הכנת תא בודד השעיות עבור ניתוח Cytofluorimetric מאזורים העור עכבר שונים

סיכום

העור הוא ביתה של רשת תאי חיסון מורכבת. אנו מתארים מתודולוגיה יעילה לעיכול עור עכבר, מחלקים שונים בגוף החיה, על מנת לקבל תרחיף חד-תאי ולנתח את אוכלוסיות הלויקוציטים השונות השוכנות בעור על ידי זרימה ציטומטרית.

תקציר

העור הוא איבר מחסום המקיים אינטראקציה עם הסביבה החיצונית. בהיותם חשופים באופן רציף לפלישה מיקרוביאלית פוטנציאלית, הדרמיס והאפידרמיס מאכלסים מגוון תאים חיסוניים בתנאים הומאוסטטיים ודלקתיים כאחד. כלים להשגת שחרור תאי עור לאנליזות ציטופלואורימטריות הם אפוא שימושיים מאוד על מנת לחקור את הרשת המורכבת של תאי חיסון השוכנים בעור ואת תגובתם לגירויים מיקרוביאליים. כאן, אנו מתארים מתודולוגיה יעילה לעיכול עור עכבר להשגת תרחיפים חד-תאיים במהירות וביעילות. פרוטוקול זה מאפשר שמירה על כדאיות תא מקסימלית מבלי לפגוע בביטוי האנטיגן על פני השטח. אנו גם מתארים כיצד לקחת ולעכל דגימות עור ממיקומים אנטומיים שונים, כמו למשל האוזן, תא המטען, הזנב וכרית כף הרגל. לאחר מכן, התרחיפים המתקבלים נצבעים ומנותחים על ידי ציטומטריית זרימה כדי להבחין בין אוכלוסיות לויקוציטים שונות.

מבוא

העור הוא אחד האיברים הגדולים ביותר בגוף ופני השטח הגדולים שלו חשופים באופן רציף לסביבה החיצונית. לכן העור צריך להגן על האורגניזם מפני איומים פוטנציאליים על מנת לשמור על הומאוסטזיס, הן באמצעים פיזיים והן על ידי מתן הגנה אקטיבית מפני כניסת פתוגן פוטנציאלי. בדומה לרירית המעי והריאות, העור מכיל מגוון תאי חיסון שמקיימים אינטראקציה רציפה עם האפיתל כדי לשמור על מעקב חיסוני. מערכת מורכבת זו המערבת תאים חיסוניים ולא חיסוניים של העור הוכרה עוד מימיה הראשונים של האימונולוגיה, כאשר בשנת 1978 נטבע לראשונה המונח "רקמת לימפה הקשורה לעור" (SALT) ¹ כדי לתאר מורכבות כזו.

המספר הגדול של תאי מערכת החיסון השוכנים בעור מסייע לאורגניזם לא רק להילחם בפלישות פוטנציאליות, אלא גם לתאם ריפוי פצעים ולשמור על סובלנות כלפי אנטיגנים עצמיים ומיקרוביוטת העור ^2,3.

בקרב תאי מערכת החיסון השוכנים בעור, לתאים דנדריטיים (DCs) יש תפקיד מכריע בעיצוב תגובות חיסוניות ובשמירה על הומאוסטזיס ⁴. תאי DCs עוריים ותאי לנגרהנס מגיבים בקלות לפלישות פתוגנים, ועם ההגירה לבלוטות הלימפה מפעילים תאי T וגורמים לביטוי של קולטני ביות עור על תאי T האפקטורים החדשים ^{שנוצרו 5}. ל-DCs יש גם תפקיד מהותי בוויסות הומאוסטזיס של העור. DCs הנודדים מהדרמיס לבלוטות הלימפה בתנאים הומאוסטטיים מעבירים אנטיגנים מבודדים בעור במטרה לגרום לסבילות לתאי T בעיקר באמצעות התמיינות של תאי T רגולטוריים (Tregs) ספציפיים לאנטיגנים של העור ^6-8.

תאי

T מייצגים את האוכלוסייה הנפוצה ביותר של תאי מערכת החיסון בעור. לא רק שהם חודרים לעור במהלך זיהום, אלא שהם גם מייצגים אוכלוסייה יציבה בקרב לימפוציטים השוכנים בעור ^9,10. גם תאי זיכרון תושב CD8⁺ וגם CD4⁺ שוכנים בעור, ובעקבות זיהום, יכולים להגיב הרבה לפני שתאי T אפקטורים מגויסים מהדם. בעור שוכנת גם אוכלוסייה של Tregs שוכני רקמות המסוגלים לשמור על סובלנות כלפי אנטיגנים של העור והומאוסטזיס של רקמות. תאים אלה מופעלים במהירות ובעוצמה לאחר חשיפה לאנטיגן הקוגנטי שלהם ולכן הוגדרו כ-Memory Tregs ^11,12.

יחד עם תאי DCs ותאי T, תאים חיסוניים מולדים רבים, כגון תאי NK, תאי T גמא דלתא, ILCs ¹³ מקבוצה 2, תאי פיטום ומקרופאגים, מאכלסים את העור ותורמים להגנה על המארח. כדי לנתח סביבה מורכבת כזו, חובה להשיג תרחיפים חד-תאיים מדגימות עור ביעילות גבוהה ובמקביל לשמור על ביטוי סמני פני השטח לניתוח או מיון ציטופלואורימטרי זרימה.

עור העכברים מציג שכבת אפידרמיס חיצונית, המורכבת בעיקר מקרטינוציטים, תאי לנגרהנס ותאי T אפידרמיסיים דנדריטיים; ושכבת העור שמתחתיה. הדרמיס מאכלס את רוב תאי מערכת החיסון ומיוצר על-ידי מטריצה חוץ-תאית שבה סיבי הקולגן הם הנפוצים ביותר, במיוחד קולגן-I וקולגן-IV. בניגוד לעור אנושי, עור העכבר מכוסה בפרווה, ולכן מאוכלס יותר בזקיקי שיער. הוא גם דק בהרבה מעור האדם ומכיל שכבה שרירית, panniculus carnosus, המסייעת בריפוי פצעים ¹⁴. המאפיינים הללו מקשים על שיבוש יעיל של רשת הקולגן בדרמיס כדי להוציא את תאי מערכת החיסון החוצה.

במאמר זה אנו מספקים שיטה מתאימה לעיכול המטריצה החוץ-תאית המסתמכת על קוקטייל של קולגנאז 1 ו-2 בטוהר גבוה ותרמוליזין. יתר על כן, מכיוון שניתוח עור מאזורים שונים דורש הליכי ניסוי שונים, נציג שיטות שונות להשגת דגימות עור ביעילות מכרית כף הרגל, הזנב, האוזן והגזע. לאחר מכן נסמן את הדגימות על מנת להעריך את נוכחותם של תאי DC (MHCII⁺CD11c⁺CD45⁺), מקרופאגים (CD11b⁺F4/80⁺CD45⁺), CD8⁺ ותאי CD4⁺ T.

פרוטוקול

אישור לימוד: פרוטוקולי הניסוי אושרו על ידי משרד הבריאות האיטלקי (רומא, איטליה) על פי Decreto legislativo 27 gennaio 1992, n. 116 "Attuazione דלה Direttiva n. 86/609 / CEE ב מאטריה di protezione degli animali utilizzati פיני sperimentali o המודעה אלטרי פיני scientifici."

1. קבלת דגימות עור

1. להרדים את העכבר על ידי נקע בצוואר הרחם.
2. אֹזֶן:
   1. חותכים את החלק ללא שיער של האוזניים של העכבר.
   2. הגב נפרד בצד הגחון על ידי משיכת אותם לגזרים עם מלקחיים. הסר את כל סחוסים הנותרים על ידי גירוד החלק הפנימי בעדינות של אוזניים עם מלקחיים.
3. עור Trunk:
   1. לגלח את העור כולו של החיה שניהם עם סכין גילוח חשמלי ועם קרם מקריח עדין.
   2. חותך את מדגם העור הרצוי (מ -2 סנטימטרים ² עד עורות בעלי החיים השלמים).
      1. אם ניתוק הגב כולו venעור עכבר tral, לעשות חתך אנכי באמצע העכבר בחזרה ואז לחתוך לאורך גבולות האזורים המגולחים סביב גוף העכבר.
      2. בעדינות להפריד את העור מפני הצפק ושרירי גב, לשמירת דגימת העור עדיין עם המלקחיים תוך הפרדה בין מדגם העור בקצות הטו הסגורות של מספרי כירורגיות או אזמל.
   3. הכינו צלחת תרבית תאים 100 מ"מ המכיל 10 מ"ל של PBS קר כקרח.
   4. לחסל שומן תת עורי על ידי השריית מדגם העור ב- PBS בצלחת מוכן בשלב 1.3.3 וקרצוף מדגם העור עם מלקחיים.
4. זָנָב:
   1. חותכים את הזנב של העכבר.
   2. ביצוע חתך אנכי על הזנב עם מספריים כירורגיות או אזמל כירורגי, החל מבסיס הזנב ולהגיע אל קצה הזנב.
   3. שימוש במלקחיים כדי לנתק את העור מהזנב. תפוס את הקצה לחתוך בבסיס הזנב בעדינות למשוך לכיוון הקצה תוך כדי לחיצה עלגוף של הזנב עם מלקחיים.
   4. הסר את כל עודפי שומן על ידי גירוד מדגם העור בעדינות.
5. שׁוֹדֵד דְרָכִים
   1. חותכים את הרגל העכבר כולו עם מספריים כירורגיות. הימנעות חיתוך כל עור שעיר.
   2. חותכים את העור של כף הרגל longitudinally מן הקרסול לתחילת הספרות.
   3. החזק את עצמות קרסול עם מלקחיים או ביד בעת גרירת העור עם מלקחיים למשוך את העור כלפי הספרות כאילו הוא ממריא כפפה.

עיכול 2.

1. הכן את קוקטייל עיכול מפתרון המניות (שהוכן כמו רשימת חומרים) עם המתכון הבא: תערובת אנזימים (ראה רשימת חומרים עבור מפרטים) 300 מ"ל / מיקרוגרם, DNAse1 50 U / ml. לדלל ב FBS 5% RPMI.
2. קוצצים דגימות עור עם מספריים לחתיכות קטנות לתוך צלחת פטרי 35 מ"מ עם 2 מ"ל של קוקטייל עיכול (לעור המטען: 2 מ"ל של קוקטייל עיכול כל 2 ס"מ ² של העור, עד 3 מ"ל סה"כ).
3. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 90 דקות. נער בעדינות את צלחת פטרי 1-2 פעמים במהלך הדגירה.
4. יוצקים דגימות עור מתעכל על מסננת 70 מיקרומטר תא 66 צלחת מ"מ פטרי המכילה 1 מ"ל של RPMI1640 FBS 5%.
5. שטפו את המסננת עם 5 מ"ל של RPMI 1640 5% FBS.
6. סוחט את המדגם דרך מסננת התא עם בוכנה במזרק.
7. הבוכנה סומק, צלחת פטרי מסננת עם 20 מ"ל של RPMI1640 FBS 5%, להעביר לתוך שפופרת 50 מ"ל.

3. נוגדנים תיוג

1. שטפו את ההשעיה השיג פעמיים עם 5 מ"ל של 1% PBS FBS (או BSA).
2. לייבל השעית התא שהושגה עם הנוגדנים הרצויים.
   1. Resuspend דגימות 100 μl / מדגם של תערובת המכילה מ"ל 2 מיקרוגרם / של aCD16 / CD32 (שיבוט 2.4G2) מדולל FBS 1% PBS.
   2. דגירה במשך 15 דקות ב 4 ° C על מנת לחסום את הלא ספציפי המחייב של הנוגדנים הרצויים באמצעות קולטני Fc.
   3. מוסיף את הנוגדנים מצוינים בטבלה1.
      1. להכין תערובת דילול נוגדנים הרצוי 100 μl / מדגם של FBS 1% PBS בריכוז של 4 מיקרוגרם / מ"ל.
      2. הוספת 100 μl של תמהיל מוכן בשלב 3.2.3.1 לטעום כל כך בצינור, יהיו בהיקף של 200 μl של תערובת נוגדנים בריכוז סופי של 2 מיקרוגרם / מ"ל.
   4. דגירה במשך 30 דקות ב 4 ° C ו לכסות מפני אור.
3. לשטוף עם 1 מ"ל של FBS 1% PBS, צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 400 XG, וזורקים supernatant ו resuspend ב 300 μl של FBS 1% PBS.
4. הוסף DAPI בריכוז סופי של 2 מיקרוגרם / מ"ל ​​ו דגירה על 4 מעלות צלזיוס, מוגן מפני אור במשך 10 דקות.
5. ניתוח הדגימות מתקבלות על ידי FACS.
   1. על מנת לבודד לויקוציטים, להשתמש באסטרטגיה gating הבאה:
      1. ראשית לחסל את כל תאים מתים על ידי gating על אוכלוסיית DAPI-.
      2. Singlets בחר בעלילה FSC-A לעומת FSC W כמצוין באיור 1 .
      3. שער התאים המבוססים על גודל גרעיניות טיפוסי של לויקוציטים עניין.
      4. בחר CD45 + תאים בעלילה FSC-A CD45 כמצוין באיור 1.
   2. להבחין בין אוכלוסיות שונות של לויקוציטים ידי הביטוי של סמנים משטח כדלקמן:
      1. זהה DCs כמו CD11c ⁺ MHC II ⁺ תאים. אלו ניתן לנתח לאחר מכן על מנת לתת ביטוי CD207 להבחין בין תאי לנגרהנס ואת CD207 + Dermal DCs מ CD207- Dermal DCs.
      2. זהה המקרופאגים כמו CD64 + F4 / 80 + תאים.
      3. לזהות תאי B כמו CD19 + MHCII + תאים.
      4. לזהות תאי T כמו CD8 + או CD4 + תאים.

תוצאות

עור מאזור אחר של הגוף היה מתעכל פי הפרוטוקול המתואר ומוכתם נוגדנים המצוינים. אסטרטגית gating מתוארת באיור 1. ראשית בחרו תאי חיים (תאי DAPI-), אז שער על singlets (FSC-A לעומת-W FSC) ועל תאים עם מורפולוגיה הלימפוציטים (FSC-A לעומת SSC-A). כאשר הדבר מתבקש, CD45 ⁺ תאים ממקור hematopoietic נבחרים.

DCs מסומנים עם אנטי CD11c, -...

דיון

תארנו שיטה להכנת תא בודדת השעיות מאזורי עור עכבר שונים. השיטה של ​​עיכול אמצנו, לא רק נותנת תשואות גבוהות אלא גם משמרת את הביטוי של סמני משטח, שהוא יסוד לניתוח FACS הבא.

שימוש קוקטייל של collagenase I ו- II ו thermolysin, מבטיח יצווה מינימום להבדלים יצוו בפעילות אנזים עושים שיטה זו מאוד לשחזור. שיטות שפורסמו אחרות מסתמכות על קוקטיילי אנזים שונים אך בידינו הם נותנים תשואות נמוכות, וחשוב יותר, הם פחות לשחזור. השיטה...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
<חזק>ריאגנטים
בתוספת RPMI 1640 בינוני			RPMI1640 תוסף תזונה עם L-glu, עט-סטרפטוקוקוס ללא בטא מרקפטו אתנול
PBS
FBS
Liberase TM (תערובת אנזימים)	Roche	5401119001	השהיה [2.5  מ"ג/מ"ל] ב-dH2O; אחסן את הפריטים ב -20  ° C
Dnase I	Sigma	D4263-1VL	מושהה בסרום RPMI 1640 w/o [1,000  U/ml]
<חזק>חומרים
מספריים
מלקחיים
אזמל
35 מ"מ צלחות
66 מ"מ צלחות
100 מ"מ צלחות
70 ומיקרו; m מסנני תאים	BD	352350
<קוקטייל עיכול חזק>			לדלל ב-RPMI 5%
FBS LIberase TM			300 ומיקרו; גרם/מ"ל
DNAse1			50 U/ml
<חזק>נוגדנים
<חזק>שם	<חזק>חברה	<חזק>שיבוט	<חזק>תווית
aCD45.2		104	PE-Cy5.5
aCD11c		N418	PE-Cy7
CD11b		M1/70	FITC
F4/80		A 3-1	APC-Cy7
aCD4		Gk1.5	APC-Cy7
aCD8		53-6.7	PE
aCD64		X54-5/7.1	PE-Cy7
aCD207		4C7	APC