ההדמיה המקומית Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; אותות בתאי יונקים בתרבית

סיכום

כאן אנו מציגים טכניקות להדמיית אירועי Ca²⁺ מקומיים בתיווך IP₃ באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בתאי יונקים שלמים הטעונים באינדיקטורים Ca²⁺ יחד עם אלגוריתם שהופך את הזיהוי והניתוח של אירועים אלה לאוטומטיים.

תקציר

Cytosolic Ca ^{2 +} יונים להסדיר היבטים רבים של פעילות סלולרית כמעט בכל סוגי תאים, שליטה תהליכים רחבה היקף כמו שעתוק הגנים, רגישות חשמל וחלוקה של תאים. הגיוון והסגוליות של Ca ^{2 +} איתות נובעים ממנגנונים שבאמצעותם Ca ^{2 +} אותות נוצרים לפעול על סולמות זמן ומרחב שונים, הנעים בין תנודות תא-רחב וגלים המתרחשים על פני תקופות של דקות לCa ^{2 +} microdomains החולף המקומי ^{(2 +} Ca פחזנית) אלפיות שנייה קיימא. התקדמות שחלה באחרונה באלקטרון כפול CCD מצלמות (EMCCD) כעת לאפשר להדמיה של ^{2 +} אותות Ca המקומיים עם רזולוציה מרחבית 128 x 128 פיקסלים בשיעורים של> 500 מסגרות לשנייה ^-1 (fps). גישה זו היא מקבילה מאוד ומאפשרת ניטור סימולטני של מאות ערוצים או אתרי נשיפה בניסוי יחיד. (1 PE Gb בערך עם זאת, הכמויות עצומות של נתונים שנוצרודקות r) להבהיר זיהוי חזותי וניתוח של Ca ^{2 +} אירועים המקומיים מעשי. כאן אנו מתארים ומדגימים את ההליכים לרכישה, האיתור, וניתוח של ה- IP המקומי ₃ בתיווך Ca ^{2 +} אותות בתאי יונקים שלמים עמוסים ^{2 +} אינדיקטורים Ca באמצעות שתי עלית הקרינה רחב בתחום (WF) והשתקפות פנימית מוחלטת מיקרוסקופ פלואורסצנטי (TIRF). יתר על כן, אנו מתארים אלגוריתם שפתח בתוך Python סביבת תוכנת הקוד הפתוח שממכן את זיהוי וניתוח של Ca ^{2 +} אותות המקומיים אלה. אלגוריתם localizes אתרים של Ca ^{2 +} שחרור עם רזולוציה תת-פיקסל; מאפשר סקירת משתמש של נתונים; ופלטי רצפים של אותות יחס הקרינה זמן יחד עם משרעת ונתונים הקינטית בשולחן Excel תואם.

מבוא

יוני סידן (Ca ^{2 +)} בכל מקום להסדיר במגוון רחב של תהליכים ביולוגיים, כוללים ביטוי גנים, הפרשה ושינויים ארוכי טווח בפלסטיות הסינפטית ^1. אחת דרכים שבאמצעותו Ca ^{2 +} יכול לפעול באופן שונה היא באמצעות דפוסי מרחב ובזמן השונים של Ca ^{2 +} אותות תא יכול לייצר. לגבה דוגמא העולמיים בcytosolic התכווצות הדק [Ca ^{2 +]} ברקמת שריר חלק ² ואילו קטן יותר, גבהים חולפים מקומיים (Ca ^{2 +} microdomains המקומי) לעורר ביטוי גנים חיוני ללמידה וזיכרון ^3.

cytosolic חינם [Ca ^{2 +]} נשמר במנוחה ~ 10....

פרוטוקול

אנו מציגים נהלים מפורטים להדמית Ca ^{2 +} אירועים מקומיים בתאי SH-SY5Y נוירובלסטומה האנושית. ניתן להתאים נהלים אלה ^ל2+ אותות תאיים תמונת Ca בסוגי תאים רבים ^8-10.

1. הכנת תאים

1. תרבות התאים להיות צילמו על פי הוראות המופיעות באתר האינטרנט של הספק שלהם.
2. כמה ימים לפני ההדמיה, תאי קציר גדלו בבקבוק תרבות רקמות באמצעות 1 מיליליטר של 0.25% טריפסין / EDTA (2-3 דקות). בעקבות ניתוק, להוסיף נפח שווה של תקש....

תוצאות

איור 1 א מציג תמונת WF של מנוחה הקרינה קאל-520 בתאי נוירובלסטומה SH-SY5Y האנושיים טעונים גם עם ci-IP _3. חשיפה של תאים אלה לבזק 100 UV msec לתמונה-שחרור i-IP ₃ עוררה Ca ^{2 +} פחזניות חולפות באתרים בדידים (שצוין על ידי העיגולים הלבנים באיור 1 א). עקבות הקרינה שנמדדו באתרים אלה הראו שלב עלייה מהיר הודות לפתחים חולפים של IP ₃ Rs, ולאחר מכן שלב הרבה יותר איטי נופל (איור 1 ו1C) כCa ^{2 +}

דיון

אנו מתארים כאן פרוטוקולי הדמיה Ca ^{2 +} אירועים מקומיים בתאי יונקים בתרבית באמצעות Ca ^{2 +} אינדיקטורים ניאון. יתר על כן, אנו מתארים אלגוריתם עם ממשק משתמש אינטואיטיבי המאפשר אוטומצית זיהוי וניתוח של נתונים שנרכשו. ההליך המתואר כאן לנצל את Ca ^{2 +} מחוון ניאון קאל-520, אך רבים Ca ^{2 +} צבעים רגישים אחרים כגון Fluo-3, Fluo-4, Fluo-8 ואורגון גרין BAPTA-1 לבצע מספיק טוב לתמונת Ca ^{2 +} microdomains. טיפול אינו צריך לנקוט כדי להבטיח שגרסות .......

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
נוירובלסטומה אנושית תאי SH-SY5Y	ATCC	CRL-2266
Cal-520/AM	AAT Bioquest Inc.	21130
ci-IP3 (D-23-O-Isopropylidene-6-O-(2-nitro-4,5-dimethoxy)benzyl-myo-Inositol 1,4,5-trisphosphate-hexakis(propionoxymethyl) Ester	SiChem	cag-iso-2-145-10
DMSO/20% pluronic F127	Invitrogen	P-3000MP
EGTA/AM	Invitrogen	E-1219
צלחות הדמיה עם תחתית זכוכית 35 מ"מ	MatTek	P35G-1.5-14-C