים.

1. בחר פיסת הרקמה טריות-קפואה או טרי להומוגניזציה מכאנית ומניח על קרח. חנות או רקמה להעביר צינור microcentrifuge מסביב לתחתית 2.0 מיליליטר.
2. להוסיף חרוז נירוסטה מ"מ אחד 5 לכל צינור המכיל רקמה. הוספת כמות מתאימה של חיץ תמוגה, המבוססת על ההצעות של היצרן של מספר תאים או רקמות במשקל.
3. Homogenize הרקמות באמצעות הומוגניזציה מכאנית טחנת חרוז ב30 הרץ למשך 30 שניות.
   הערה: התדירות ומשך זמן של הומוגניזציה מכאנית תלויה בסוג הרקמה. רקמות רכות תהיה homogenize לחלוטין תוך שימוש בהגדרות המומלצים, ואילו רקמות קשות דורשות הגדרת אופטימיזציה.
4. לבצע את בידוד DNA ו- RNA באמצעות עמודות ספין סיליקה בטמפרטורת החדר הבאות הפרוטוקול של היצרן.
   1. Elute RNA ב -50 μl של מים ומקום RNase ללא על קרח. השתמש RNA לניתוח ביטוי mRNA על ידי qPCR.
   2. Elute DNA בשל חיץ TE 100 μl. elution חזור על את עמודת ה- DNA באמצעות eluent להגדיל ריכוז ה- DNA ואת תשואה. השתמש DNA כדי לכמת מתילציה ממוקדת.
5. להעריך את האיכות של ה- DNA ו- RNA באמצעות ספקטרופוטומטר סטנדרטי לספיגה ב 230 ננומטר, 260 ננומטר, 280 ננומטר, ו320 ננומטר.
   הערה: יחס / A280 A260 צריך להיות ~ 1.8-2 ל- DNA באיכות גבוהה. יחס / A280 A260 צריך להיות ~ 2 לRNA באיכות גבוהה. הנוכחות של הספיגה עודפת ב 230 ננומטר הודימזהמי אטס מהליך הבידוד.
6. איכות לבדוק RNA נוסף באמצעות שבב אלקטרופורזה נימים על פי הוראות יצרן.
   הערה: RNA באיכות גבוהה יהיה מספר שלמות RNA (רין)> 8. הנוכחות של פסגות נוספות בelectropherogram מלבד פסגות rRNA מצביעה על זיהום מדגם.
7. לכמת DNA ו- RNA על ידי assay ניאון על פי הפרוטוקול של היצרן.
   הערה: שימוש assay fluorometric הוא יותר רגיש וספציפי לכימות חומצות גרעין מ spectrophotometry לבד.
8. חנות מבודדת DNA ו- RNA ב -80 ° C.

2. יעד זיהוי ופריימר עיצוב

1. לקבוע את אזור גנומי (ים) של עניין להיות מנותח על ידי BSAS מבוסס על רצף הגנום ההתייחסות המתאים. יזמי גן של גנים הביעו באופן דיפרנציאלי הם מטרות משותפות של quantitation מתילציה.
2. הכן בbisulfite-להמיר סיליקוהגנום התייחסות ed ליישור מאוחר יותר של רצף קורא על ידי שינוי קובץ רצף .fasta בעורך טקסט. באוריינטציה של 5'-3, להחליף הלא CPG ציטוזין של עם של תימין (איור 2).
3. פריימר העיצוב קובע כדי להגביר אזורים של עניין מDNA המרה bisulfite.
   1. לבחור ולהעתיק האזור לא מומר של עניין, באוריינטציה של 5'-3, לתכנית bisulfite הספציפי PCR עיצוב פריימר (איור 3).
      הערה: אורך amplicon bisulfite-PCR אופטימלי הוא 250-400 נ"ב לamplicon שברי טיפול bisulfite DNA וקשה כדי להגביר אזורים נ"ב גדולים> 400. אם, למשל, אזור של kb 1 הוא עניין, יכולים להיות מתוכננים זוגות פריימר מרובים כדי לכסות אזור זה. amplicons לעיצוב תהיה בגודל bp שווה לאיגום קל. הימנע מאורכי amplicon <נ"ב 250, כי אלה עשויים להיות באורך מספיק לדור ספרייה. אורך פריימר אופטימלי לBSAS הוא>20 נ"ב לפריימר.
   2. בחר טווח T _{מ 'של} 55-65 ° C והבדל _מ' T max בין קדימה לאחור פריימרים של 1-2 מעלות צלזיוס.
   3. בחר זוגות פריימר הטובים ביותר המכסים את האזור של עניין. אל תבחר פריימרים המכילים אתרי CPG או ישירות בסמוך לאתרי CPG, כמו זה יגרום להטיה בתגובות PCR. השתמש בצבעי יסוד PCR סטנדרטיים שניתן להזמין מכל מספר של ספקים אקדמיים או מסחריים.
   4. מחדש פריימרים lyophilized במים חופשיים RNase / DNase בבורסת עבודה של 100 מיקרומטר.
4. פריימרים PCR חנות ב -20 ° C. לדלל מניות פריימר 100 מיקרומטר עד 10 מיקרומטר עובדים המניה לתגובות PCR.

3. אופטימיזציה PCR ספציפית Bisulfite

הערה: להמרת bisulfite של הדנ"א הגנומי, מספר ערכות מסחריות שונות להמרת bisulfite זמין. בחר את הערכה או פרוטוקול מתאים ביותר לניסוי המתוכנן.

1. השתמש בין 200 ng עד 2 מיקרוגרם של הדנ"א הגנומי. בניסויים אופטימיזציה, לרוץ תגובות המרה מרובות על מנת שיהיה מספיק bisulfite המיר DNA לתגובות BS PCR מרובים.
2. השתמש כרכי elution (למשל, 10 μl) קטנים של DNA המרה bisulfite לשמור ריכוזים גבוהים DNA.
   הערה: 1-2 μl של DNA המרה bisulfite מספיק עבור PCR תגובות אופטימיזציה אם 1 מיקרוגרם DNA הגנומי שימש לקלט המרה.
3. להגביר DNA המרה bisulfite על ידי PCR הספציפי bisulfite. תגובות BS-PCR דורשות באמצעות פולימראז תקי מסוגל הגברת DNA המרה bisulfite.
   1. להרכיב את התגובה לאופטימיזציה הגברה היעד של amplicon יחיד הבאה. לדוגמאות רבות, להרכיב תגובות בצלחת PCR 96-היטב.
      מאגר תגובת 2x 25 μl
      0.5 Mix dNTP μl
      5 μl 10 מיקרומטר קדימה פריימר (סופי 1 מיקרומטר)
      5 μl 10 מיקרומטר הפוך פריימר(מיקרומטר הסופי 1)
      2 bisulfite תבנית μl המיר DNA
      0.4 μl פולימראז (5 U / μl) DNA
      12.1 מים חופשיים DNase μl (סופי נפח תגובה 50 μl)
   2. לאטום צלחת PCR עם הדבק המתאים או סרט אטום חום.
   3. הנח תגובה בCycler תרמית מתאימה ולהשתמש בתנאי הרכיבה על אופניים הבאים עם מכסה מחומם:
      1. לבצע denaturation ראשוני ב 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
      2. לפגל על ​​95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות.
      3. בשימוש לחשל במשך 30 שניות _{במ 'T} הספציפי של פריימרים. התחל בטמפרטורת חישול כמה מעלות צלזיוס מתחת T _{מ 'של} פריימר לתגובות אופטימיזציה.
         הערה: טמפרטורות חישול הטובות ביותר גם ניתן לקבוע באמצעות Cycler תרמית שיפוע כדי לבדוק מגוון רחב של טמפרטורות.
      4. לבצע הארכה על 72 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות. להאריך את זמן הארכה לamplicons עוד.
      5. חזור על שלבים 3.3.3.2-3.3.3.4 במשך 35 מחזורים לטל לאופטימיזציה ראשונית. מספרי מחזור גבוהים יותר עשויים להיות נחוצים אבל צריך בדרך כלל להימנע כדי למנוע amplifications המשובט שייצור חפצי תגובה.
      6. לבצע הרחבה סופית על 72 מעלות צלזיוס למשך 7 דקות.
      7. החזק תגובות ב 4 מעלות צלזיוס.
   4. דמיין amplicons ידי אלקטרופורזה עמוד. לחלופין, להשתמש בשבב DNA אלקטרופורזה נימים על פי הפרוטוקול של היצרן.
      1. מערבבים 24 μl של תגובת PCR עם 6 μl של צבע טעינת 5x על קרח ומערבולת.
      2. הפוך 1 ליטר של 1x TBE הפעלת מאגר על ידי ערבוב 200 מיליליטר של 5x TBE הפעלת מאגר ו -800 מיליליטר של DDH ₂ O. לדלל סולם DNA לריכוז סופי של 0.5 מיקרוגרם לכל גם בDDH ₂ O וצבע טעינה.
      3. בארות עומס עם 30 μl של תגובות PCR או סולם.
      4. הפעל את הג'ל על 200 V ל~ 45 דקות. לעצור את ריצת ג'ל כאשר החזית לצבוע הראשונה מגיעה לסוף של הג'ל.
      5. כתם ג'ל עם 5 מיקרוגרם / מיליליטרברומיד ethidium על ידי ערבוב 5 μl של 10 מ"ג / מ"ל בשל DDH ₂ O. 100 מיליליטר לכסות את כל הג'ל ולתת דגירה ~ 5 דקות.
      6. תמונת ג'ל באמצעות תיבת אור UV או תרמי multimodal בגל עירור של 482 ננומטר.
      7. בהתייחסות לסולם, גודל amplicons PCR ולקבוע הספציפיות של התגובה על ידי מחפש להקות מרובות (איור 4 א ו- C) אחרות מגודל amplicon הצפוי.
   5. ברגע שתנאים אופטימליים לBS-PCR נקבעו, לבצע BS-PCR על דגימות ניסוי.
      1. לטהר amplicons מפריימרים שנותרו ומרכיבי תגובה אחרים. לבצע טיהור סיליקה טור, חרוז SPRI, או לנקות מבוסס ג'ל וכימות.
      2. amplicons Elute במאגר TE 30 μl.
      3. לכמת amplicons באמצעות assay fluorometric תוך שימוש בפרוטוקולים של היצרן.
      4. אם יש amplicons מרובה לדגימה, בריכה אותם במשקל שווה לכל נפחסכומים ובחנות ב -20 ° C.

4. NGS ספריית הכנה והספרייה QC

הערה: הכנת ספריית BSAS NGS משתמשת בפרוטוקול בתיווך transposome פשוט עם dual-אינדקס (ראה חומרי רשימה לפרטים על בחירת ערכת הכנת ספרייה). שיטה זו מספקת דרך מהירה ביותר ותפוקה גבוהה לבניית ספרייה שאומתה ומראה לא מעט על מנת הטיה ביישומי רצף bisulfite ^16,19. Dual-אינדקס מאפשר ריבוב גבוה יותר של דגימות מאינדקס אחד. סגנונות הכנת ספרייה אחרים עשויים להיות אפשריים, אך לא נבדקו.

1. הכן ספריות NGS מamplicons BS PCR בצלחת PCR 96-היטב. לדלל amplicons ל -0.2 ng / μl למסת קלט סופי של ng 1, או 5 μl של 0.2 ng / μl הדילול. לבצע ניקוי של ספריות שנוצרו באמצעות חרוזים SPRI. השתמש 50-90 חרוזים SPRI μl לבידוד ספריות wה- i פרוטוקול זה. הנפח של חרוזים SPRI תלוי בגודל היעד של ספרייה ומספר מחזור של תגובות רצף רצויים.
   הערה: השתמש ייקר microplate או vortexer צלחת לresuspend חרוזים.
   1. Elute הספריות מהחרוזים ולהעביר לצלחת 96-היטב חדשה וחותמים עם סרט איטום-חום לאחסון ב -20 ° C.
2. לקבוע את הגודל וריכוז של ספריות (איור 4 ב 'ו-ד).
   1. ספריות לרוץ על DNA אלקטרופורזה נימי שינוי גודל שבב על פי הפרוטוקולים של היצרן.
      1. השתמש assay DNA אלקטרופורזה נימי רגישות גבוהה כדי לקבוע את הגודל הממוצע של פסגות ספרייה זוהו והערכת molarity על פי הפרוטוקולים של היצרן.
   2. לכמת ספריות על ידי qPCR, באמצעות פריימרים המיועדים נגד רצפי המתאם בספריות שנוצרו וסטנדרטים שימוש עם ריכוז ידוע.
      1. הפעל qPCR מחדשפעולות על מכשיר בזמן אמת תוך שימוש בהגדרות quantitation המוחלטת על פי הפרוטוקולים של היצרן.
      2. השתמש בגודל של ספריות וquantitation הטוחנות מqPCR כדי לחשב את הריכוזים הטוחנות של הספריות.
3. לדלל ספריות 4 ננומטר באמצעות 10 מ"מ טריס-Cl עם Tween-20 0.1% ב- pH 8.5. ספריות חנות ב96-גם צלחת PCR חתומה עם סרט איטום חום ב -20 ° C.

5. ספריות רצף שימוש ברצף benchtop

1. להפשיר ולהכין חומרים כימיים על פי הוראות יצרן.
2. להפשיר 4 ספריות ננומטר על קרח.
3. הפוך 1 מיליליטר של 0.2 N NaOH בצינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge.
4. בריכה 4 ספריות ננומטר בכמויות נפח שווים, אם ספריות מרובות לשמש.
5. לדלל ולפגל ספריות ונקוו על פי הוראות יצרן לריכוז טוחנת הסופי הרצוי.
   1. שמור מדולל ולפגלספרייה ונקוותה על קרח עד מוכן לטעון במחסנית מגיב.
6. צור מידע מדד גיליון מדגם המכיל מדגם שמות ומתאימים ולציין ליצור .fastq קבצים בלבד.
   1. גיליון מדגם טען בתיקיית גיליון מדגם המקבילה ברצף.
7. הוסף כולל של 600 μl המדולל וספרייה מפוגל למחסנית מגיב במקביל גם.
8. הפעל את תגובות הרצף עד לסיום.

ניתוח 6. מתילציה Quantitation נתונים

הערה: יש מספר רב של תוכניות זמינות לניתוח נתונים NGS כולל שני המקור המסחרי פתוח. ניתן למצוא פרטים על תוכניות הפועלות בכל חבילה ספציפית. נותנות להם הוראות כלליות בכל שלב יחד עם פקודות הספציפיות לחבילת תוכנה זו. (ראה חומרי רשימה לפרטים על תוכנה בשימוש בפרוטוקול זה).

1. קבצי .fastq.gz היבוא לse מתאימיםquencing צינור ניתוח שמירת ציוני איכות (Qscores) לשימוש בקריאת זמירה. (לתכנית דוגמא זו בחר 'יבוא' ובחר את שיטת סידור המשמשת לייצור קורא. בחר .fastq.gz לקרוא קבצים לייבא, ולשמר Qscores מקבצי .fastq לקריאת זמירה יישומים על ידי ביטול בחירה "ציוני איכות בטל 'תחת' כללי אפשרויות '. בחרו מיקום עבור מיובא קוראת ובחר' סיום '.)
   1. לקצץ ולשמר קורא תוך שימוש בהגדרות הבאות בצנרת ניתוח נתונים NGS. (לתכנית זו בחר 'רצפי Trim' תחת 'כלים Core NGS', ובחר את קורא ללהיות מטופח.)
      1. שמור רק קורא מכילים עשרות ≥ Q30. (לתכנית זו בחר 'Trim באמצעות ציוני איכות' ולהגדיר את הגבול ל0.001.)
      2. שמור רק קורא מכיל ≤ 1 נוקלאוטיד המעורפל. (לתכנית זו בחר 'נוקלאוטידים מעורפלים Trim' ולהגדיר"מספר מרבי של אי-בהירויות 'ל1. בחר מיקום לשמירה גזוז קורא ובחר' סיום '.)
   2. מפה גזוז קוראת להתייחסות הגן יומר בסיליקון וbisulfite מ -2.2. (לדוגמא התוכנה בחר 'מפה קוראת להתייחסות' תחת 'כלים Core NGS'. בחר גזוז קורא להיות ממופים ובחר 'הבא'. בחר את רצף ההתייחסות המומר ובחר 'לא מיסוך' תחת 'מיסוך התייחסות ". בחר" הבא '.)
      1. הקצאת עונש מרבי על חוסר התאמה, הוספות, מחיקות ו. פרמטרים שנקבעו כך שאורך הקריאה 100% נדרש כדי למפות עם זהות רצף 90%. לדוגמא תוכנה, להקצות ציון של 3 לחוסר התאמה, הוספות, מחיקות ו. להקצות ציון של 1 לחלק מזערי של אורך קריאה הממופה להתייחסות, ולהקצות ציון של 0.9 לחלק מזערי של זהות בין ממופה לקרוא והתייחסות.
      3. לפלט יישור ליצור מדגם זה כקובץ עצמאי. לדוגמא תוכנה, בחר 'צור עצמאי לקרוא מיפויים' תחת 'אפשרויות פלט' ועל 'שמור' תחת 'טיפול תוצאה ". בחר מיקום לשמירת מיפוי הקריאה ובחר 'סיום'.
   3. הפעל זרימת עבודה וריאנט קורא לממופה קורא. לתוכנת הדוגמא, בחר 'הסתברותי Variant איתור' תחת 'ניתוח resequencing', בחר את מיפוי הקריאה להיות מנותחים ובחר 'הבא'. בחירה 'התעלם התאמות שאינן ספציפיות' תחת 'קראו מסננים' ובחר 'הבא'.
      1. ודא שהרצף הוא בdepה של ≥ 1000 x על ידי הגדרת 'הכיסוי המינימאלי' תחת 'משמעות' 1000.
      2. ודא ששיחת הגרסה הנוכחית היא בשני קדימה לאחור קורא. לתוכנת דוגמא, בחר 'דרוש נוכחות בשני קדימה לאחור יציעים' תחת 'מסנני Variant' ובחר 'הבא'.
      3. יצוא מיושר, גרסה שנקראת נתוני כשולחן מבואר. לתוכנת דוגמא, בחר 'צור שולחן מבואר' תחת 'אפשרויות פלט' ובחר מיקום לשמירת קובץ שולחן גרסה. בחר 'סיום'.
2. לחשב את אחוז 5-MC באמצעות תדרי הגרסה באתרי CPG מבואר באזור של עניין מקובץ שולחן גרסה. התדירות של ציטוזין בC התייחסות בCG היא האחוז 5-MC.
   הערה: בעת שימוש גרסה קוראת אלגוריתמים לCPG של מפוגל מאוד, להחליף cytosines CPG עם thymines. זה זיההfy הממופה ציטוזין של כגרסות, וכתוצאה מכך תדירות ציטוזין בCPG של.
3. לקבוע את יעילות המרת bisulfite (BSC) על ידי החישוב הראשון אחוז C לא באתרי CPG בהתייחסות (C). להכפיל את אחוז CPG אינו C של ידי מספר הממופה _(mp T) T הכולל של, ולחלק בסך של C שמופה בהתייחסות T של (C _MPT). 100 מינוס התדירות מחושבת היא יעילות bisulfite המרה (BSC) של ספרייה ש( משוואת 1).



משוואה 1. יעילות המרת Bisulfite.
הערה: למרות שהגנום של יונקים מכיל כמויות נמוכות מאוד של מתילציה ציטוזין אינו CPG (למעט פוטנציאל של תאי גזע ^20), הגנום צמח מכיל כמות משמעותית. על מנת לקבוע את יעילות המרת bisulfite בreferenc אלההגנום דואר, מסלול מתאים הוא רצף חלק של הגנום המיטוכונדריאלי או הגנום הכלורופלסט או גני unmethylated ידועים כיום במפעל הגנום ²¹ וחישוב יעילות המרה כמתואר לעיל. יעילות המרת Bisulfite צריכה להיות ≥98% ברוב המקרים, עם של C לא מומר פוטנציאלי הנובע ממתילציה CPG שאינו.

תוצאות

BSAS קורא מיושר כהלכה לרצף התייחסות המומר יהיה דומה איור 5. ניתן לזהות בבירור dinucleotides CPG וניתן לאמוד במדינות מתילציה על ידי התבוננות שיחות בסיס באתרי CPG בממופה קורא. לדוגמא, עם פקדי מתילציה, 0 מתילציה% תגרום לכל קורא ממופה לאתרים המכילים CPG (איור 5 א) של טי. בקרות מתילציה 100% יגרמו לכל קורא ממופה קוראת לאתרים המכילים CPG של C (איור 5).

לכמת את תדירות ציטוזין (C / C + T) באתרי CPG מניב את תדירות מתילציה במדגם המקורי. עקומה סטנדרטי נציג המופקת מבקרות כל מתילציה הגנום (n = 3 / יחס מתילציה) מראה הליניאריות של quantitation מתילציה, כמו גם דיוק בquantitation בכל יחס מתילציה (איור 6). כדוגמא לשיטה זו בסך הכל, RNA ו- DNA היו שיתוף iso קשורות זו לזו מהמוח הקטן עכבר ורשתית (n = 4 / קבוצה). ביטוי רודופסין, הביע באופן סלקטיבי ברקמת רשתית, נמדד באמצעות qPCR. ביטוי זוהה רק ברשתית (איור 7 א). באמצעות BSAS, רמות מתילציה CPG היו לכמת באזור אמרגן רודופסין. רמות מתילציה מצטברות ברחבי אזור האמרגן היו> 80% במוח הקטן בהשוואה ל< 15% ברשתית (p <0.001, t-test פרמטרית) (איור 7). יתרונות BSAS quantitation מתילציה מquantitation מתילציה ספציפי לאתר, ורמות מתילציה ניתן להשוות על בסיס CPG ספציפי על פני כל אזור גנומי נתון. רמות מתילציה CPG פני אמרגן רודופסין היו גבוהות יותר משמעותי בדגימות המוח הקטן בהשוואה לדגימות רשתית (p <0.001, t-test פרמטרית בכל אתר CPG) (איור 7 ג).

1highres.jpg "/>
איור 1:. סכמטי של שיטת BSAS בשיטה זו, הדנ"א הגנומי הוא bisulfite המרה לשנות cytosines unmethylation לuracils. בהמשך לכך, במהלך PCR uracils אלה השתנו לthymines. PCR הגברה מכוונת נגד אזורים של עניין ומעשירה מאוד עבור רק רצפים אלה. Amplicons PCR כתוצאה מכך הם הפכו לספריות צמודות כפולים בתהליך tagmentation פשוט. בהמשך לכך ספריות רצף ברצף הדור הבא benchtop ורצף כניסות ממופים למתילציה בסיליקון והמיר רצף התייחסות ואחוזים של ציטוזין של נקבע באופן ספציפי לבסיס.

איור 2:. בהמרת bisulfite סיליקון ושל האזור של עניין כל אזור של עניין מכל התייחסות הגנומי יכול להיות אין תמיכה בבחירהטד בהמרת bisulfite סיליקון. cytosines ללא CPG מוחלף בתימין של ברצף ההתייחסות. cytosines CPG להישאר cytosines בbisulfite המיר התייחסות.

איור 3:. פריימרים מיקום פריימר Bisulfite PCR נועדו נגד בbisulfite סיליקון והמיר רצף התייחסות. Primers הוא להיות מתוכנן כך שהם אינם חופפים dinucleotides CG או תוכנן בסמוך לdinucleotides CG.

איור 4: דוגמאות לamplicons PCR באיכות הגבוהה ועניה וספריות רצף עקבות electropherogram נציג ותכנית ג'ל () amplicon האידיאלית עבור דור ספרייה בתיווך transposome עם אחד גבוה. מוצר ריכוז. הספרייה (B) שהופקה מamplicon זה מראה ריכוז גבוה ואפילו הפצת גודל. amplicons PCR (C) מאיכות ירודה, יכולה להיות נמוכה בגודל, ריכוז, ומכיל מספר רב של מוצרים ו / או הדימרים פריימר. amplicons האיכות הירודה אלה תוביל ל( D) נכשלה דור ספרייה עם ריכוז נמוך והתפלגות גודל נמוכה.

איור 5: דוגמאות לפלטי רצף מפקדי מתילציה. (א) בסיליקון והמיר רצף התייחסות עם אתרי CPG מסומן באדום. 0% שליטת מתילציה ממופות קוראת לthymines נבחר האזור מראה (שיא תאוות בצע) מיפוי באתרי CPG. שליטת מתילציה 100% (B) הממופה קוראת להראות המיפוי של ציטוזין (גולת כותרת הכחולה) באתרי CPG.

together.within-page = "תמיד">
איור 6:. Quantitation מתילציה על פני מגוון של בקרות מתילציה בקרות מתילציה הגנום כולו מעורבות ביחסי מתילציה (n = 3 / יחס) בין 0% ל 100% היו לכמת באמצעות BSAS. זומם לכמת צפוי לעומת לכמת מדגים הליניאריות של quantitation שליטת מתילציה. בכל הפקדים, היה דיוק גבוה בquantitation מתילציה.

איור 7: דוגמא לניתוח מתילציה DNA וביטוי גנים לזווג מדגימות רקמה. מתילציה אמרגן הממוצעת Rhodopsin לכמת ידי BSAS בין המוח הקטן וDNA רשתית (*** p <0.001, t-test פרמטרית) ביטוי mRNA היחסי Rhodopsin מהמוח קטן עכבר ורקמת רשתית (). (ב). <רמות strong> C ספציפי לאתר CPG) מתילציה פני אמרגן רודופסין (-244 +6, ביחס לאתר תחילת שעתוק [TSS]) במוח קטן עכבר וDNA הרשתית.

דיון

BSAS מאפשר להתמקד quantitation, מתילציה DNA מדויק עם יכולות תפוקה גבוהות בשני מספר הדגימות ומספר המטרות. בנוסף, דור ספרייה זו באמצעות tagmentation תיווך transposome דורש DNA קלט פחות, הוא מהיר יותר ומכיל פחות שלבים מאשר גז מסורתי וטכניקות קשירת מתאם שלאחר מכן. שיפורים אלה על פני שיטות קיימות מאפשרים ניתוח מתילציה DNA מדויק ברמת בסיס של כל מטרה של עניין. יתר על כן, BSAS מספק שיטה חדשה לאישור של אזורים של עניין (אזורי מתילציה באופן דיפרנציאלי (DMRS), איי CPG, אזורי רגולטורים) שזוהו באמצעות הגנום כולו ²² או ²³ ללכוד גישות bisulfite. תוך שימוש בגישות המאונכות אישור ויותר כמותית שיטות מדויקות משפרת את הקשיחות אנליטי של מחקרי epigenomic. עומק הקריאה הגבוה שהושג עם BSAS מאפשר quantitation מדויק במרווח ביטחון צר, מחדשsulting בquantitation המדויק ^16. בנוסף, את היכולת להפעיל דגימות רבות בניסוי אחד יכולה להגדיל את גודל המדגם לאישורים של שיטות הגנום כולו, אשר יגדילו את הכח הסטטיסטי; חולשה של מחקרים רבים אפיגנטיים הנוכחיים. חשוב לציין, BSAS מספק quantitation מתילציה CPG בסיס ספציפי, המאפשר לדור של השערות הניתנות לבדיקה למחקר אפיגנטיים. השערות כגון מתילציה עלתה באלמנט תגובה ספציפי תוביל לירידה בכריכה של גורם שעתוק ספציפי. BSAS, בשילוב עם נתונים ביטוי mRNA לזווג, מספק שיטה להשגת שתי רגולציה אפיגנטיים וביטוי mRNA בתוך פיסת רקמה או אוכלוסיית תא בודדת. מדידות מותאמים של רגולציה וביטוי גם להגדיל את הקשיחות ואת ההשפעה של הממצאים המדעיים.

צעדים קריטיים בפרוטוקול BSAS כוללים עיצוב פריימר, amplicon אופטימיזציה, ודור ספרייה /QC. ההטיה PCR הוא הציג אם פריימרים אינם מתוכננים כראוי ולהגביר את יעילות בשונה ^8. שימוש בסטנדרטים מתילציה, כגון תקני ציטוזין 100% ו 0% שנוצרו אנזימים מפוגלים, ניתן להשתמש כדי לקבוע את המידה, אם בכלל, של ההטיה quantitation מתילציה, ושליטה מתודולוגיים נכונה כאשר כימותי מתילציה ^16. בדומה לכך, יש לנקוט בזהירות בעת ביצוע אופטימיזציה לתגובות PCR ליצירת amplicon באיכות גבוהה יחיד. אם לא amplicon נוכחת באמצעות ההנחיות הציעו מפורטות בפרוטוקול, צעדי אופטימיזציה כוללים מספר גדל והולך PCR מחזור או סכום קלט bsDNA. אם יש מוצרי PCR מרובים, כוללים פריימר-הדימרים, צעדי אופטימיזציה כוללים הפחתת כמות קלט bsDNA, הפחתת ריכוזי קלט הטוחנות פריימר PCR, עלייה בטמפרטורות חישול, או להקטין את מספר מחזור PCR. אחד או שילוב של נהלי אופטימיזציה אלה מניב תוצאות מספקות כדי ליצור HIG אחתamplicon h-איכות. לחלופין, עיצוב מחדש של פריימרים הוא גישה טובה לקבוצות פריימר שלא להניב amplicon יחידה. לאלו אזורים שבם העיצוב מחדש אינו מתאים או אפשרי, מנוון סטי פריימר כולל שניהם עלול של ציטוזין והטימין של באתרי CPG בפריימרים קדימה ואדנין של וגואנין של באתרי CPG בפריימרים הפוכים לעבוד. עם זאת, ערכות פריימר אלה צריכים אופטימיזציה נוספת כדי להבטיח שאין PCR הטיה מתרחשת, תהליך מחוץ להיקף של פרוטוקול זה. ספריות איכות הן חשובות ביותר להצלחה. ודא שאמצעי QC מתבצעים כדי לקבוע את הגודל, איכות וכמות של ספריות לפני הרצף. תגובות רצף נוטות לכישלון עם קלט של ספריות באיכות נמוכה. הטיה בquantitation מתילציה ניתן למתן על ידי הבטחה כי תדרי מתילציה נמצאים בשני קדימה לאחור רצף קורא. בנוסף, ציוני איכות של בסיסי יישור לאתרי CPG צריכים להיות ≥Q30 גבוה שיתוףnfidence בquantitation. בעוד שאחרים הראו מעט קודם לכן לשום הטיה בתגובות tagmentation של DNA המרה bisulfite ^19, להבטיח את המדדים שתוארו לעיל מאפשר לאישור quantitation מתילציה ההטיה הנמוך.

BSAS מודד כיום מתילציה באתרי CPG, לעומת זאת, הרחבות עתידיות של שיטה זו תאפשר מדידות מזווגות של CPG 5-HMC עם התוספת של צעדים ניסיוניים הבחנה בין 5-MC ו-5- HMC כגון החדרת perruthenate אשלגן לפני המרת bisulfite ^24. זה יגביר את ההשפעה של שירות BSAS כך שהוא מאפשר למתילציה לזווג, שני 5-MC ו-5- HMC, ונתונים ביטוי על מנת לקבוע תפקידי רגולציה של ביטוי גני מתילציה DNA. הכנת ספריית תיווך Transposome של amplicons PCR אין לגרום לעומק רצף ירידה בקצוות של אזורים מוגברים. לכן, אזורים של ריבית גבוהה צריכים להיות מתוכננים לישיבה באמצע amplicons. איךאי פעם, כי BSAS יוצר רצף לקרוא מעמקי> 1000 X, דיוק כמותי של 5-MC מדידות ליד הקצוות של אזורים מוגברים נותרים גבוהות.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Agilent 2100 Bioanlyzer	Agilent	G29393AA
Agilent RNA 6000 ערכת ננו	Agilent	5067-1511
ערכת DNA ברגישות גבוהה Agilent		5067-4626
טייפון 9200	Amersham/GE Healthcare Life Sciences
Agencourt AMPure XP - טיהור PCR	בקמן קולטר	A63880	5 מ"ל
ספק כוח בסיסי PowerPac	Bio Rad	164-5050
twin.tech PCR צלחת 96	Eppendorf	951020362	חצאית למחצה
	Eppendorf	0030127838
רדיד איטום חום	Eppendorf	0030127854
אוטם חום	Eppendorf	5390000.024
0.1-10 & #956; l טיפים	אפנדורף	0030073.002
2-200 & #956; l טיפים	אפנדורף	0030073.045
50-1,000 & #956; l טיפים	אפנדורף	0030073.100
MixMate	Eppendorf	5353000.014
1.5 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה	Eppendorf	0030121.023
צנטריפוגה 5424	Eppendorf	5424000.010
2.0 מ"ל צינור מיקרוצנטריפוגה	Eppendorf	022363352
Nextera XT ערכת הכנת דגימת DNA	Illumina	FC-131-1024	24 rxn
Nextera XT Index Kit	Illumina	FC-131-1001	24 indexes
MiSeq Desktop Sequencer	Illumina
MiSeq Reagent Kit v2	Illumina	MS-102-2002	300 מחזורים
KAPA SYBR FAST ערכת qPCR אוניברסלית	KAPA Biosystems	KK4824
Quant-iT PicoGreen dsDNA ערכת בדיקת	Life Technologies	P7589
Quant-iT RiboGreen ערכת בדיקת RNA	Life Technologies	R11490
ProFlex 96 בארות PCR מערכת	Life Technologies	4484075
Novex 6% TBE DNA ג'ל	Life Technologies	EC6261BOX	10 בארות
Novex TBE Running Buffer	Life Technologies	LC6675	5x (1 L)
Novex Hi-Density TBE Sample Buffer	Life Technologies	LC6678	5x (10 מ"ל)
1 Kb Plus DNA	Ladder Life Technologies	10787-018
Xcell SureLock Mini-Cell	Life Technologies	EI0001
UltraPure 10 מ"ג/מ"ל אתידיום ברומיד	טכנולוגיות חיים	15585-011
7900HT מהיר בזמן אמת PCR מערכת	Life Technologies	4329001	384 בארות בלוק
DynaMag-96 Side Skirted	Life Technologies	12027
SpectroMax M2 Multi-Mode Microplate קורא	מכשירים מולקולריים/VWR	89429-532
AllPrep DNA/RNA מיני ערכת	Qiagen	80204
חרוזי נירוסטה	Qiagen	69989	5 מ"מ
CLC גנומיקה Workbench	Qiagen		תוכנה לצינור מתילציה
QIAQuick PCR ערכת טיהור	Qiagen	28104	50 rxn
TissueLyser II	Retsch/Qiagen	85300
סיגמא	מים ללא נוקלאז	W4502
TRIS הידרוכלוריד	סיגמא	PHG0002-100G
Tween-20	Sigma	P9416-50ML
NanoDrop 2000	Thermo Scientific
384-well צלחת עם חצאית מלאה, Standard	Thermo Scientific	AB-1384
Absolute qPCR Seal	Thermo Scientific	AB-1170
EZ DNA מתילציה-ברק ערכת	Zymo Research	D5030	50 rxn
ZymoTaq DNA פולימראז	Zymo Research	E2001	50 rxn