ההדמיה המקומית Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; אותות בתאי יונקים בתרבית

סיכום

כאן אנו מציגים טכניקות להדמיית אירועי Ca²⁺ מקומיים בתיווך IP₃ באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בתאי יונקים שלמים הטעונים באינדיקטורים Ca²⁺ יחד עם אלגוריתם שהופך את הזיהוי והניתוח של אירועים אלה לאוטומטיים.

תקציר

Cytosolic Ca ^{2 +} יונים להסדיר היבטים רבים של פעילות סלולרית כמעט בכל סוגי תאים, שליטה תהליכים רחבה היקף כמו שעתוק הגנים, רגישות חשמל וחלוקה של תאים. הגיוון והסגוליות של Ca ^{2 +} איתות נובעים ממנגנונים שבאמצעותם Ca ^{2 +} אותות נוצרים לפעול על סולמות זמן ומרחב שונים, הנעים בין תנודות תא-רחב וגלים המתרחשים על פני תקופות של דקות לCa ^{2 +} microdomains החולף המקומי ^{(2 +} Ca פחזנית) אלפיות שנייה קיימא. התקדמות שחלה באחרונה באלקטרון כפול CCD מצלמות (EMCCD) כעת לאפשר להדמיה של ^{2 +} אותות Ca המקומיים עם רזולוציה מרחבית 128 x 128 פיקסלים בשיעורים של> 500 מסגרות לשנייה ^-1 (fps). גישה זו היא מקבילה מאוד ומאפשרת ניטור סימולטני של מאות ערוצים או אתרי נשיפה בניסוי יחיד. (1 PE Gb בערך עם זאת, הכמויות עצומות של נתונים שנוצרודקות r) להבהיר זיהוי חזותי וניתוח של Ca ^{2 +} אירועים המקומיים מעשי. כאן אנו מתארים ומדגימים את ההליכים לרכישה, האיתור, וניתוח של ה- IP המקומי ₃ בתיווך Ca ^{2 +} אותות בתאי יונקים שלמים עמוסים ^{2 +} אינדיקטורים Ca באמצעות שתי עלית הקרינה רחב בתחום (WF) והשתקפות פנימית מוחלטת מיקרוסקופ פלואורסצנטי (TIRF). יתר על כן, אנו מתארים אלגוריתם שפתח בתוך Python סביבת תוכנת הקוד הפתוח שממכן את זיהוי וניתוח של Ca ^{2 +} אותות המקומיים אלה. אלגוריתם localizes אתרים של Ca ^{2 +} שחרור עם רזולוציה תת-פיקסל; מאפשר סקירת משתמש של נתונים; ופלטי רצפים של אותות יחס הקרינה זמן יחד עם משרעת ונתונים הקינטית בשולחן Excel תואם.

מבוא

יוני סידן (Ca ^{2 +)} בכל מקום להסדיר במגוון רחב של תהליכים ביולוגיים, כוללים ביטוי גנים, הפרשה ושינויים ארוכי טווח בפלסטיות הסינפטית ^1. אחת דרכים שבאמצעותו Ca ^{2 +} יכול לפעול באופן שונה היא באמצעות דפוסי מרחב ובזמן השונים של Ca ^{2 +} אותות תא יכול לייצר. לגבה דוגמא העולמיים בcytosolic התכווצות הדק [Ca ^{2 +]} ברקמת שריר חלק ² ואילו קטן יותר, גבהים חולפים מקומיים (Ca ^{2 +} microdomains המקומי) לעורר ביטוי גנים חיוני ללמידה וזיכרון ^3.

cytosolic חינם [Ca ^{2 +]} נשמר במנוחה ~ 100 ננומטר, אבל במהירות יכול לעלות לכמה מיקרו-טוחנת הבאות הזרם של Ca ^{2 +} לcytosol דרך Ca ^{2 +} תעלות יונים -permeable ממוקמות בקרום הפלזמה ועל ידי השחרור של Ca ^{2 +} משל תאיתtores. המעבדה שלנו מתמקדת בקולט אינוסיטול 1,4,5-trisphosphate (IP ₃ R), אשר מהווה ערוץ הפצת Ca ^{2 +} הממוקם בקרום reticulum endoplasmic (ER). על הכריכה של שני IP ₃ וCa ^{2 +} לcytosolic הפעלת אתרים של הקולטן, ערוץ R IP ₃ נפתח לשחרור Ca ^{2 +} מוחרם בתוך לומן ER. שחרורו של Ca ^{2 +} עשוי להישאר מוגבל מרחבית למקבץ קטן של IP ₃ R כדי ליצור microdomain cytosolic מקומי של Ca ^{2 +} (Ca ^{2 +} נשיפה ⁴⁾ או, בהתאם לקרבה של אשכולות הסמוכות של IP ₃ Rs, רשאי להפיץ בכל תא על ידי גיוס אתרי נשיפה מרובים באמצעות תהליך של Ca ^{2 +} -release Ca ^{2 +} -induced (CICR) ^5,6.

ההקדמה של צבעי המחוון ^{2 +} מולקולה קטנה ניאון Ca שפותחה על ידי רוג'ר ⁷ Tsien, בשילוב עם imagi מיקרוסקופיה המתקדמת ng טכניקות, יש להקל באופן משמעותי את ההבנה של Ca ^{2 +} איתות שלנו. התקדמות שחלה באחרונה מצלמות המשמשות למיקרוסקופיה בחברה מאפשרת הדמיה Ca ^{2 +} אירועים מקומיים חולפים כמו פחזנית עם רזולוציה מרחב ובזמן חסרת תקדים. כיום מצלמות זמינות EMCCD לאפשר הדמיה עם 128 x 128 פיקסלים ב> 500 מסגרות לשנייה ^-1 (fps) והדור החדש של מוליכים למחצה תחמוצת מתכת משלימות מצלמות (CMOS) מספקות רזולוציה גבוהה יותר פיקסל, ומהירות אפילו מהר יותר על חשבון מעט גבוה יותר רמות רעש. בשיתוף עם מיקרוסקופיה הכוללת ההשתקפות פנימית (TIRF) ניתן כיום לתמונה Ca ^{2 +} אחד אירועי ערוץ ^8,9. גישה זו מאפשרת להדמיה של מאות ערוצים / אירועים בו זמנית, תוך יצירת קבוצות גדולות נתונים (בערך 1Gb לדקה) ההופכים את העיבוד ידני, זיהוי חזותי וניתוח מעשי ולמקם את אחריות על הפיתוח של אלגוריתמים אוטומטיים.

s = "jove_content"> כאן, אנו מציגים נהלים ופרוטוקולים להדמית Ca ^{2 +} אותות מקומיים בתאי יונקים שלמים באמצעות Ca ^{2 +} אינדיקטורים ניאון. בנוסף, אנו מראים אלגוריתם שפותח בפייתון סביבת הקוד הפתוח המאפשר אוטומצית זיהוי וניתוח של ^{2 +} Ca אירועים המקומיים צילמו על ידי שני TIRF ומיקרוסקופיה עלית הקרינה שדה רחב קונבנציונלית (WF). למרות שאנו מתארים גישות אלה בהקשר של IP ₃ -generated Ca ^{2 +} אותות, הם ניתנים בקלות ללמוד שינויים מקומיים בcytosolic [Ca ^{2 +]} הנובעים ממגוון רחב של Ca ^{2 +} תעלות יונים -permeable ממוקמות באו המשטח קרום או אברונים תוך-תאיים ^8-10.

פרוטוקול

אנו מציגים נהלים מפורטים להדמית Ca ^{2 +} אירועים מקומיים בתאי SH-SY5Y נוירובלסטומה האנושית. ניתן להתאים נהלים אלה ^ל2+ אותות תאיים תמונת Ca בסוגי תאים רבים ^8-10.

1. הכנת תאים

1. תרבות התאים להיות צילמו על פי הוראות המופיעות באתר האינטרנט של הספק שלהם.
2. כמה ימים לפני ההדמיה, תאי קציר גדלו בבקבוק תרבות רקמות באמצעות 1 מיליליטר של 0.25% טריפסין / EDTA (2-3 דקות). בעקבות ניתוק, להוסיף נפח שווה של תקשורת בתרבות כדי להשבית טריפסין.
3. לבצע ספירת תאים באמצעות hemocytometer וזרע תאים לתוך מנות הדמיה זכוכית תחתונה בצפיפות של 3-7 x 10 ⁴ תאים לכל צלחת. בחרו את תאים לניסויי הדמיה כאשר הם מגיעים למפגש 60% (2-3 ימים).

2. הכנת פתרונות וריאגנטים

1. הכן HEPES Ca ^{2 +} המכיל נאגרתמיסת מלח (Ca ^{2 +} -HBSS) מורכב מ( מ"מ): 135 NaCl, 5.4 KCl, 2 CaCl _2, 1 MgCl _2, 10 HEPES, ו -10 גלוקוז; pH = 7.4 בטמפרטורת חדר (RT) עם NaOH. הכן -HBSS Ca ^{2 +} ללא תוספת סוכר ובחנות ב 4 ° C; להוסיף גלוקוז לפתרון מייד לפני השימוש.
2. Solubilize צורות קרום-permeant של Ca ^{2 +} מחוון ניאון קאל-520 (1 מ"מ), ci-IP ₃ (200 מיקרומטר), וEGTA (100 מ"מ) בsulfoxide דימתיל (DMSO) המכיל 20% F-127 pluronic. Aliquot ריאגנטים אלה לתוך צינורות Eppendorf וחנות, מוגנים מפני לחות והאור, ב -20 ° C.

3. תאי Loading עם ממברנה-permeant קאל-520, ci-IP ₃ וEGTA

1. הכן את "מאגר הטעינה" על ידי דילול פתרונות מניות של קרום-permeant קאל-520 וci-IP ₃ לריכוז סופי של 5 מיקרומטר ו 1 מיקרומטר, בהתאמה, ב-HBSS Ca ^{2 +.}
2. לשאוב מ"קתקשורת וlture לשטוף תאים על ידי החלפת מדיה עם Ca ^{2 +} -HBSS שלוש פעמים.
3. הסר Ca ^{2 +} -HBSS דגירה תאים במאגר טעינה במשך 60 דקות ב RT בחושך.
4. הסר מאגר טעינה ולשטוף תאים על ידי החלפת מדיה עם Ca ^{2 +} -HBSS שלוש פעמים.
   1. אם תרצה, בשלב זה, תאי עומס עם EGTA / AM על ידי דילול מניות הפתרון לריכוז סופי של 5 מיקרומטר Ca ^{2 +} -HBSS ולאחר מכן דגירה תאים במשך 30-60 דקות ב RT בחושך. לאחר דגירה זה, לשטוף תאים שלוש פעמים עם -HBSS Ca ^{2 +} לפני שתמשיך לשלב 3.5.
5. דגירה תאים ב-HBSS Ca ^{2 +} למשך 30 דקות כדי לאפשר לדה-esterification של חומרים כימיים טעונים.
6. מייד לפני ההדמיה, להחליף -HBSS Ca ^{2 + 2 +} עם -HBSS "הטרי" Ca כדי להסיר כל צבע שאולי דלף לאמבטיה במהלך הדגירה הסופית.

4. Ca ^{2 +} רכישת תמונה

1. מקום טיפה קטנה של שמן טבילה על מטרת 100X APO TIRF (NA 1.49).
2. הר צלחת ההדמיה על הבמה של מיקרוסקופ ההפוך ולהביא את התאים אל מוקד באמצעות אור מועבר. חשוב כדי להבטיח את צלחת ההדמיה כדי למנוע תנועה במהלך הקלטה.
3. להאיר תאים עם לייזר 488 ננומטר כדי לרגש את קאל-520 ולאסוף הקרינה נפלטת (λ> 510 ננומטר) באמצעות מצלמה EMCCD במהירות גבוהה.
   הערה: חבילת התוכנה המפעילה את המיקרוסקופ מאפשרת למשתמש לתרגם עדשה מתמקדת המאפשרת את קרן הלייזר שהציגה גם בקצה הקיצוני של הצמצם חזרה האובייקטיבי (לעירור TIRF) או מרכזי יותר (לעירור "WF").
4. שימוש בתוכנת EMCCD, להפחית תחום ההדמיה מ512 x 512 פיקסלים מלאים על מנת לאסוף נתונים ברזולוציה של הזמן הדרוש כדי ללכוד Ca ^{2 +} אירועים מקומיים.
   הערה: לדוגמא, quad מרכזרכישה של 256 x 256 פיקסלים מאיצה את קצב הרכישה ל -66 fps. אפשר גם להגדיל עוד יותר את קצב הפריימים של המצלמה EMCCD 500 fps באמצעות פונקצית מצב יבול מבודדת.
5. להגדיר את התוכנה כדי להקליט באופן אוטומטי כמה שניות של פעילות בסיסית, לספק הבזק UV לתאים ולהמשיך להקליט עוד שניות 10-30.
   הערה: פלאש UV מועבר באמצעות מקור אור קסנון הקשת הציג דרך UV משקף מראה dichroic ביציאה האחורית של המיקרוסקופ. המשך ועוצמת פלאש UV מותאם באופן אמפירי לעורר תדירות רצויה של Ca ^{2 +} אירועים מקומיים.
6. לשמור קבצים בתמונת ערימות לניתוח off-line.

5. ניתוח ^{2 +} תמונה האוטומטית Ca

הערה: ניתן להציג, תהליך ולנתח נתונים שנתפסו באמצעות הרבה חבילות תוכנה מסחריות. עם זאת, יש לנו פיתחנו אלגוריתם לאוטומציה זיהוי במהירותניתוח ד של Ca ^{2 +} אותות מקומיים. תיאור מפורט של מסנני מרחב ובזמן בשימוש באלגוריתם זה, ניתן למצוא דור של ΔF / F ₀ והזדהות / ניתוח שגרה ב ^-11. אלגוריתם זה פותח כדי לרוץ על Python פלטפורמת תוכנה בקוד הפתוח, וניתן להשיג, יחד עם מדגם נתוני ניסוי והוראות למשתמש מפורטים, על ידי המחבר המקביל בדואר אלקטרוני (ismith@uci.edu).

1. המרת קבצים ללהיות מיובא לתוך האלגוריתם אישית בכתב לפורמט קובץ .tiff רב המטוס.
2. אתר את התיקייה המכילה את אלגוריתם הניתוח ולחץ לחיצה כפולה על run.exe.
3. בחר את קובץ .tiff להיות מנותח.
4. בחר פרמטרים ניתוח בתיבת הדו-שיח הפתוחה. ראה איור 2 א לפרמטרים ברירת מחדל עבור נתוני המדגם.
5. לקבוע את הרמה השחורה יש לקזז מהערימה התמונה או על ידי הזזת הסמן לחלק משדה הראייה שעושה not מכיל תא (ראה איור 2) או על ידי הזנת רמה שחורה באמצעות הפקודה 'רמת צבע השחורה בהגדרה' ידני.
6. שים לב ארבעה חלונות במסך הבאים ניתוח על ידי התוכנה (איור 2C-F). C הוא תמונה בשחור-לבן של מנוחה הקרינה מהתאים להיות מנותחת. ריבועים לבנים על גבי תמונה זו הם מקומות אירוע, שנקבעו כעמדות centroid של פונקציות גאוס דו-ממדיות המותאמות לאירועים.
7. לחץ על כל מיקום אירוע או לחץ על מקשי סמן למחזור בין אירועים. על כך מופחת רקע, גאוס החליק שינויי יחס הקרינה (ΔF / F ₀₎ בכל אחד מהאתרים הללו העדכון בחלון ד
   הערה: אדום מודגש אירועים נחושים מקורן אתר מסוים ושלא מ'לדמם דרך "מפעילות המקומית לאתרים סמוכים. העקבות הכחולות התחתונות מציינת היכן אותות הקרינה באתר שנבחר חרגו מזיהויסף, ואילו הקו השחור מזהה אירועים שמקורם באתר מסוים ש( המקביל ל האדום מודגש אירועים).
8. לחץ על אדום מודגש אירוע לעדכן E חלון המציגה את האבולוציה הזמנית של האירוע, וF חלון המציג את הפרופיל המרחבי של האירוע בממוצע לכל מהלך הזמן שלה, יחד עם הפרופיל המרחבי של פונקצית גאוס המצויד.
9. באופן ידני לסקור את האירועים שזוהו כך שניתן לדחות ממצאים מניתוח. מחק אירועים כגון על ידי לחיצה ימנית האדום מודגש אירועים.
   הערה: בידיים שלנו, Ca ^{2 +} שטף דרך ערוצי IP ₃ R יחידים מעורר אותות עם ΔF / F ₀ על 0.11, כך שכל 'אירועים' זוהו קטנים יותר במידה ניכרת מזה צפויים להיות חיובי שגוי.
10. נתוני יצוא על ידי בחירה 'שמור ל- Excel' או לייצא נתונים על בסיס לכל תא על ידי ציור סביב התא של עניין ובחירה 'שמור CellR17 ;.
    הערה: הנתונים נשמרים באותה התיקייה כמו ערימת התמונה המקורית.

תוצאות

איור 1 א מציג תמונת WF של מנוחה הקרינה קאל-520 בתאי נוירובלסטומה SH-SY5Y האנושיים טעונים גם עם ci-IP _3. חשיפה של תאים אלה לבזק 100 UV msec לתמונה-שחרור i-IP ₃ עוררה Ca ^{2 +} פחזניות חולפות באתרים בדידים (שצוין על ידי העיגולים הלבנים באיור 1 א). עקבות הקרינה שנמדדו באתרים אלה הראו שלב עלייה מהיר הודות לפתחים חולפים של IP ₃ Rs, ולאחר מכן שלב הרבה יותר איטי נופל (איור 1 ו1C) כCa ^{2 +}

דיון

אנו מתארים כאן פרוטוקולי הדמיה Ca ^{2 +} אירועים מקומיים בתאי יונקים בתרבית באמצעות Ca ^{2 +} אינדיקטורים ניאון. יתר על כן, אנו מתארים אלגוריתם עם ממשק משתמש אינטואיטיבי המאפשר אוטומצית זיהוי וניתוח של נתונים שנרכשו. ההליך המתואר כאן לנצל את Ca ^{2 +} מחוון ניאון קאל-520, אך רבים Ca ^{2 +} צבעים רגישים אחרים כגון Fluo-3, Fluo-4, Fluo-8 ואורגון גרין BAPTA-1 לבצע מספיק טוב לתמונת Ca ^{2 +} microdomains. טיפול אינו צריך לנקוט כדי להבטיח שגרסות ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
נוירובלסטומה אנושית תאי SH-SY5Y	ATCC	CRL-2266
Cal-520/AM	AAT Bioquest Inc.	21130
ci-IP3 (D-23-O-Isopropylidene-6-O-(2-nitro-4,5-dimethoxy)benzyl-myo-Inositol 1,4,5-trisphosphate-hexakis(propionoxymethyl) Ester	SiChem	cag-iso-2-145-10
DMSO/20% pluronic F127	Invitrogen	P-3000MP
EGTA/AM	Invitrogen	E-1219
צלחות הדמיה עם תחתית זכוכית 35 מ"מ	MatTek	P35G-1.5-14-C