מאמר שיטה

הערכה תפקודית ומורפולוגי של סרעפת עצבוב על ידי סרעפת מנוע נוירונים

DOI:

10.3791/52605

⸱

25 במאי 2015

 ,  ,  , 
1Department of Neuroscience, Farber Institute for Neurosciences, Sidney Kimmel Medical College at Thomas Jefferson University, 2Department of Biology, Arcadia University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רישום פוטנציאל פעולת שרירים מורכב מעריך כמותית את עצבוב הסרעפת התפקודי על ידי נוירונים מוטוריים פרניים. אימונוהיסטוכימיה של דיאפרגמה שלמה מעריכה עצבוב מורפולוגי בצמתים עצביים-שריריים בודדים. מטרת פרוטוקול זה היא להדגים כיצד ניתן להשתמש בשתי המתודולוגיות החזקות הללו במודלים שונים של מכרסמים של מחלות חוט השדרה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתמקד במיוחד בכלים להערכת עצבוב נוירון מוטורי פרני (PhMN) של הסרעפת הן ברמה האלקטרופיזיולוגית והן ברמה המורפולוגית. ניתן להשתמש ברישום פוטנציאל פעולת שרירים מורכב (CMAP) לאחר גירוי עצבי פרני כדי להעריך כמותית את עצבוב הסרעפת התפקודי על ידי PhMNs של חוט השדרה הצווארי in vivo בחולדות ועכברים מורדמים. מכיוון ש-CMAPs מייצגים רישום בו-זמני של כל סיבי השריר של כל חצי הסרעפת, כדאי לבחון גם את הפנוטיפים של אקסונים מוטוריים בודדים וסיבי שריר בסרעפת NMJ על מנת לעקוב אחר שינויים מורפולוגיים רלוונטיים למחלה ולטיפול כגון ניתוק עצבים חלקי ומלא, הנבטה רגנרטיבית ועצבוב מחדש. ניתן להשיג זאת באמצעות אימונוהיסטוכימיה שלמה (IHC) של הסרעפת, ואחריה הערכה מורפולוגית מפורטת של NMJs בודדים בכל השריר. שילוב CMAPs וניתוח NMJ מספק גישה רבת עוצמה למחקר כמותי של עצבוב סרעפתי במודלים של מכרסמים של מחלת CNS ו-PNS.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טרשת לרוחב amyotrophic (ALS) היא מחלה הנוירון המוטורי מתישה הקשורים לאובדן של שני נוירונים מוטוריים העליונים ותחתונים ושיתוק שריר הסוגר. לאחר האבחון, הישרדות חולה היא בממוצע רק 2-5 שנים 1. אובדן הנוירון מוטורי (PhMN) הסרעפת הוא מרכיב קריטי של פתוגנזה של ALS. חולי סופו של דבר למות כתוצאה מאובדן עצבוב PhMN של הסרעפת, השריר העיקרי של ההשראה 2,3. פגיעה בחוט השדרה טראומטית (SCI) היא גם בעיה רצינית עם קשיי הנשימה קשורים. כ -12,000 מקרים חדשים של SCI להתרחש בכל שנה 4 בשל נזק טראומטי לחוט השדרה. למרות ההטרוגניות מחלה ביחס למיקום, סוג וחומרה, רובם של המקרים SCI כרוכים טראומה לחוט השדרה הצווארי, אשר לעתים קרובות תוצאות פשרה נשימה מתישה ומתמשכת. בנוסף לALS וSCI, מערכת עצבים מרכזית אחרת יכולות להיות קשורות למחלות (CNS) wתפקוד לקוי של ה- i סרעפתי נשימה 5,6.

עצב הסרעפת הוא עצב מוטורי efferent שמעצבב חמי-סרעפת ipsilateral ושמקורו מגופי תא PhMN ממוקמים ברמות C3-C5 של חוט השדרה הצווארי ipsilateral. פלט PhMN נשלט על ידי יורד קלט bulbospinal מגזע המוח באזור המכונה הקבוצה מקורי הגחון הנשימה (rVRG) 7. מעגל rVRG-PhMN-הסרעפת הוא מרכזי לשליטה של ​​נשימת שאיפה, כמו גם התנהגויות סרעפת אינן נשימתית אחרות. פציעות שונות טראומטיות והפרעות ניווניות המשפיעות על מעגלים זה יכולים להוביל לירידה עמוקה בתפקוד נשימה ואיכות חיי מטופל. יורד קלט לPhMNs מהישרדות rVRG, PhMN, יושרת עצב הסרעפת והעצבוב נכון בצומת העצבית-שרירית סרעפת (NMJ) הם כל נחוצים לתפקוד סרעפת נורמלי. לכן חשוב להעסיק טכניקות שכמותית יכול להעריך מעגל זה in vivo במודלים של מכרסמים של ALS, SCI ומחלות של מערכת העצבים המרכזית אחרות.

עם פרוטוקול זה, המטרה היא לתאר בכלים ניסיוניים להערכת עצבוב PhMN של הסרעפת בשני אלקטרו והרמות מורפולוגיים. פוטנציאל פעולת שרירים מתחם (CMAPs) נרשם על ידי גירוי כל האקסונים הנוירון מוטורי efferent של עצב מוטורי נתון ולאחר מכן לנתח את תגובת שלילת קוטביות שהושרו של myofibers היעד. טכניקה זו יכולה לשמש in vivo בחולדות ועכברים מורדמים לכמת עצבוב תפקודי של חמי-הסרעפת על ידי PhMNs 8. בשל העובדה שCMAPs מייצג הקלטה בו זמנית של כל (רב לפחות או / ביותר) myofibers של כל חמי-סרעפת, זה שימושי גם לבחון את פנוטיפים של אקסונים פרט מנוע וmyofibers בNMJ הסרעפת כדי לעקוב אחר מחלה - ושינויים מורפולוגיים טיפול רלוונטי כגון חלקי ומכלוליםdenervation te, צמיחה והתחדשות reinnervation. זה יכול להיות מושלם באמצעות אימונוהיסטוכימיה כל הר (IHC) של הסרעפת, ואחרי הערכת מורפולוגיות מפורטת של NMJs הבודד לאורך השריר 9. שילוב CMAPs וניתוח NMJ מספק גישה רבת עוצמה לכמותית לומד עצבוב סרעפת במודלים של מכרסמים של המחלה של מערכת העצבים המרכזית וPNS.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נהלי ניסוי אושרו על ידי הוועדה לטיפול אוניברסיטת תומס ג'פרסון מוסדי בעלי חיים ושימוש ונערכו בעמידה בקהילות האירופיות הנחיית המועצה (2010/63 / האיחוד האירופי, 86/609 / EEC ו87-848 / EEC), מדריך NIH ל טיפול ושימוש בחיות מעבדה, והחברה למדיניות של מדעי המוח בשימוש בבעלי חיים במחקר במדעי המוח.

1. פוטנציאלים שריר מתחם פעולה (CMAPs)

  1. הכנת בעלי החיים:
    1. להרדים את העכברוש באמצעות נשימתית (isoflurane) בשעה 1-2% מועברים לתוקף או על ידי הזרקה (קטמין, xylazine, acepromazine). מינון של הרדמה בהזרקה הוא כדלקמן: 95.0 מ"ג / קילוגרם של קטמין, 10.0 מ"ג / קילוגרם של xylazine, 0.075 מ"ג / קילוגרם של acepromazine.
      הערה: אנו בהצלחה להשתמש בשני נשימתית והרדמה בהזרקה מתקרבת בעת ביצוע הקלטת פרוטוקול זה מבנה מפת צבעים, ללא העדפה.
    2. בעלי החיים חייבים להישמר בהולםעומק nesthetic לפני הניתוח הוא התחיל, דרך המסקנה של ניתוח, ועד עצירות לאחר ניתוח לקח השפעה. לאשר הרדמה תקינה על ידי צביטת הבוהן קצרה כדי לקבוע שתגובת נסיגה לא הושרה. בנוסף, לבדוק את רפלקס המצמוץ עם מקלון צמר גפן. לאורך כל ההליך כירורגי, לקבוע כי קצב לב וקצב נשימה לא גדלו, אשר טוענים כי עומק הרדמה הפך קל מדי.
    3. החל משחה וטרינר בעיניו של בעל החיים כדי למנוע יובש ואילו בהרדמה.
    4. המנתח צריך לשטוף אותה / את ידיו בחומר חיטוי (לשפשף chlorhexidine) לפני תחילת ניתוח. המנתח צריך ללבוש כפפות סטריליות, facemask, ושמלה או מעיל מעבדה נקי. יש לשטוף את כל הכלים וautoclaved לפני הניתוח. הוסף רצועת מחוון עיקור בתוך ערכת המכשיר לפני המעוקר ברמה של המכשירים כדי לוודא שהעיקור הוא מלא. המנתח צריךלוודא שכל הקו ברצועה הוא שחור לפני תחילת ניתוח. הדבק את מחוץ לקופסה עם הגדרת קלטת החיטוי גם כן. אם ניתוח הוא שיש לבצע בכמה בעלי חיים באותו היום, לנקות את המכשירים בין ניתוחים ולעקר במעקר חרוז זכוכית. במידת צורך, לעקר את שני הקצוות של המכשיר במעקר חרוז זכוכית על ידי הצבת את הידית של המכשיר במעקר לזמן המתאים, הסרת המכשיר עם hemostat סטרילי, קירורו בשדה סטרילי ולאחר מכן הצבת הסוף הפונקציונלי של המכשיר למעקר חרוז זכוכית לתקופה המתאימה של זמן.
    5. ברגע שבעלי החיים הוא בהרדמה, מקום על לוח כירורגית עם משטח גב למטה והבטן פונה כלפי מעלה, כך שהסרט יכול לשמש כדי לאבטח את forelimbs של החיה ללוח כירורגית.
    6. לגלח caudally משטח הגחון מתחיל בבסיס הגולגולת, ולהבטיח שסביב בטן האזור משני צדי קו האמצע הוא shaved בהתאם לחמים-סרעפת מוקלטת. החל povidone- יוד אל פני השטח המגולחים של העור.
  2. הכנה להקלטות מבנה מפת צבעים:
    1. בעקבות הכנת בעלי חיים, תת עורי אלקטרודה קרקע מקום לזנב (איור 1).
    2. מניחים את האלקטרודה תת עורי התייחסות לאזור הבטן התחתון הנגדי.
    3. מניחים ג'ל מוליך על רצועת משטח דביקה או האלקטרודה הקלטת דיסק (ממדים של האלקטרודה משטח רצועה: 0.5 x 3 סנטימטרים), ולאחר מכן למקם אלקטרודה משטח רוחבי לאורך השוליים costal חד-צדדיים.
    4. מניחים אלקטרודות גירוי transcutaneously 0.5 סנטימטר זה מזה לרוחב לקנה נשימה ומעולות לעצם הבריח. הכנס את האלקטרודות כ 1.0 סנטימטר עמוקה דרך העור. אבטח את האלקטרודות ביד, כך שמיקומם לא זז עם גירויים שלאחר מכן.
      הערה: אלקטרודות גירוי זווית לעור 90 ° יחסי באתר של insertion.
  3. הקלטות פעולה שריר מתחם פוטנציאליות (מבנה מפת צבעים):
    1. להשיג קלטות אלקטרו באמצעות ממריץ / מגבר ואחרי ניתוח נתונים בעזרת מחשב.
    2. הפרמטרים הגירוי של גירוי משיכה אחת צריכים להיות 0.5 msec, קטניות supramaximal 1.0 הרץ. המשרעת של הגירוי צריכה להיות בין 6.0 ו 8.0 V (איור 2 א).
      הערה: בתוך ניסוי, להשתמש עוצמת גירוי באותה משרעת על פני בעלי חיים. המטרה היא למקסם את המשרעת התגובה על ידי שימוש במשרעת המינימלית של גירוי. חשוב לציין כי התגובה הראשונית המתרחשת בעת הגירוי היא חפץ גירוי. בנוסף, יש להקפיד לקבל תגובת מבנה מפת צבעים שקדמה בסיס יציב / שטוח אחרי חפץ הגירוי, אשר לאחר מכן ואחריו התגובה המהירה מבנה מפת הצבעים. על מנת לקבל תגובה כזו, זה עשוי להיות נחוץ כדי לשנות את מיקום הגירוי ו / אואלקטרודות הקלטה.
    3. המתן 30 שניות בין גירויים, ולחזור 10 גירויים ברציפות כדי להשיג את התגובה הממוצעת (איור 2 ב - C). מדוד את משרעת מנקודת ההתחלה לשיא (איור 2 א). לנהל גירוי עצב הסרעפת במהלך השלב של מחזור הנשימה של בעלי החיים כאשר העצב / סרעפת הסרעפת אינה מופעלת. ההליך ניתן לחזור על אותה החיה לחמים-הסרעפת הנגדית.
    4. לאחר הקלטת מבנה מפת צבעים הסופית, ינקב את החיה אם הכתמת NMJ תתנהל. לנהל הקלטות מבנה מפת צבעים שוב ושוב על אותו בעלי החיים כ פעם בשבוע (או במרווח של בחירה).
    5. בעקבות הקלטות מבנה מפת צבעים של הישרדות, מאפשר לבעלי החיים להתאושש על כרית חימום מים חם במחזור, ולפקח באופן רציף במהלך התאוששות עד שכיבה ערה וsternally. אל תחזרו לבעלי חיים שעברו ניתוח לחברה של בעלי חיים אחרים, עד שהתאושש באופן מלא.
    6. ברגע שsternally שכיבה, לפקח על בעלי החיים כל 12 שעות לשעה 48 הראשונה (פעם ביום לאחר מכן). אם בעלי החיים שנראה מיובשת (עור רפוי, אדישות), לנהל נוזלים (פתרון אצבעות Lactated; תת עורי; 1-2 מיליליטר להזרקה, עם האתרים מסובבים; 2 פעמים ביום) עד משקל לאחר ניתוח ואובדן נוזלים מייצבים. לספק חיות עם מזון מרוכך במנות קטנות בתקופה שלאחר הניתוח החריפה במידת צורך לעודד אכילה אם הם לא יכולים להגיע למזין מכסה בר תיל.
    7. לנהל עצירות במינון של 0.05 מ"ג / קילוגרם לפני תום הניתוח ולאחר מכן במרווחים של 12 שעות לשעה 24 הראשונה (ותלוי בסימנים של כאב / מתח לאחר מכן) באמצעות הזרקה תת עורית (אתר מסובב). אם סימנים של כאב או מצוקה הם הבחינו לאחר מכן, טיפול בבעלים חיים עם עצירות. סימנים המעידים על כאב / מצוקה כוללים חוסר הפעילות, קולות, חוסר האכילה או שתייה (התייבשות), ירידה במשקל מוגזמת, שומר, EXCessive מכרסם או מגרדים באתר של חתך. קריטריונים נוספים ששמשו בקביעת כאב ומצוקה כוללים חוסר תגובה לגירויים חיצוניים, ניקוד חולף או התגרות, נשימה מאומצת או לא נורמלית, פריקה נשא-occular חום אדמדם מתמשכת, piloerection מסומן. גם לפקח ראיות של היגיינה הירודה שהייתי מציע בעלי חיים חולים. אם בעל חיים הוא עדיין נצפה להיות במצוקה לאחר 72 שעות של טיפול (על פי קריטריוני כאב / לחץ מתאר לעיל, ולאחר שקבל את פרוטוקול משכך הכאבים שתואר לעיל) להרדימו.

2. דיאפרגמה Neuromuscular צומת ניתוח (NMJ)

  1. נתיחת בעלי חיים:
    1. נהל את החיה מנת יתר של הרדמה בזריקות (3 פעמים מינון שניתן לעיל: קטמין ב285.0 מ"ג / קילוגרם, xylazine ב30.0 מ"ג / קילוגרם, acepromazine ב0.225 מ"ג / קילוגרם; מנוהלים intraperitoneally). בעקבות מנת יתר, צריכים את כל בעלי החיים שיטה שנייה של המתת חסד (פתיחת בית החזה) לאo להבטיח מוות. מוות צריך להיות מאושר על ידי התבוננות דום לב ונשימה ועל ידי ציי תלמידים הקבועים ומורחבים של בעלי החיים.
    2. לנהל laparotomy עם מספריים או אזמל נתיחת הארכת הכריתה מתהליך zyphoid caudally לאורך קו האמצע. זהירות להפריד עור ורקמות חיבור משריר בסיסי באמצעות אזמל ומלקחיים.
    3. תוך משיכת על תהליך zyphoid, להשתמש במספריים לנתיחה כדי להסיר כל סרעפת, על מנת להבטיח כי הסרעפת נשארה מחוברת למקיפה עצם. זה חשוב כמו זה ימנע נזק לשריר הסרעפת, יאפשר לנתיחה מוצלחת של כל הסרעפת ויסייע בניקוי שרירים לצביעה לאחר מכן.
      הערה: בשלב זה, בעלי חיים יכולים להיות perfused במידת צורך.
  2. ניקוי וצביעה של הסרעפת:
    1. להצמיד את כל גזור הסרעפת, משטח מעולה פונה כלפי מעלה, לגומי סיליקון בזכוכית צלחת פטרי 100 מ"מ בparaformaldehyde 4% (שנעשה בפוספט 1% שנאגרו מלוח - PBS) במשך 20 דקות באמצעות סטראו. למתוח את הסרעפת כדי להפוך אותו מתוח, ובאמצעות סיכות חרקים, להצמיד את הרקמה שמסביב, כדי למנוע מצמיד את השריר עצמו סרעפת (איור 3).
    2. לנקות בזהירות את רקמת חיבור של משטח מעולה רק של שריר עם # 5 מלקחיים ומספריים קטנים.
      הערה: בצע את כל השלבים הבאים של פרוטוקול מכתים זה נדנדה לאט בטמפרטורת חדר המכוסה מהאור אלא אם צוין אחרת. ודא ששריר הסרעפת הוא תמיד שקוע לחלוטין בנוזל, כדי למנוע התייבשות.
    3. לפני מכתים, להכין את כל חומרים כימיים הדרושים: 1x PBS, 2% אלבומין בסרום שור (BSA) / PBS, 0.1 מ 'גליצין עשה ב 2% BSA / PBS, TBP paraformaldehyde 4% (PFA) ב 1x PBS, ושל 0.2% (0.2 % X100 טריטון ב 2% BSA / PBS). הקפד מראש מגניב מתנול ב -20 ° C.
    4. 3x לשטוף במשך 10 דקות ב1x PBS.
    5. דגירה ב 0.1 M גליצין (שנעשה ב 2BSA% / PBS) למשך 30 דקות.
    6. דגירה בRBTX פתרון (α-bungarotoxin rhodamine-מצומדות) במשך 15 דקות. פתרון לRBTX הוא כדלקמן: bungarotoxin Rhodamine מצומדות- אלפא 1: 400 דילול ב1x PBS.
      הערה: בפרוטוקול זה, Rhodamine משמשת, אבל כל fluorophore של בחירה יכול לשמש לצביעה.
    7. 3x לשטוף במשך 10 דקות ב1x PBS.
    8. במקפיא -20 מעלות צלזיוס, דגירה עם MeOH במשך 5 דקות.
      הערה: אל תוסיף MeOH לפני הצבת שריר במקפיא, ולהסיר באופן מיידי פתרון לאחר תקופת הדגירה.
    9. 3x לשטוף במשך 10 דקות ב1x PBS.
    10. הבלוק בTBP 0.2% עבור שעה 1 (0.2% טריטון עשה ב 2% BSA / PBS).
    11. דגירה עם פתרון נוגדן ראשוני (0.2% בTBP) בשעה 4 ° C למשך הלילה בזמן מתנדנד. דילולים נוגדנים כדלקמן: SV2 (01:10) וSMI-312 (1: 1000).
    12. לשטוף 3x במשך 10 דקות עם TBP 0.2%.
    13. דגירה עם נוגדנים משני באמצעות 1: של FGM1 (העז FITC- מצומדות אנטי העכבר IgG 100 דילול1; עשה ב0.2% TBP), בעוד נדנדה עבור שעה 1.
      הערה: להגן מפני אור לשאר הפרוטוקול מכתים.
    14. 3x לשטוף במשך 10 דקות עם 1X PBS.
    15. מסביב מחדש נקי רקמת חיבור במעולה (ראה לעיל) פני השטח של שריר לפני ההרכבה וcoverslipping.
      הערה: מומלץ לנקות ולאחר מכן לעלות מדגם מייד לאחר צביעה. עם זאת, במידת צורך, מדגם עשוי להיות מכוסה ב1x PBS, עטוף בparafilm על מנת למנוע אידוי ומאוחסן על 4 מעלות צלזיוס עד השבוע 1, עם שינוי של PBS יומי.
    16. על הרכבה על שקופיות זכוכית, coverslip עם הלא-hardset Vectashield. לאטום קצוות של coverslip עם לק ברור כדי שלא יתייבש. שקופיות חנות שוכבת בתיקיות קרטון שקופיות ב-20 ° C לטווח ארוך.
  3. ניתוח וההדמיה confocal:
    1. כמותית לנתח את המורפולוגיה של מוכתם ורכוב חמי-סרעפת בהגדלה 20X 40X ובאמצעות epifluorescence זקוףמיקרוסקופ.
      הערה: מכיוון שהסרעפת מוכתמת וניתחה בצורה כל הר, השרירים הוא די עבים. כתוצאה מכך, רוב כתמי הקרינה הוא לחלוטין מחוץ לפוקוס, כאשר תמונה סטטית נלקחת באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי אינו confocal. מסיבה זו, עדיף לבצע את ניתוח NMJ בזמן אמת על המיקרוסקופ כמו זה מאפשר לך כל הזמן להתמקד "למעלה" או "למטה" דרך השריר כדי לזהות את המורפולוגיה של כל אחד מNMJs הבודד כראוי. שימוש בגישה זו, ניתן בקלות לעקוב אחרי המסלול של האקסונים מוטוריים בודדים, כאשר הם עוברים דרך הרקמות ביחסים מרחביים לאשכולות קולט פוסט-סינפטי.
    2. על ידי מדידת אורך הגחון לגב של השרירים, לחלק את השריר ל 3 חלקים נפרדים לניתוח המבוסס על דפוסי עצבוב טופוגרפיים מרמות חוט השדרה ספציפיות (איור 4H).
    3. החל באזור הגחון של השריר וmoving dorsally, לנתח את כל en NMJs פנים ממוקם בסיבי שריר פני השטח. לא לנתח סיבי שרירים עמוקים יותר מ3-4 הסיבים הראשונים מהמשטח כפרשנות עלולה להיות קשה בשל חדירת נוגדן עני (RBTX חודרת עמוק הרבה יותר לתוך השריר בשל גודלו הקטן של רעלן בהשוואה לנוגדנים הגדולים יותר להשתמש בתווית נוירונים).
    4. לזהות כל NMJ כשלם אם האקסון מראש המסוף של נוירון הוא עבה בקוטר וכל האזורים של מסוף העצב חופף לחלוטין עם קולטנים הבסיסיים אצטילכולין השריר (AChRs).
    5. לזהות כל NMJ כdenervated באופן חלקי אם כל אזור של AChRs השריר הבסיסי הוא פנוי עם מקביל מסוף עצב.
    6. לזהות כל NMJ כdenervated לחלוטין אם AChRs השריר אין לי מסוף עצב מתאים (זה גם חשוב שיהיה NMJs אחר עם הנוירונים שכותרתו באותו תחום של מוקד, כך שאפשר להיות בטוח חוסר מסוף עצב הוא לא פשוט בגלל קקיr חדירת נוגדן באזור זה של שרירים).
    7. לזהות כל NMJ כלהכפיל innervated אם יש innervating האקסון מראש מסוף אחד או יותר NMJ בודד (זה מצביע על כך שחלה רמה מסוימת של denervation וסביר ניסיונות של reinnervation בצומת זה).
    8. לזהות כל NMJ כדק innervated אם NMJ יש חפיפה מלאה בין מסוף העצב וAChRs בסיס אבל יש האקסון מראש מסוף רזה (זה גם מעיד על רמה מסוימת של denervation וניסיונות reinnervation).
    9. לבצע ניתוח לכל אחד מהאזורים שזוהו 3 לכל האחת מקטגוריות NMJ מעל לכל חיה. ממוצע הנתונים מכל חיה עם תוצאות מבעלי חיים אחרים מאותה קבוצת הניסוי. כ 200-300 צמתים בשריר עכברוש חמי-סרעפת ו150-200 בחמים-סרעפת עכבר צריכים לכמת בלפחות 3 (רצוי 5-6 או יותר) בעלי חיים לקבוצת ניסוי.
    10. להשיג תמונות confocal ברזולוציה גבוהה, שימושד לפרסום, עם מיקרוסקופ confocal.
    11. להשיג Z- ערימות בגודל 0.3 מיקרומטר צעד ל20-40 מיקרומטר מעמקים, ולאסוף חלקים אופטיים נוספים מעל ומתחת לכל צומת כדי להבטיח שהפרופיל הסינפטי כל כלול.
    12. השתמש בתוכנת רכישה לשחזר תמונות Z-סדרה לתחזיות בעוצמה מקסימלית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sprague-Dawley חולדות מבוגרות קיבלו גם laminectomy בלבד (שליטה ללא פגע) או חמי-חבלה חד צדדית SCI ברמת חוט השדרה C4 10-12. בשעת 5 שבועות לאחר ניתוח, שיא משרעת מבנה מפת צבעים נרשמו מחם-סרעפת ipsilateral לאתר laminectomy / פציעה הופחתה באופן משמעותי בחולדות SCI (איור 2 ג) בהשוואה לשליטת laminectomy בלבד (איור 2). כל NMJs בחמים-הסרעפת היה לגמרי שלם בחולדות פראית מסוג שאינם חולות שליטה (איור 4 א, ​​ג). להיפך, חולדות SOD1

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כפונקציה נשימה נפגעת בשני SCI הטראומתי וALS, פיתוח טיפולים המתמקדים בנשימה ובאופן ספציפי עצבוב סרעפת קליני רלוונטיים 5,6. כדי ללמוד לתפקד בדרכי הנשימה באופן מקיף, יש להשתמש בשיטת גישה משולבת. CMAPs למדוד את מידת העצבוב התפקודי של הסרעפת בדרך של גירוי עצב הסרעפת חיצוני, אבל כונן הנשימה bulbospinal לא אנדוגני 8. בנוסף, הקלטות אלה אינן מאפשרות בחינה של שינויים מורפולוגיים בNMJ, במיוחד ברמה של אקסונים מוטוריים בודדים וקולטני אצטילכולין פוסט-סינפטי. על ידי שימוש ב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יש לנו מה למסור.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי NINDS (מענק #1R01NS079702 ל-A.C.L.) ותוכנית SURP באוניברסיטת תומאס ג'פרסון (M.M).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ParaformaldehydeFisher T353-500הכינו תמיסה של 10% תחילה במים מזוקקים נטולי יונים; הכינו 4% עם 1x PBS, התאימו את ה-pH ל-7.4
1x תמיסת מלח חוצצת פוספט, pH 7.4Invitrogen10010049-2
% אלבומין בסרום בקר (2% BSA)Sigma-AldrichA3059-100gממיסים 2 גרם BSA ל-100 מ"ל של 1x PBS
0.2% Triton X100 ב-2% BSA/PBS (מאגר חוסם)סיגמא-אולדריץ'T9284-100 מ"לממיסים 0.2 מ"ל/100 מ"ל 2% BSA/PBS
0.1 מ' גליציןסיגמא-אולדריץ'G-7126מוסיפים 0.185 גרם ל-25 מ"ל של 2% BSA/PBS
α-bungarotoxinInvitrogenT1175ריכוז 1:400
SMI-312שטרנברגר מונוקלונליםSMI312ריכוז 1:1,000
SV2מחקרים התפתחותיים בנקהיברידומהSV2-Supernatantריכוז 1:10
FITC עז נגד עכבר IgG1Roche3117731001ריכוז 1:100
גומי סיליקוןSylgard, Dow CorningPart # 184עקוב אחר ההוראות המצורפות לערכה: יכול להשתמש בצלחת תרבית בגדלים מרובים (30 מ"מ, 60 מ"מ, 100 מ"מ) בהתאם לצרכים
Vectashield מדיום הרכבה פלואורסצנטימעבדות וקטורH-1000זה לא מדיום קשיח. תצטרך לאבטח את החלקת הכיסוי עם לק שקוף.
מספריים קפיציים קטניםFine Science Tools15002-08
מלקחיים לדיסקציהFine Science Tools11295-51
תוכנה להקלטות CMAPהיקף 3.5.6; ADI
אלקטרודות משטח דיסקNatus נוירולוגיה019-409000
אלקטרודות מחט תת עוריותNatus נוירולוגיה019-453100
ג'ל מוליךAquasonic122-73720
מערכת סטימולטור/הקלטה להקלטות CMAPממריץ
להקלטותCMAPביואמפ
מגבר ADI Powerlab 8SP

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Miller, R. G., et al. Practice parameter: the care of the patient with amyotrophic lateral sclerosis (an evidence-based review): report of the Quality Standards Subcommittee of the American Academy of Neurology: ALS Practice Parameters Task Force. Neurology. 52, 1311-1323 (1999).
  2. Sandhu, M. S., et al. Respiratory recovery following high cervical hemisection. Respir Physiol Neurobiol. 169, 94-101 (2009).
  3. Kaplan, L. M., Hollander, D. Respiratory dysfunction in amyotrophic lateral sclerosis. Clin Chest Med. 15, 675-681 (1994).
  4. Holtz, A., Levi, R. Spinal Cord Injury. , Oxford. Available from: http://www.alibris.com/ (2010).
  5. Bruijn, L. I., et al. ALS-linked SOD1 mutant G85R mediates damage to astrocytes and promotes rapidly progressive disease with SOD1-containing inclusions. Neuron. 18, 327-338 (1997).
  6. Sharma, H., Alilain, W. J., Sahdu, A., Silver, J. Treatments to restore respiratory function after spinal cord injury and their implications for regeneration, plasticity and adaptation. Experimental Neurology. 235, 18-25 (2012).
  7. Gourévitch, B., Mellen, N. The preBötzinger complex as a hub for network activity along the ventral respiratory column in the neonate rat. Neuroimage. 98, 460-474 (2014).
  8. Strakowski, J. A., Pease, W. S., Johnson, E. W. Phrenic nerve stimulation in the evaluation of ventilator-dependent individuals with C4- and C5-level spinal cord injury. Am J Phys Med Rehabil. 86, 153-157 (2007).
  9. Wright, M. C., et al. Distinct muscarinic acetylcholine receptor subtypes contribute to stability and growth, but not compensatory plasticity, of neuromuscular synapses. J Neurosci. 29, 14942-14955 (2009).
  10. Li, K., et al. Overexpression of the astrocyte glutamate transporter GLT1 exacerbates phrenic motor neuron degeneration, diaphragm compromise, and forelimb motor dysfunction following cervical contusion spinal cord injury. J Neurosci. 34, 7622-7638 (2014).
  11. Nicaise, C., et al. Early phrenic motor neuron loss and transient respiratory abnormalities after unilateral cervical spinal cord contusion. Journal of neurotrauma. 30, 1092-1099 (2013).
  12. Nicaise, C., et al. Phrenic motor neuron degeneration compromises phrenic axonal circuitry and diaphragm activity in a unilateral cervical contusion model of spinal cord injury. Exp Neurol. 235, 539-552 (2012).
  13. Lepore, A. C., et al. Peripheral hyperstimulation alters site of disease onset and course in SOD1 rats. Neurobiol Dis. 39, 252-264 (2010).
  14. Alilain, W. J., Horn, K. P., Hu, H., Dick, T. E., Silver, J. Functional regeneration of respiratory pathways after spinal cord injury. Nature. 475, 196-200 (2011).
  15. Zhang, B. M. F., Cummings, K. J., Frappell, P. B., Wilson, R. J. Novel method for conscious airway resistance and ventilation estimation in neonatal rodents using plethysmography and a mechanical lung. Respir Physiol Neurobiol. 201, 75-83 (2014).
  16. Ngo, S. T., Bellingham, M. C. Neurophysiological recording of the compound muscle action potential for motor unit number estimation in mice. Neuromethods. 78, 225-235 (2013).
  17. Nicaise, C., et al. Degeneration of phrenic motor neurons induces long-term diaphragm deficits following mid-cervical spinal contusion in mice. Journal of neurotrauma. 29, 2748-2760 (2012).
  18. Lepore, A. C., et al. Human glial-restricted progenitor transplantation into cervical spinal cord of the SOD1G93A mouse model of ALS. PLoS One. 6, (2011).
  19. Lepore, A. C., et al. Focal transplantation-based astrocyte replacement is neuroprotective in a model of motor neuron disease. Nature neuroscience. 11, 1294-1301 (2008).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Whole Mount

מאמרים קשורים