מאמר שיטה

לטווח ארוך Intravital multiphoton מיקרוסקופית הדמיה של תאים חיסוני בבריאים וחולה כבד באמצעות עכברים CXCR6.Gfp Reporter

DOI:

10.3791/52607

⸱

24 במרץ 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine III, RWTH University-Hospital Aachen, 2IZKF Aachen Core Facility "Two-Photon Imaging", RWTH University-Hospital Aachen, 3Institute for Laboratory Animal Science & Experimental Surgery, RWTH Aachen University, 4Institute for Pharmacology, RWTH University-Hospital Aachen

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הדמיה תוך-חיונית יציבה ברזולוציה גבוהה של תאי חיסון בכבד היא מאתגרת. כאן אנו מספקים שיטה רגישה ואמינה ביותר לחקר נדידה ואינטראקציות תאים-תאים של תאים חיסוניים בכבד עכבר לאורך תקופות ארוכות (כ-6 שעות) על ידי מיקרוסקופ סריקת לייזר רב-פוטוני תוך-חיוני בשילוב עם ניטור טיפול נמרץ.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דלקת כבד כתגובה לפציעה היא תהליך דינמי מאוד מעורב החדירה של סוגים נבדלים של לויקוציטים כוללים מונוציטים, נויטרופילים, תת תא T, תאי B, רוצח טבעי (NK) ותאי NKT. מיקרוסקופיה Intravital של הכבד לניטור נדידת תאים חיסוני היא מאתגרת במיוחד בשל הדרישות גבוהות לגבי הכנת מדגם וקיבעון, רזולוציה אופטית והישרדות של בעלי חיים לטווח ארוך. עם זאת, הדינמיקה של תהליכים דלקתיים כמו גם מחקרי אינטראקציה סלולריים יכולה לספק מידע קריטי להבין ייזום, ההתקדמות ונסיגה של מחלת כבד דלקתית טוב יותר. לכן, שיטה רגישה והאמינה ביותר הוקמה כדי ללמוד הגירה ותא-תא-אינטראקציות של תאי חיסון שונים בכבד עכבר על פני תקופות ארוכות (כ -6 שעות) על ידי מיקרוסקופ שני הפוטונים intravital סריקת לייזר (TPLSM) בשילוב עם טיפול נמרץ ניטור. אף אוזן גרון "> השיטה סיפקה כוללת הכנה עדינה וקיבוע יציב של הכבד עם ההפרעות מינימליות של האיבר; הדמיה intravital ארוכת טווח באמצעות מיקרוסקופ multiphoton ססגוניות עם כמעט ללא photobleaching או תופעות phototoxic על פני תקופה של עד 6 שעות זמן, המאפשרת מעקב של תת ספציפיים לויקוציטים; ותנאי הדמיה יציבים בשל ניטור המקיף של פרמטרים חיוניים עכבר וייצוב של זרימה, טמפרטורה וחילוף גזים.

לחקור הגירת הלימפוציטים על דלקת כבד CXCR6.gfp לדפוק בעכברים היו נתונים להדמית כבד intravital בתנאי מחקר ולאחר פגיעה בכבד אקוטית וכרונית הנגרמת על ידי הזרקת intraperitoneal (ים) של פחמן טטרא (4 CCL).

CXCR6 הוא קולט chemokine הביע בלימפוציטים, בעיקר על הטבעי Killer T (NKT) -, רוצח טבעי (NK) - associ רירית ותת קבוצות של לימפוציטים מסוג T כגון תאי CD4 T, אלא גםשמורת ated תאים (MAIT) T 1. בעקבות הדפוס נודד ומיצוב של CXCR6.gfp + תאי חיסון אפשר תובנה מפורטת להתנהגותם המשתנית שלהם על פגיעה בכבד, ולכן מעורבות הפוטנציאל שלהם בהתקדמות מחלה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ההדמיה של תאים ותפקודים תאיים בכל איברים או אפילו כל יצורים הייתה עניין רב במשך יותר מ -50 שנים, הכוללת כמעט את כל חלקי הגוף 2. לכן, חלק מהמחקרים המוקדמים כבר בהדמית intravital של הכבד 3,4. עם זאת, יש מספר מגבלות קיימות מעודכנים לגבי הדמיה ברזולוציה גבוהה יציבה לטווח הארוך של רקמת כבד.

בשל המיקום האנטומי של הכבד בקשר הדוק עם הסרעפת ומערכת עיכול 5, הבעיה הנפוצה ביותר להדמיה מיקרוסקופית intravital היא תנועה בשל נשימה ו, ובמידה פחותה, נפיחה של המעי 6. בהשוואה לאיברים מוצקים אחרים, ניתוח בכבד הוא מאתגר במיוחד. בשל מבנה כלי הדם הצפוף, מניפולציה כירורגית יכולה להוביל לנגעים מדממים מסיביים, זרימת דם לקוי 7 וגם הפעלה של תושב iתאי mmune כגון תאי Kupffer 8. לכן, קיבעון מכאני של הרקמה כפי שפורסם במקום אחר 6,9 עלול להפריע להדמיה מיקרוסקופית intravital.

בכבד בריא, 10-15% מכלל נפח הדם שוכנים בתוך כלי הדם בכבד, והאיבר מקבל כ -25% מתפוקת הלב הכוללת של 10, טיוח האיבר רגיש מאוד לשינויים במחזור הדם (למשל, תנודות בלחץ הדם ). לכן, שיבושים בזרימת דם בכבד עקב למשל, מאמץ גזירה, עקירה, פגיעה על ידי טיפול ברקמה מוגזם או מחזור מרכזי יובילו לשינויים מלאכותיים בהתנהגות נדידה לויקוציטים, חמצון כבד פגום ונזק כבד ולכן עוד יותר, המשפיעים על תגובה חיסונית בכבד, כמו גם כשימור איברים וזמן חיים כולל של בעלי החיים.

מחקרים מיקרוסקופיים מוקדמים התבססו על מיל epifluorescence intravitalcroscopy, אבל כמה אילוצים טכניים כגון הלבנת תמונה ועומק חדירה נמוכה להגביל את השימוש בטכניקה זו להדמיה כבד לטווח ארוך 4,11,12. עם התפתחותה של מיקרוסקופיה multiphoton בשנת 1990, את המגבלות של הלבנת תמונה או עומק חדירה נפתרו בעיקר, כשיטת חדשה זו הייתה מבחינה טכנית מסוגלת לבצע בדיקות הדמיה כמעט בכל האיברים תחת מצבים בחיים אמיתיים 13-15. עם זאת, האתגרים העיקריים שנותרו פתוחים בנוגע להדמית כבד היו: תנועות נשימה, autofluorescence של רקמת כבד, הבטחת זרימת דם ללא שינוי בsinusoids הכבד, והדמיה יציבה במיוחד לתקופות ארוכות יותר של מספר שעות 16.

למרות שמספר מחקרים התייחסו לפונקציה וההגירה של לויקוציטים השונים בכבד 17, למשל, NKT-תאים 18-20, תאי T 21,22, מקרופאגים כבד 23,24 או נויטרופילים 25, מ 'multiphoton לטווח ארוךההדמיה icroscopy עדיין לא נוצרה בהצלחה, משימה מאתגרת יותר אפילו בבעלי חיים עם מחלת כבד אקוטית או כרונית עקב הנזק הקיים ורגישות גבוהה יותר ולכן לפגיעה נוספת 26. עם זאת, ניטור התנהגות נדידה ותפקוד תאי של לויקוציטים בכבד בזמן אמת מאפשר תובנות רומן בתפקיד המסוים שלהם בהומאוסטזיס כבד ומחלות 27.

CXCR6 קולט chemokine באה לידי ביטוי בכמה תת-רכיבי הלימפוציטים, כוללים רוצח טבעי (NK) תאים, תאי NKT וכמה אוכלוסיות תאי T 18,28. מחקרים קודמים בעכברים הראו כי CXCR6 וCXCL16 יגנד המקור שלה יכולים לשלוט הסיורים של תאי NKT על sinusoids הכבד במהלך הומאוסטזיס. כתוצאה מכך, השימוש בעכברי CXCR6.gfp (ביצוע נוק-בחלבון פלואורסצנטי ירוק [GFP] של במוקד CXCR6) תוארו לחקור את ההגירה של לימפוציטים באיברים שונים כגון מוח 29וגם כבד 18,20, מראה עליית חדירה של תאי CXCR6.gfp על דלקת.

בשיטה שנקבעה במחקר זה ניתן היה לעקוב אחר תהליכים אלה על פני תקופה ארוכה של זמן בתנאים התייצבו. הליך multiphoton intravital מבוסס אפשר הדמיה שהייתה מאוד לשחזור עם ההפרעות מינימליות של בעלי החיים והאיברים; מותאם להישרדות של בעלי חיים לטווח ארוך על ידי ניטור נרחב אחריו שליטה הדוקה של נשימה ומחזור דם; וגמישים וקלים מאוד לאמץ גם לאיברי parenchymal אחרים כגון כליות או טחול.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: הניסויים בוצעו בהתאם לחקיקה המסדירה הגרמנית מחקרים בבעלי החיים הבאים "המדריך לטיפול ושימוש בחי מעבדה" (NIH פרסום, מהדורת 8, 2011) וההוראה 2010/63 / האיחוד האירופי על ההגנה על בעלי החיים משמש למטרות מדעיות (כתב עת הרשמית של האיחוד האירופי, 2010). אישור רשמי ניתנה ממשרד הטיפול בבעלי החיים ושימוש הממשלתי (LANUV Nordrhein-Westfalen, רקלינגהאוזן, גרמניה).

הערה: צעדים שניתן להשמיט הדמיה לטווח קצר (למשל יריות הצמד, ערימות 3-D או גם מיקרוסקופיה זמן לשגות זמן קצר) מסומנות בכוכבית (*) כדי לקצר את זמן הכנה ולפשט את הפרוטוקול כירורגית. הדמיה יכולה גם להתבצע ללא בקרת ניטור ומחזור נרחבת במידת צורך, עם זאת, זמן הישרדות יופחת במידה ניכרת.

1. הגדרת מיקרוסקופ וטרום ניתוח הכנה (5-10 ק"מn)

  1. מערכת מתג (מיקרוסקופ, מעבדה כוח, לייזר, כרית חימום, תא האקלים, מצלמת אינטרנט, מכשיר משאבת מזרק, הנשמה).
  2. חבר O 2 אספקה ​​לIsoflurane החמקן ורמת Isoflurane מוגדרת 1.5% כרך (V / V), להתחבר למכונת הנשמה חיה קטנה.
    1. הדמיה לטווח קצרה, לשמור על ההרדמה באמצעות isoflurane רק לאחר האינדוקציה ההרדמה ip הראשונית (ראה שלב 2.2). לאחר מכן, השתמש 2% כרך (V / V) Isoflurane, ולשמור על זמן ההדמיה מתחת ל -2 שעות כדי להבטיח זרימת דם בכבד יציבה.
  3. הגדר נשימה ל120-140 מחזורי נשימה / min בהיקף של 150-200 μl.
  4. הגדר את שלב agarose העכבר. הכן של 3% (w / v) agarose 100 מיליליטר, לשפוך אותו לתוך צלחת (כ 10 סנטימטרים x 15 סנטימטרים בסיס) בזווית של 40 מעלות.
  5. הגדר את אזור ניתוח עבודת איסוף המכשור הנדרש. כדי למנוע זיהום חיידקים, חיטוי מכשירים באמצעות פתרון 1% מSekusept Forte S (9.9% w / v), Glutaral 9.8% w / v, פורמלדהיד ל5 דקות לפני הניסוי (איור 1 א).
  6. להשיג רכיבים שנותרו: חיטוי עור (לדוגמא, תמיסת יוד povidone 10%), שלב כבד (ערימות וגשר), פתרון agarose (3% (w / v) בPBS), משאבת מזרק עם 5% (w v /) פתרון גלוקוז (G-5), משאבת מזרק עם חומר הרדמה ש( מ"ג קטמין 0.1 / מיליליטר, מ"ג Xylazine 0.5 / מיליליטר, 5 מיקרוגרם / מיליליטר פנטניל), צמר גפן, n-בוטיל-2-Cyanoacrylat, ו1x PBS. שים צלחת שלב agarose לתוך תא דגירה לחימום מוקדם.

2. קנה (10-15 דקות)

  1. השתמש C57BL / 6 עכברים ברביית בית במשקל 25-28 גרם. בית העכברים בתנאי הפתוגן ללא ספציפיים בהתאם להנחיות FELASA, לטמפרטורת סביבה ולחות מבוקרת עם hr אור 12 / מחזור כהה 12 שעות. לאפשר גישה חופשית לבעלי חיים תזונה סטנדרטית עכברים (דיאט מכרסם רגיל לרחרח) וכרצונך מים.
  2. להרדים את העכבר על ידי initintraperitoneal ial הזרקה (IP) של 250 μl של ההרדמה II (קטמין 0.1 מ"ג / מיליליטר, מ"ג Xylazine 1 / מיליליטר, עצירות 10 מיקרוגרם / מיליליטר).
    1. * לתחזוקה במהלך ההדמיה intravital, ברציפות לנהל הרדמה אני בזריקת ip רציפה (מ"ג קטמין 0.1 / מיליליטר, מ"ג Xylazine 0.5 / מיליליטר, פנטניל 5 מיקרוגרם / מיליליטר) באמצעות מכשיר משאבת מזרק עם קצב זרימה של 0.2 מיליליטר / שעה ב שילוב עם% כרך inhalative isoflurane 0.5 (V / V).
    2. בדוק את הרפלקסים לאחר 5 דקות (לדוגמא כרית כף רגל קמצוץ עם מלקחיים), לחטא את העור לtracheotomy, להתחיל הכנה אם עכבר נמצא במצב הרדמה כירורגית סובלני.
    3. החל קרם עיני מגן (לדוגמא, Dexpanthenol 50 מ"ג / g) כדי למנוע קרנית מפני התייבשות (איור 1).
  3. לקבע עכבר על שולחן הכנה חושף צד הגחוני באמצעות נייר דבק לגפיים; בעדינות להתמתח יתר על מידת צוואר, לקבע בתנוחה זו, למשל., על ידי שימוש בגומיית מכור to החותכות.
    1. לחטא את עור ופרווה באמצעות תמיסת יוד povidone, על ידי יישום חומר חיטוי עם מקלון צמר גפן.
  4. לבצע חתך בעור ראשוני (סנטימטר אורך 0.5-1) ישירות מתחת לסנטר (איור 1 ג)
    1. בזהירות לנתח רקמות חיבור בין בלוטות רוק (1D איור).
    2. לקרוע זהירות קנה הנשימה צינור המקיף את שרירים פתוחים (איור 1E, F).
  5. מניחים חוט כירורגי מתחת לקנה הנשימה לקיבוע צינור האוורור מאוחר יותר (איור 1G).
    1. קנה נשימה פתוחה עם מיקרו מספריים בין טבעות סחוס ביצוע חתך בצורת T (איור 1H)
  6. מניחים צינור אוורור לקנה נשימה דרך החתך (~ 0.5 סנטימטרים). לדחוף את הצינור קדימה, לתפוס סוף הזנב עם מלקחיים אנטומיים קטנים ובעדינות לקדם את הצינור לתוך קנה הנשימה (איור 1 ט)
  7. לקבע צינור עם חוט כירורגית (לדוגמא , 5-0) עם חוט יוצב בשלב 2.5 קשירת קשר סביב צינור בתוך קנה הנשימה; לבצע קיבוע גולגולת שני של הצינור בעור, כדי למנוע depositioning המקרי (איור 1J, K).
  8. לחתוך חותם עם דבק רקמות (למשל, n-בוטיל-2-Cyanoacrylat) (איור 1 ליטר).
  9. לקבע צינור בראש באמצעות סרט דבק.

3. Laparatomy (15-20 דקות)

  1. הנח את העכבר על כרית חימום כדי למנוע היפותרמיה. לגלח את הבטן, להסיר בזהירות את שיער מהעור. לחטא את עור ופרווה מגולחים באמצעות תמיסת יוד povidone.
  2. בצע עור קטן לחתוך מתחת לעצם החזה באמצעות מספריים כירורגית (איור 2 א). להאריך את הקיצוץ רוחבי מתחת לצלעות לשני הצדדים, צריבה כל כלי הדם הגלויים כדי למנוע דימום.
  3. לבצע בזהירות חתך קטן בalba linea מתחת לעצם החזה, פתיחת הצפק (איור 2). להאריך את החתך לשני הצדדים באמצעות cauterization כדי למנוע דימום (איור 2 ג, ד).
  4. הנח את העכבר לתוך צלחת שלב agarose (איור 2E). מניחים ערימות של גובה מתאים בשני הצדדים של העכבר (בדרך כלל 12-14 כיסוי התלושים) (איור 2F).
  5. הנח חיישן הדק נשימה מתחת גב עליון לסנכרן מיקרוסקופ עם הנשימה. הפעל יחידת הדק (איור 2G).
  6. מניחים חוט כירורגי (5-0) דרך עצם החזה לחזור צלעות (איור ט 2).
  7. לחתוך בזהירות רצועת חיבור כבד וסרעפת (רצועת falciform), כמו גם בדרכי עיכול וכבדות באמצעות מספריים כירורגיות מעוקלים. חותך את רצועות falciform אל אב העורקים (איור י 2).

4. הגדרת דוגמא (10-15 דקות)

  1. מניחים את העכבר בצד ימין עם זווית של 45 מעלות לגישה קלה לאונת כבד גדולה.
  2. להוסיף גשר בימוי מתחת לצלעות, המכסה את הבטןחלל. ייצור גשר באמצעות להחליק את מכסה סטנדרטי עם ציפוי נייר דבק כדי לכסות קצוות חדים (איור 2K).
  3. הנח אונת כבד גדולה על במה. להחליק בזהירות בדיקה עט כדור הכפול או מרית מרופדת מתחת לכבד והחזק את החלק העליון של האיבר באמצעות מקלון צמר גפן רטוב או רקמה רטובה. הרם אונה לשקופית ולהחיל גרירה עדינה. אונה יכולה להיות כפופה או מקופלת. לספק טיפול נוסף כדי רק מניפולציה עדינה של הכבד (איור 2L).
  4. מניחים הימור צדדי תומך, למשל, ערימות של פתקים קטנים כיסוי (20 מ"מ x 20 מ"מ), בסך של כ באותו הגובה של אונת הכבד לצד זה כדי לתמוך בתלוש לכסות.
  5. מניחים פתק גדול כיסוי (24 מ"מ x 50 מ"מ) באונת הכבד. ודא שכיסוי להחליק מכוון כאופקי ככל האפשר (איור 2M).
    הערה: להחליק את המכסה צריך להיות במגע עם הרקמה בלי לסחוט אותו. לבדוק סימנים נראים לעין של זרימת דם לקויה (רקמה לבנה). אם microcirculation מופר, להוסיף תמיכה בהימור נוספת.
  6. * מקום שני צנתרים intraperitoneal עצמאיים (איור 2N) להרדמה לטווח ארוך ויישום G-5. התקן צנתרים רוחבי בבטן התחתונה בסמוך לגפיים האחורי.
    הערה: הצנתרים intraperitoneal יכולים להיות על ידי חיבור 27 מחטי G עם צינורות גמישים סיליקון (איור 3) מתוצרת עצמית.
  7. * מחט לקבע עם לולאה של חוט 5-0 כירורגית לעור, כדי למנוע תזוזה מקרית.
  8. * צרף משאבת מזרק עם פתרון הרדמה אני לקטטר 1, קצב זרימה מוגדר 0.2 מיליליטר / שעה; לצרף משאבת מזרק עם G-5 לקטטר 2, קצב זרימה מוגדר 0.1 מיליליטר / שעה.

5. ניטור עכבר

  1. * אלקטרודות א.ק.ג. מקום לחזית וגפיים אחוריות (איור 4 א).
  2. * צרף צינורות תפוגה ל- CO 2 חיישן רמה.
  3. להוסיף חיישן טמפרטורה חיצוני המחובר למשטח חום (איור 4C).

6. הטבעה וקיבוע רקמות (5-10 דקות)

  1. הכן של 3% (w / v) agarose ב1X PBS 100 מיליליטר. להטביע כבד, כאשר הטמפרטורה היא 41 מעלות צלזיוס באמצעות מזרק 5 מיליליטר ומחט 18 G (איור 5 א).
  2. יוצקים agarose שנותר על coverslip וסביב העכבר (איור 5 ב, ג). חכה עד agarose gelatinized באופן מלא.
  3. הסר agarose העודף באמצעות מרית היידמן, הכנת viewfield גדולה מספיק כדי לסרוק את אונת הכבד מוכנה (איור 5D, E).

7. הדמיה

  1. העבר את העכבר לתא אקלים מיקרוסקופ.
  2. להוסיף 50-100 מיליליטר של 1x PBS (שחומם מראש על 37 מעלות צלזיוס).
  3. כיסוי צלחת מדגם כדי למנוע אידוי (איור 5F).
  4. * ירידת isoflurane inhalative 0.5 כרך% (v / v).
  5. * התחל תוכנת ניטור, הקלטת א.ק.ג., קצב לב וCO 2 הנשיפה.
  6. התחל הדמיה: לפתוח להתריסי ser, לזהות שדות ראייה של עניין, להגדיר גבול עליון ותחתון לZ-ערימות, ולהתחיל בהקלטת הזמן לשגות. להתקין מחדש Z-ערימות אם יש צורך לתקן את Z-הסחיפה (למשל. כתוצאה משינויים בלחץ דם או תנודות טמפרטורה, איור (5G).
    הערה: לאחר סיום תקופת ההדמיה או אם במחזור או ההרדמה של בעלי החיים הופך לבלתי יציב, להקריב את העכברים על ידי נקע בצוואר הרחם (בלי התעוררות מההרדמה).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי לאמת את גישת TPLSM intravital שלנו, אנו חשופים GFP / + עכברי CXCR6 להדמית TPLSM intravital. עכברים שלא טופלו או הושארו כפקדים בסיסיים או נתון להזרקת intraperitoneal אחת של פחמן טטרא (CCL 4) כדי לגרום לנזק בכבד חריף 20.

רצפי וידאו נלקחו על פני תקופה של 2-5 שעות זמן, ותאים אותרו לאורך זמן בשל הקרינה הירוקה שלהם. כדי להציג תנועתיות סלולרית כללית, כל המסלולים שהתגלו במהלך ההליך הי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מטרת המחקר שלנו הייתה לפתח שיטה סטנדרטית מאוד, יציבה ושחזור ההדמיה TPLSM intravital של הכבד. ההדמיה Intravital בכלל נתנה תובנות רבות ערך להתנהגות סלולרית בתנאי חיים אמיתיים הבאים ביות ואינטראקציה של אוכלוסיות לויקוציטים שונות בפיתוח, הומאוסטזיס ומחלה. עם זאת, העמדה המאתגרת מעט האנטומי של הכבד, עקב אשר בדרכי הנשימה ותנועת מעיים peristaltic ישירות מועברים אל הכבד, כמו גם גבוהות השבריריות שלהם בהשוואה לאיברים מוצקים אחרים המוטלת כמה אתגרים להדמית intravital ארוך טווח יציב. בשנים האחר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אינם חושפים ניגוד אינטרסים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים למתקן המרכזי לבעלי חיים של בית החולים האוניברסיטאי אאכן על התמיכה הטכנית. עבודה זו נתמכה על ידי קרן המחקר הגרמנית (DFG Ta434/2-1, DFG SFB/TRR 57) ועל ידי המרכז הבינתחומי למחקר קליני (IZKF) אאכן. עבודה זו נתמכה עוד על ידי מתקן הליבה "הדמיית שני פוטונים", מתקן ליבה של המרכז הבינתחומי למחקר קליני (IZKF) אאכן בתוך הפקולטה לרפואה באוניברסיטת RWTH אאכן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
חומרי הרדמה
בופרנורפיןאסקס פארמה997.00.00אנלגטיקום, 0.1 מ"ג/ק"ג
פנטנילרוטקס מדיקהטעינה: 30819
מערכת הרדמה Fluovacמכשיר הרווארד34-1030
גלוקוז 5%בראון
ISOFLO (אדי איזופלורן)Eickemeyer4802885
IsofluraneForene AbbottB 506
תמיסת NaCl איזוטונית (0.9%)DeltaSelect GmbHPZN 00765145
קטמין 10%סמ"קטעינה: 36217/09
קסילזין 2%medistarטעינה: 04-03-9338/23
חומרים מתכלים
20 מ"ל מזרקBD פלסטיפק
250 מ"ל בקבוק ארלנמאיירשוט דוראן21 226 36
25 מ"ל 2xשוט דוראן50-1150
2 מ"ל מזרקBD פלסטיפק
4-0 תפר ויקרילEthiconV7980
Agaroseזמין
Bepanthen Eye ו משחת אףBayer Vital GmbH6029009.00.00
Change-A-Tip Deluxe ערכת קוטריה בטמפרטורה גבוההFine Science Tools Inc.18010-00
ספוגיות גזה כותנהFuhrmann GmbH32014
כיסוי תלוש 24x50 מ"מROTH1871
סרט משי Durapore3M1538-1
נוצה חד פעמיתאזמל נוצה02.001.30.011
צינורות פוליאתן עדינים 0.58 מ"מ IDSmiths רפואי800/100/200
היסטואקרילבראון10500525x 0.5 מ"ל
לויקופלסטBSN מדיקל בע"מ
מיקרוסקופ שקופיותROTH1879
פולי-אלכוהול Haut… farblos AntisepticumAntiseptica GmbH72PAH200
מחט סטריקנית 18 גרם x 1B. בראון304622
מחט סטריקנית 27 3/4 G x 1B. בראון4657705
נייר טישוזמין
מכשירים
אמלגם משרף 3PLGatz0110?
מחזירי בלייר (4 שיניים (קהים)) x2Storz& קלייןS-01134
דומונט מס' 7 מלקחייםFine Science Tools Inc.91197-00
מלקחיים מעוקלים x1Fine Science Tools Inc.11151-10
מלקחיים של Graefe ישר x2Fine Science Tools Inc.11050-10
מרית היידמן HD2Stoma2030.00
מחזיק מחט MathieuFine Science Tools Inc.12010-14
מספרייםפיין מדע כלים בע"מ14074-11
מלקחיים של SemkenFine Science Tools Inc.11008-13
מספריים כירורגיים קטנים מעוקליםFine Science Tools Inc.14029-10
מספריים כירורגיים קטנים ישרFine Science Tools Inc.14028-10
מלקחיים בתבנית סטנדרטיתFine Science Tools Inc.11000-12
Vannas מספריים קפיצייםFine Science Tools Inc.15000-08
ציוד
א.ק.ג יחידת טריגרמהיר ביו-רפואי3000003686
MICROCAPSTAR מנתח פחמן דו חמצני קצה גאות ושפלמכשירי AD Minivent
Typ 845מכשיר הרווארד73-0043
מיקרוסקופ מולטיפוטון טרימסקופ ILaVision
Perfusor CompactB. Braun
PowerLab 8/30 מקליט 8 ערוציםAD InstrumentsPL3508
כרית חימום מבוקרת טמפרטורהSygonix26857617
חיישן טמפרטורהזמין
מערכת מבוקרת טמפרטורה למיקרוסקופים -Cube& שירותיהדמיה
מסחריתמסחריתכירורגייםבאופן מסחרי של Box Life

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dusseaux, M., et al. Human MAIT cells are xenobiotic-resistant, tissue-targeted, CD161hi IL-17-secreting T cells. Blood. 117 (4), 1250-1259 (2011).
  2. Reese, A. J. The effect of hypoxia on liver secretion studied by intravital fluorescence microscopy. Br J Exp Pathol. 41, 527-535 (1960).
  3. Bhathal, P. S., Christie, G. S. Intravital fluorescence microscopy study of bile ductule proliferation in guinea pigs. Gut. 10 (11), 955(1969).
  4. Stefenelli, N. Terminal vascular system and microcirculation of the rat liver in intravital microscopy. Wien Klin Wochenschr. 82 (33), 575-578 (1970).
  5. Hori, T., et al. Simple and sure methodology for massive hepatectomy in the mouse. Ann Gastroenterol. 24 (4), 307-318 (2011).
  6. Tanaka, K., et al. Intravital dual-colored visualization of colorectal liver metastasis in living mice using two photon laser scanning microscopy. Microsc Res Tech. 75 (3), 307-315 (2011).
  7. Schemmer, P., Bunzendahl, H., Klar, E., Thurman, R. G. Reperfusion injury is dramatically increased by gentle liver manipulation during harvest. Transpl Int. 13, Suppl 1. S525-S527 (2000).
  8. Schemmer, P., et al. Activated Kupffer cells cause a hypermetabolic state after gentle in situ manipulation of liver in rats. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 280 (6), G1076-G1082 (2001).
  9. Toiyama, Y., et al. Intravital imaging of DSS-induced cecal mucosal damage in GFP-transgenic mice using two-photon microscopy. J Gastroenterol. 45 (5), 544-553 (2010).
  10. Zimmon, D. S. The hepatic vasculature and its response to hepatic injury: a working hypothesis. Yale J Biol Med. 50 (5), 497-506 (1977).
  11. Wong, J., et al. A minimal role for selectins in the recruitment of leukocytes into the inflamed liver microvasculature. J Clin Invest. 99 (11), 2782-2790 (1997).
  12. Bonder, C. S., et al. Essential role for neutrophil recruitment to the liver in concanavalin A-induced hepatitis. J Immunol. 172 (1), 45-53 (2004).
  13. Xu, C., Zipfel, W., Shear, J. B., Williams, R. M., Webb, W. W. Multiphoton fluorescence excitation: new spectral windows for biological nonlinear microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (20), 10763-10768 (1996).
  14. Centonze, V. E., White, J. G. Multiphoton excitation provides optical sections from deeper within scattering specimens than confocal imaging. Biophys J. 75 (4), 2015-2024 (1998).
  15. Amore, J. D., et al. In vivo multiphoton imaging of a transgenic mouse model of Alzheimer disease reveals marked thioflavine-S-associated alterations in neurite trajectories. J Neuropathol Exp Neurol. 62 (2), 137-145 (2003).
  16. Hickey, M. J., Westhorpe, C. L. V. Imaging inflammatory leukocyte recruitment in kidney, lung and liver--challenges to the multi-step paradigm. Immunol Cell Biol. 91 (4), 281-289 (2013).
  17. McLellan, M. E., Kajdasz, S. T., Hyman, B. T., Bacskai, B. J. In vivo imaging of reactive oxygen species specifically associated with thioflavine S-positive amyloid plaques by multiphoton microscopy. J Neurosci. 23 (6), 2212-2217 (2003).
  18. Geissmann, F., et al. Intravascular Immune Surveillance by CXCR6+ NKT Cells Patrolling Liver Sinusoids. PLoS Biology. 3 (4), (2005).
  19. Velázquez, P., et al. Cutting edge: activation by innate cytokines or microbial antigens can cause arrest of natural killer T cell patrolling of liver sinusoids. J Immunol. 180 (4), 2024-2028 (2008).
  20. Wehr, A., et al. Chemokine receptor CXCR6-dependent hepatic NK T Cell accumulation promotes inflammation and liver fibrosis. J Immunol. 190 (10), 5226-5236 (2013).
  21. Khandoga, A., Hanschen, M., Kessler, J. S., Krombach, F. CD4+ T cells contribute to postischemic liver injury in mice by interacting with sinusoidal endothelium and platelets. Hepatology. 43 (2), 306-315 (2006).
  22. Egen, J. G., et al. Macrophage and T cell dynamics during the development and disintegration of mycobacterial granulomas. Immunity. 28 (2), 271-284 (2008).
  23. Beattie, L., et al. Leishmania donovani-induced expression of signal regulatory protein alpha on Kupffer cells enhances hepatic invariant NKT-cell activation. Eur J Immunol. 40 (1), 117-123 (2010).
  24. Beattie, L., et al. Dynamic imaging of experimental Leishmania donovani-induced hepatic granulomas detects Kupffer cell-restricted antigen presentation to antigen-specific CD8 T cells. PLoS Pathog. 6 (3), e1000805(2010).
  25. McDonald, B., et al. Intravascular danger signals guide neutrophils to sites of sterile inflammation. Science. 330 (6002), 362-366 (2010).
  26. Vanheule, E., et al. An intravital microscopic study of the hepatic microcirculation in cirrhotic mice models: relationship between fibrosis and angiogenesis. Int J Exp Pathol. 89 (6), 419-432 (2008).
  27. Jenne, C. N., Kubes, P. Immune surveillance by the liver. Nat Immunol. 14 (10), 996-1006 (2013).
  28. Zimmermann, H. W., Tacke, F. Modification of chemokine pathways and immune cell infiltration as a novel therapeutic approach in liver inflammation and fibrosis. Inflamm Allergy Drug Targets. 10 (6), 509-536 (2011).
  29. Kim, J. V., et al. Two-photon laser scanning microscopy imaging of intact spinal cord and cerebral cortex reveals requirement for CXCR6 and neuroinflammation in immune cell infiltration of cortical injury sites. J Immunol Methods. 352 (1-2), 89-100 (2010).
  30. Karlmark, K. R., et al. Hepatic recruitment of the inflammatory Gr1+ monocyte subset upon liver injury promotes hepatic fibrosis. Hepatology. 50 (1), 261-274 (2009).
  31. Heymann, F., et al. Hepatic macrophage migration and differentiation critical for liver fibrosis is mediated by the chemokine receptor C-C motif chemokine receptor 8 in mice. Hepatology. 55 (3), 898-909 (2012).
  32. Ramachandran, P., et al. Differential Ly-6C expression identifies the recruited macrophage phenotype, which orchestrates the regression of murine liver fibrosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (46), E3186-E3195 (2012).
  33. Moles, A., et al. A TLR2/S100A9/CXCL-2 signaling network is necessary for neutrophil recruitment in acute and chronic liver injury in the mouse. J Hepatol. 60 (4), 782-791 (2014).
  34. Hammerich, L., et al. Chemokine receptor CCR6-dependent accumulation of γδ T cells in injured liver restricts hepatic inflammation and fibrosis. Hepatology. 59 (2), 630-642 (2014).
  35. Syn, W. -K., et al. NKT-associated hedgehog and osteopontin drive fibrogenesis in non-alcoholic fatty liver disease. Gut. 61 (9), 1323-1329 (2012).
  36. McDonald, B., et al. Interaction of CD44 and hyaluronan is the dominant mechanism for neutrophil sequestration in inflamed liver sinusoids. J Exp Med. 205 (4), 915-927 (2008).
  37. Egen, J. G., et al. Intravital imaging reveals limited antigen presentation and T cell effector function in mycobacterial granulomas. Immunity. 34 (5), 807-819 (2011).
  38. Singer, G., Stokes, K. Y., Granger, D. N. Hepatic microcirculation in murine sepsis: role of lymphocytes. Pediatr Surg Int. 24 (1), 13-20 (2008).
  39. Phillipson, M., Kubes, P. The neutrophil in vascular inflammation. Nat Med. 17 (11), 1381-1390 (2011).
  40. Khandoga, A. G., et al. In vivo imaging and quantitative analysis of leukocyte directional migration and polarization in inflamed tissue. PLoS One. 4 (3), e4693(2009).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Intravital MicroscopyMultiphoton MicroscopyLiver ImagingCXCR6 Gfp MiceLeukocyte MigrationCell Cell InteractionsLong Term ImagingTissue StabilizationVital Parameter MonitoringLaser Scanning Microscopy

מאמרים קשורים