הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הדמיה שני פוטונים של Dynamics הסלולרי בחוט השדרה העכבר

10.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/52580

⸱

22 בפברואר 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Molecular Biology and Biochemistry, University of California, Irvine, 2Physiology and Biophysics, University of California, Irvine, 3Neurobiology and Behavior, University of California, Irvine, 4University of California San Francisco Diabetes Center, University of California, San Francisco, 5Pathology, University of Utah

במאמר זה

סיכום

הכנה חדשה vivo לשעבר הדמיה חוט השדרה העכבר. פרוטוקול זה מאפשר לשני פוטונים הדמיה של אינטראקציות הסלולר בשידור חי בכל רחבי חוט השדרה.

תקציר

מיקרוסקופיה של שני פוטונים (2P) משמשת לחשיפת דינמיקה ואינטראקציות תאיות עמוק בתוך רקמות חיות ושלמות. כאן, אנו מציגים שיטה להדמיית תאים חיים בחוט השדרה של העכבר. טכניקה זו מתאימה באופן ייחודי לניתוח דינמיקה של תאי מבשר עצביים (NPC) לאחר השתלה בחוט השדרה העוברים הפרעות דמיאלינציה נוירו-דלקתיות. NPCs נודדים לאתרים של נזק אקסונלי, מתרבים, מתמיינים לאוליגודנדרוציטים ומשתתפים ברמיאלינציה ישירה. NPCs הם אפוא טיפול טיפולי מבטיח לשיפור מחלות דמיאלינטיות כרוניות. מכיוון ש-NPCs מושתלים נודדים לאזורים הפגועים בצד הגחון של חוט השדרה, הדמיית 2P תוך-חיונית מסורתית היא בלתי אפשרית, ורק מידע על אינטראקציות סטטיות היה זמין בעבר באמצעות גישות צביעה היסטוכימיות. למרות ששיטה זו נוצרה כדי לדמות NPCs מושתלים בחוט השדרה הגחוני, ניתן ליישם אותה במחקרים רבים של תאים מושתלים ואנדוגניים בכל חוט השדרה. במאמר זה, אנו מדגימים את ההכנה וההדמיה של חוט שדרה עם אקסונים מבטאים חלבון פלואורסצנטי צהוב משופר ו-NPCs מושתלים משופרים המבטאים חלבון פלואורסצנטי ירוק.

מבוא

מודלים עכבר של demyelination, כוללים Encephalomyelitis הניסיוני אוטואימוניות (EAE) וזיהום תוך-גולגולתי עם וירוס צהבת עכבר neuroadapted (MHV), הם כלים מצוינים ללמוד מסלולים מולקולריים ואינטראקציות הסלולר הקשורים במחלה. הם הובילו ולתמכו ביעילות של ה- FDA אישרה טיפולי תרופות, בעיקר מיקוד הפסקת אוטואימוניות ודלקת 1. עם זאת, ברגע שחידוש יצירת המיאלין אנדוגני נכשל, הטיפולים שאושרו כרגע לא ביעילות לתקן נגעי demyelinated במערכת העצבים המרכזית. לכן, טיפולים ממוקדי תיקון בשלב זה של מחלה הם קריטיים להקלת סימפטומים כרוניים ושיפור איכות החיים. לאחרונה, תאים עצביים מבשר (NPCs) הגיעו לחזית ככלים טיפוליים משובי פוטנציאל להתמקד באזורים של דלקת ופגיעה במיאלין. מספר מחקרים הדגישו את היכולת של NPCs כדי לגרום endogenoשלנו חידוש יצירת המיאלין ולהשתתף באופן ישיר בחידוש יצירת המיאלין 2-8. בגלל NPCs מעורב בחידוש יצירת המיאלין ישיר, זה הכרחי כדי להבין קינטיקה ויחסי הגומלין שלהם עם תאי אנדוגני לאחר השתלה. לאחר השתלה, NPCs להעביר ventrally לאזורי נזק בחומר לבן, אז rostrally וcaudally ביחס לאתר ההשתלה 5,9. קינטיקה של הגירה שונה בתגובה לרמזים סביבתיים; יש NPCs הושתלו בעמוד השדרה פגוע שאינן מהירויות גדולות יותר מNPCs הושתלו בעמוד השדרה ניזוק 6. לאחר תקופה נודדת, הועבר NPCs להתרבות בהרחבה, בשיעור גבוה יותר בהשוואת חוט השדרה פגועה לחוט השדרה שלם 6. לבסוף, רוב NPCs להתמיין oligodendrocytes וליזום 4,6,9 חידוש יצירת המיאלין ישיר.

נגע demyelinated הוא מורכב ויכול לכלול אוכלוסייה מגוונת של תאים בשלבים שונים שלctivation. לדוגמא, נגע פעיל בטרשת הנפוצה (MS) עשוי לכלול אוכלוסייה משמעותית של תאים מופעלים T, מיקרוגליה M1 ומקרופאגים M1, אבל נגע MS שקט כרוני יכול להיות מורכב בעיקר של האסטרוציטים תגובה עם כמה תאים דלקתיים 10-13. בגלל המגוון של תאי מפעיל, הדמיה שני פוטונים (2P) במודלים של עכברים של demyelination היא כלי מאוד שימושי שיעזור להבין אינטראקציות הסלולר מקומיות בנגע. בטרשת נפוצה ומודלי מחקר MS שימוש נרחב רבים, רוב הנגעים נמצאים בצד הגחון של חוט השדרה, באזור שאינו נגיש להדמית 2P intravital בשל עומק נגע ותוכן שומנים הגבוה של חוט השדרה. כדי לעקוף בעיות אלה ואינטראקציות תא-תא מחקר בנגעים לאורך חוט השדרה הגחון פיתחנו לשעבר הכנת ההדמיה vivo 2P 6 פשוט.

מחקר זה עוקב אחר פרסום שיטות קודם, אשר הראההליך השתלת חלבון משופר ירוק ניאון (eGFP) NPCs -expressing לחוט השדרה של עכברים הבאים מתח JHMV של demyelination המושרה MHV 14. עכברים בן חמישה בשבוע שנגועים בJHMV ומושתל עם eGFP-NPCs ברמת בית החזה 9 ביום 14 לאחר פגיעה. הפרוטוקול המובא כאן מספק את צעדים מפורטים כיצד לחלץ את חוט השדרה, לעשות הכנת vivo לשעבר agarose, ואינטראקציות eGFP-NPC תמונה מושתלת עם חלבון משופר צהוב ניאון (EYFP) האקסונים -expressing. עכברים להביע EYFP תחת אמרגן Thy1 העצבי ספציפית שמשו בהליך זה 15. רק חלק מהאקסונים להביע EYFP, מה שהופך אותו לשימושי הדמיה אקסונים בודדים. כאן אנו מראים מיתרי השדרה הוסרו בשעה 7 ימים לאחר השתלה; עם זאת, ניתן לחלץ מיתרי השדרה בכל נקודת זמן לאחר השתלה. אמנם אנו מציגים אינטראקציות של NPCs עם אקסונים פגועים, הפרוטוקול שלנו יכול לשמש בשילוב עם סמני ניאון גנטייםשל סוגי תאים אחרים כדי לחקור מספר רב של אינטראקציות הסלולר מתרחשות ברחבי חוט השדרה העכבר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הצהרת אתיקה:: הערה הפרוטוקול לטיפול בבעלי חיים אושרה על ידי הוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים והשימוש (IACUC) מאוניברסיטת קליפורניה, אירווין, פרוטוקול # 2010-2943.

1. ההסרה של חוט השדרה

  1. מניחים מגבות נייר רטובה עם ~ 100% isoflurane הנוזלי, USP בהרדמת חסד תא ולמקם את מגבות נייר יבשות על גבי. מניחים את העכבר בתא על גבי מגבות נייר יבשות כל כך העכבר לא נוגע בisoflurane ולוודא קאמרי מכוסה. חכה לפחות דקה אחת לאחר הפסקת הנשימה על מנת להבטיח כי העכבר הוא מורדמים.
  2. לבצע חיתוך רוחב השדרה של הצוואר כדי להבטיח את העכבר הוא מורדמים. אל תבצע נקע בצוואר הרחם כמו זה יכול לגרום נזק לחוט השדרה.
  3. תרסיס העכבר עם אתנול 70% להרטיב את השיער.
  4. השתמש במספרי פיין חדים כדי להסיר את השיער והעור מהחלק האחורי של העכבר כדי לחשוף את עמוד השדרה מכ צוואר רחם lamina 1 (C1) לlamina עצם העצה 4 (S4).
  5. באמצעות אזמל עם # 10 להב, לעשות חתכים בצד השמאל וימין של עמוד השדרה כדי להפריד אותו משריר והשומן. זה יגרום להסרת של חוט השדרה הרבה יותר קלה.
  6. אופציונאלי: rongeurs Luer מעוקל יכול לשמש כדי לגרוף את בשר נוסף.
  7. בעוד מחזיק את החלק העליון של חוליות עמוד השדרה עם מלקחיים גרפו משוננים, הכנס מספריים Vannas טיטניום עקומים, עם הצד המעוגל למעלה לתוך עמוד השדרה נחשף בC1, נזהר שלא לגעת בחוט השדרה.
  8. להחליק מספריים Vannas מעוקלים טיטניום כל הדרך לנכונה ולעשות חתך קטן אחד. קול מחנק קטן צריך להישמע והרגיש כמו המספריים לחתוך את החוליות. חזור על זה לחתוך בצד השמאלי של הכבל. היזהר שלא ללכת מהר מדי או להפוך גדול מדי של קיצוץ כמו זה יהיה לסכן את נזק לכבל עם המספריים.
  9. Lamina אחד אמור להיות מסוגל להיות הרים עם המלקחיים פעם ציד החוליות נחתכים. REPEAT שלב זה עבור כל lamina עד S4, ממשיך להחזיק ולמשוך בחזרה את חוליות עמוד השדרה.
    הערה: החוליות מעל אתר ההשתלה צפויה לבוא מפעם אחת שהוא כרת לאתר ההשתלה. המשך ההליך מתחיל ממש מתחת לאתר ההשתלה.
  10. אופציונאלי: להניח את החוליות למטה כדי לראות היכן אתר ההשתלה הוא ומידה ולחתוך ~ 20 מ"מ מקורי ואת הזנב לאתר ההשתלה.
    הערה: כאשר השתלת NPCs יותר לא יהיה צורך כNPCs המושתל בדרך כלל אינו נודד רחוק יותר מ- 15 מ"מ. הסכום של חוט השדרה הדרוש יהיה תלוי במאפייני ניסוי והגירה של סוג התא המושתל. ביצוע חתכים מקורי ואת הזנב, כי הם במרחק שווה לאתר ההשתלה יאפשר אתר ההשתלה להיות ממוקמים בקלות רבה יותר במהלך הדמיה.
  11. באמצעות אזמל עם להב # 11 לחתוך בזהירות את הגרעינים מימין ומשמאל לצד הגחון של חוט השדרה מתחיל בסוף מקורי. w זהחולה לאפשר את חוט השדרה להסרה מחוליות הגחון בקלות רבה יותר.
    הערה: בוצע במהירות (שלבים 1.7-1.11), חוט השדרה לא תתייבש. עם זאת, 1x PBS יכול להינתן לחוט כדי לשמור אותו לח.
  12. הפוך את העכבר והחזק את העכבר עד כה חוט השדרה פונה כלפי מטה. לקלף בזהירות את חוט השדרה באמצעות מלקחיים גרפו משוננים סגורים. בלי שסחב את חוט השדרה, לחתוך בזהירות כל הגרעינים שנותרו כדי לאפשר את חוט השדרה ליוסר בחתיכה אחת שלמה.
  13. ודא שחוט השדרה הוא בRPMI-1640 ולמקם אותו על קרח להובלה למיקרוסקופ 2P.

2. הכנת חוט השדרה הדמיה

  1. הטבעת חוט השדרה בagarose
    1. שמור את חוט השדרה המבודד בRPMI-1640 מקוררים על קרח לפני ההדמיה.
    2. לשקול את agarose (טמפרטורת gelling נמוכה) ולהכין פתרון 5% ב 5 מיליליטר של 1x PBS. מיקרוגל פתרון agarose 5% למשך 15 שניות כדי לפזר את agהתעורר ולתת הפתרון מגניב עד 37 ° C.
    3. הכן את חוט השדרה על ידי הצבתו על גיליון Parafilm עם הצד הגחוני פונה כלפי מעלה.
    4. Pipet כ 5 מיליליטר של 5% פתרון agarose על צד הגחון של חוט השדרה. בואו agarose לבסס על ידי קירור לטמפרטורת חדר. מיצוק מלא לוקח כ 5 דקות.
    5. החל בשכבה דקה של דבק רקמות ל-22 מ"מ להחליק את מכסה מרובע.
    6. הפוך את חוט השדרה המשובץ, הצבת צד הגחון על Parafilm. צד הגב עכשיו יהיה כלפי מעלה. לדבוק להחליק את המכסה בצד הגב, ולהטביע את הכנת agarose מוטבעת חוט / כיסוי השדרה להחליק בRMPI כדי לחזק את הדבק. להסיר עודפי הקרושה agarose באמצעות סכין גילוח.
  2. התקנת חוט השדרה על הבמה מיקרוסקופ
    1. החל וזלין לתחתית להחליק את המכסה. זה יתייצב ההכנה במהלך זלוף.
    2. מניחים את הכנת חוט השדרה בהדמיה גם על הבמה מיקרוסקופ עם הצד הגחוני פונה כלפי מעלה לכיוון מטרת טבילת 25x. גם ההדמיה שהותקן הוא כ 20 מ"מ עמוק, ארוך 50 מ"מ, 50 מ"מ ורוחב.
    3. תמונה תוך superfusing ההכנה עם התחמם (37 ° C), מחומצן (95: 5 חמצן: דו תחמוצת-פחמן carbogen) בינונית RPMI-1640 ללא סרום.
      1. תקשורת טרום חמה עד 37 מעלות צלזיוס באמבט המים ולחבר אותו למשאבת צינורות על ידי החדרת הצינור לתוך בקבוק התקשורת.
      2. שומר על טמפרטורת התקשורת על 37 מעלות צלזיוס מכשיר חימום בחיבור של הצינור לתא. תקשורת Superfuse דרך גם בשעה 3 מיליליטר / דקה באמצעות צינורות מחוברים למשאבת צינורות (איור 1).

3. 2P הדמיה של חוט השדרה הגחון

  1. התקנת מיקרוסקופ
    1. לרכוש תמונות מחוט שדרת Thy1-EYFP באמצעות Ti Ultra Chameleon: ספיר לייזר מכוון 900 ננומטר. להחליש כוח הלייזר בדגימה ל< 5% כדי להבטיח phototoxicity המינימלי 16. לשמור על טמפרטורה על ידי מרוסס-perfused חמצן RPMI-1640 בC 37 מעלות קבועות באמצעות תנור פתרון מוטבע אחת כדי להבטיח הדמיה יציבה, וכדי למנוע סחף רקמה ונזק לתאים.
    2. כדי להפריד אות ניאון eGFP וEYFP, למקם dichroic 520 ננומטר חד-קצה ומפצל קרן dichroic 560 ננומטר חד-קצה בסדרה להפריד 2P פליטה לשלושה ערוצים, בכוונה פיצול הפליטה הירוקה כדי לשפר את ראות.
      הערה: ערוץ אלה המכונה כחולים-ירוק (פליטה <520 ננומטר), ירוק-צהוב (520-560 ננומטר), ואדום (פליטה> 560 ננומטר). צינורות מכפיל לזהות נפלטו אור בכל ערוץ.
  2. אזורי הדמיה איתור של עניין
    1. שימוש בעינית ומקור אור בשדה בהיר, להתמקד במטרה הטבילה בקצה הגחון של חוט השדרה כדי לקבוע נקודת התייחסות.
    2. הפוך מקור אור הסביבה בטוחה כבוי וSWגירוד ל2P עירור על ידי פתיחת תריס הלייזר.
    3. אם זמין, בעת חיפוש רקמה לתחומי עניין, להשתמש בהגדרת רזולוציה נמוכה יותר, נפח גבוה יותר ללא זום דיגיטלי, וקצב סריקה גבוה יותר מאשר בעת רכישת תמונות סופיות. הגדרות טיפוסיות עם מערכת זו בעת חיפוש רקמה לאזור של עניין הן: רזולוציה: 256 פיקסלים; נפח: x = 600 מיקרומטר, y = 600 מיקרומטר, z = 0-300 מיקרומטר.
    4. שים לב לאקסונים EYFP ליד קצה הגחון של חוט השדרה. אות הרמונית שנייה מקולגן (כחול) תהיה בהיר בקצה רקמת חוט השדרה. אתר את האקסונים EYFP רק הגבו לאות ההרמונית השנייה מקולגן ואות EYFP היא דמיינה בערוץ הירוק-צהוב.
    5. אתר את אתר ההשתלה במרכז האורך של הכנת חוט השדרה 14. לעכברי יום 1 לאחר השתלת eGFP-NPC, לאתר את אתר ההשתלה, תוך התמקדות נתיב הקרן במישור z העמוקה לתוך הרקמה. Wi אתר ההשתלהll להשתנות מעט בין בעלי החיים, אבל בדרך כלל ממוקם ~ 200 מיקרומטר מקצה הגחון. שים לב לאשכולות של eGFP-NPCs בשטחי חומר הלבנים, קרוב יותר לקצות הגחון ורוחב בעכברים לאחר יום 1 לאחר השתלה.
  3. רכישת תמונות סופיות
    1. לרכוש רזולוציית תמונה של 512 פיקסלים; נפח: x = 270 מיקרומטר, y = 212 מיקרומטר, וz = 100 מיקרומטר Slidebook תוכנה באמצעות 6. לקמפל Z- ערימות על ידי רכישת מטוסי מוקד רציפים במרווחים של 2.5 מיקרומטר.
    2. לבצע סריקה דו-כיווני עם שרג הראוי לקזז כדי להבטיח כימות מהיר של כל חפצים נודדים בחוט השדרה. ודא שמסגרת שיעור הרכישה האידיאלית כדי לקבוע מהירות הסלולר בתוך חוט השדרה הוא כ 1 מסגרת / sec.
      ניתן לשנות את הגדרות הדמיה להעדפות של משתמשים שונים, כגון קצב רכישת מסגרת, רזולוציה הדמיה וכרכי הדמיה: הערה. כרכי הדמיה גדולים יהיו בדרך כלל לוקחים זמן רב יותר כדי לרכוש בGIVהרזולוציה en.
    3. לנתח, יבול, קבצי תמונת Slidebook חלק, וpseudocolor עם תוכנת ניתוח תמונה כגון Bitplane Imaris 7.7. להפיק קטעי וידאו הזמן לשגות סופי על ידי סירוק כרכי הדמיה ברציפות באמצעות תהליך אוטומטי בSlidebook וImaris.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

בעוד פרוטוקול ההדמיה חוט השדרה explanted יכול לשמש כדי לחזות כל הקרינה בתוך חוט השדרה, תוצאות הנציג שלנו להפגין אינטראקציות eGFP-NPC עם EYFP-האקסונים. ראשית, אנו מציגים את ההכנה המוטבעת הגחון בחוט השדרה באיור 1 א. בשלב הבא, אנו מציגים את תוכנית ההתקנה של 2P מיקרוסקופ ורכיבי מפתח באיור 1. איור 2 מדגים הקרינה eGFP וEYFP בz-ערימה אחת בתוך חוט השדרה הגחון. רכישת Z- ערימות רצופות ניתן להדר בהפקת סרטי זמן לשגות לנתח דינמיקה סלולרית בזמן אמת בתוך ה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

בזמן אמת 2P הדמיה של רקמות שלמות נדרשת לחקור קינטיקה NPC ואינטראקציות לאחר השתלה לתוך חוט השדרה עכבר demyelinated. ההדמיה Intravital 2P משמשת בדרך כלל כדי לקבוע דינמיקה סלולרית בצד הגבי של חוט השדרה בעכברים חיים, ונעשתה בו שימוש כדי ללמוד demyelination הגב בdemyelinating המחלה 17-19. עם זאת, מכיוון שNPCs המושתל להגר לחומר לבן הגחון, שנמצא עמוק מדי לתמונה באתר באמצעות 2P מיקרוסקופיה, הכנת vivo לשעבר היא הכרחית. מתודולוגיה זו נעשתה שימוש במעבדה שלנו כדי לקבוע את ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין אינטרסים מתחרים.

תודות

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענקי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) R01 GM-41514 (ל-M.D.C.), R39 GM-048071 (ל-IP) ו-R01 NS-074987 (ל-T.E.L.) ופרס המחקר של המרכז השיתופי של האגודה הלאומית לטרשת נפוצה (NMSS) CA1058-A-8 (ל-C.M.W., T.E.L. ו-M.D.C.), NMSS Grant RG4925, מענק הכשרה של NIH T32-AI-060573 (ל-M.L.G.), מלגת פוסט-דוקטורט NMSS FG 1960-A-1 (ל-J.G.W.), ומימון מקרן ג'ורג' א. יואיט למחקר רפואי (M.P.M).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Isoflurane, USPPiramal Critical Care, IncN/A
מספריים עדיניםFine Science Tools14060-09
להב אזמל חד #10Fine Science Tools10010-00
ידית אזמלFine Science Tools10003-12
Luer rongeursFine Science Tools16001-15
Graefe מלקחייםFine Science Tools11052-10
Vannas מספרייםFine Science Tools15615-08
להב אזמל #11Fine Science Tools10011-00
RPMI-1640Gibco12-115F
agarose, טמפרטורת ג'ל נמוכהSigmaA9414-25G
ParafilmFisher Scientific13-374-12
Vetbond (דבק רקמות)3M1469SB
22 מ"מ כיסוי מרובע להחליקפישר סיינטיפיק12-547
25X מטרת טבילה, 1.1 NANikonCFI Apo LWD 25XW
מחמם פתרון מוטבע יחידוורנר אינסטרומנטס64-0102
520 ננומטר מפצל קרן דיכרואי חד קצהSemrockFF520-Di02-25x36Brightline
560 ננומטר מפצל קרן דיכרואי חד קצהSemrockFF560-FDi01-25x36
צינורות מכפיל פוטוBrightline HamamatsuR928
C / L משאבת צינורות במהירות משתנהMasterflex77122-22
מדחום דיגיטליComar Instruments3501
זיקית אולטרה Ti: לייזר ספיר קוהרנטיN/A
Slidebook 6 תוכנה3iN/A
Imaris 7.7 תוכנהBitplaneN/A

מקורות

  1. Robinson, A. P., Harp, C. T., Noronha, A., Miller, S. D. The experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) model of MS: utility for understanding disease pathophysiology and treatment. Handb Clin Neurol. 122, 173-189 (2014).
  2. Pluchino, S., Zanotti, L., Brini, E., Ferrari, S., Martino, G. Regeneration and repair in multiple sclerosis: the role of cell transplantation. Neurosci Lett. 456 (3), 101-106 (2009).
  3. Hatch, M. N., Schaumburg, C. S., Lane, T. E., Keirstead, H. S. Endogenous remyelination is induced by transplant rejection in a viral model of multiple sclerosis. J Neuroimmunol. 212 (1-2), 74-81 (2009).
  4. Totoiu, M. O., Nistor, G. I., Lane, T. E., Keirstead, H. S. Remyelination, axonal sparing, and locomotor recovery following transplantation of glial-committed progenitor cells into the MHV model of multiple sclerosis. Exp Neurol. 187 (2), 254-265 (2004).
  5. Tirotta, E., Carbajal, K. S., Schaumburg, C. S., Whitman, L., Lane, T. E. Cell replacement therapies to promote remyelination in a viral model of demyelination. J Neuroimmunol. 224 (1-2), 101-107 (2010).
  6. Greenberg, M. L., et al. Two-photon imaging of remyelination of spinal cord axons by engrafted neural precursor cells in a viral model of multiple sclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (22), E2349-E2355 (2014).
  7. Whitman, L. M., Blanc, C. A., Schaumburg, C. S., Rowitch, D. H., Lane, T. E. Olig1 function is required for remyelination potential of transplanted neural progenitor cells in a model of viral-induced demyelination. Exp Neurol. 235 (1), 380-387 (2012).
  8. Pluchino, S., et al. Injection of adult neurospheres induces recovery in a chronic model of multiple sclerosis. Nature. 422 (6933), 688-694 (2003).
  9. Weinger, J. G., et al. MHC mismatch results in neural progenitor cell rejection following spinal cord transplantation in a model of viral-induced demyelination. Stem Cells. 30 (11), 2584-2595 (2012).
  10. Vogel, D. Y., et al. Macrophages in inflammatory multiple sclerosis lesions have an intermediate activation status. J Neuroinflammation. 10, 35(2013).
  11. Coyle, P. K. Ch. 3. Clinical Neuroimmunology: Multiple Sclerosis and Related Disorders. Rizvi, S. A., Coyle, P. K. 3, Springer. 43-70 (2011).
  12. McManus, C., et al. MCP-1, MCP-2 and MCP-3 expression in multiple sclerosis lesions: an immunohistochemical and in situ hybridization study. J Neuroimmunol. 86 (1), 20-29 (1998).
  13. Calderon, T. M., et al. A role for CXCL12 (SDF-1alpha) in the pathogenesis of multiple sclerosis: regulation of CXCL12 expression in astrocytes by soluble myelin basic protein. J Neuroimmunol. 177 (1-2), 27-39 (2006).
  14. Carbajal, K. S., Weinger, J. G., Whitman, L. M., Schaumburg, C. S., Lane, T. E. Surgical transplantation of mouse neural stem cells into the spinal cords of mice infected with neurotropic mouse hepatitis virus. J Vis Exp. 53, e2834(2011).
  15. Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
  16. Nguyen, Q. T., Callamaras, N., Hsieh, C., Parker, I. Construction of a two-photon microscope for video-rate Ca(2+) imaging. Cell Calcium. 30 (6), 383-393 (2001).
  17. Nikic, I., et al. A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Nat Med. 17 (4), 495-499 (2011).
  18. Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G., Debarbieux, F. Implanting glass spinal cord windows in adult mice with experimental autoimmune encephalomyelitis. J Vis Exp. 82, e50826(2013).
  19. Farrar, M. J., et al. Chronic in vivo imaging in the mouse spinal cord using an implanted chamber. Nat Methods. 9 (3), 297-302 (2012).
  20. Pakan, J. M., McDermott, K. W. A method to investigate radial glia cell behavior using two-photon time-lapse microscopy in an ex vivo model of spinal cord development. Front Neuroanat. 8, 22(2014).
  21. Fenrich, K. K., et al. Long-term in vivo imaging of normal and pathological mouse spinal cord with subcellular resolution using implanted glass windows. J Physiol. 590 (Pt 16), 3665-3675 (2012).
  22. Germain, R. N., Robey, E. A., Cahalan, M. D. A decade of imaging cellular motility and interaction dynamics in the immune system. Science. 336, 1676-1681 (2012).
  23. Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296 (6089), 1869-1873 (2002).
  24. Dzhagalov, I. L., Melichar, H. J., Ross, J. O., Herzmark, P., Robey, E. A. Two-photon imaging of the immune system. Curr Protoc Cytom. Chapter 12 (Unit12 26), (2012).
  25. Matheu, M. P., et al. Toll-like receptor 4-activated B cells out-compete Toll-like receptor 9-activated B cells to establish peripheral immunological tolerance. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (20), E1258-E1266 (2012).
  26. Matheu, M. P., et al. Three phases of CD8 T cell response in the lung following H1N1 influenza infection and sphingosine 1 phosphate agonist therapy. PLoS One. 8 (3), e58033(2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

הדמיה שני פוטונים של Dynamics הסלולרי בחוט השדרה העכבר
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.