בינוני אוויר עצם: הכנה ומבדק

סיכום

אנו מתארים כאן כיצד להכין מדיום מיזוג עצם (BCM) ולבדוק את פעילותו במבחנה.

תקציר

שתלי עצם אוטולוגית נמצאים בשימוש נרחב בניתוח, אורתופדיה, וtraumatology פה והלסתות. שתלי עצם אוטולוגית לא רק להחליף עצם חסר, הם גם תומכים בתהליך המורכב של התחדשות עצם. התנהגות חיובית זו של autografts מיוחסת לשלושה מאפיינים: osteoconductivity, osteogenicity, וosteoinductivity. עם זאת, יש היבט נוסף: העצם שתל לשחרר מספר עצום של מולקולות, כולל גורמי גדילה, אשר יכול למקד תאי mesenchymal המעורבים בהתחדשות עצם. המאפיינים אוטוקריני של שתלי עצם ניתן ללמוד במבחנה על ידי השימוש במדיום מיזוג עצם (BCM). כאן אנו מציגים פרוטוקול על איך להכין מדיום מיזוג עצם מעצם קליפת המוח חזיר ילידים, ועצם שעבר תהליך עיבוד או איבוד מינרלים תרמיים. תאים יכולים להיות חשופים ישירות לBCM או זורעים על ביו-חומרים, כגון ממברנות קולגן, ספוג בעבר עם BCM. אנחנו נותנים דוגמאות במבחנת bioassaי"ש עם תאי mesenchymal בביטוי של גנים מוסדרים TGF-β. הפרוטוקולים שהוצגו לעודד לחשוף עוד יותר את ההשפעות אוטוקריני של שתלי עצם במהלך התחדשות עצם ולפתוח נתיב למחקר translational בתחום הרחב של ניתוח שחזור.

מבוא

עצם אוטולוגית נעשה שימוש נרחב לגשר פגמים שנפלו כתוצאה ממום, ניתוח resective, ניתוח שחזור טראומה, ולפני מיקום שתל ^1,2. הבנת העקרונות הביולוגיים של כמה תלי עצם לתמוך בתהליך של איחוד שתל היא לא מפתח היחיד להבין מדוע autografts נחשב סטנדרטי בניתוח שחזור הזהב, הוא גם יונית לעיצוב המשופר של תחליפי עצם ^3. ובכל זאת, איחוד שתל הוא מהיר יותר עם ​​עצם אוטולוגית לעומת עצם תחליפי ^4,5. לפיכך, הוא הכרחי כדי לחשוף את המנגנונים המולקולריים ותאיים שגורמים עצם אוטולוגית כל כך יעיל לתמיכה בהתחדשות עצם.

ישנם שלושה מאפייני ספר לימוד של autografts שנחשבים לתמיכה בתהליך האיחוד ^6,7. העצם ראשון, אוטולוגית הוא osteoconductive, מתן הדרכה לעצם החדש שנוצר לגדוללפגם. שנית, עצם אוטולוגית הוא osteogenic, כלומר הוא מכיל תאי mesenchymal שיכול להתמיין לosteoblasts ^8. עצם שלישי, אוטולוגית הוא osteoinductive כגורמי גדילה כמו חלבוני המוךפו"גנטי העצם קבורים במטריצה ​​יכולים להתחיל בתהליך של endochondral או אפילו יצירת עצם intramembranous ^9. יש היבט נוסף: שבבי עצם מוכנים טרי להחזיק פונקציה אוטוקריני מבוססת על התצפיות במבחנה עם "בינוני מותנה עצם" ^10-15. גם את ההשפעה של myelopoiesis יצוין ^16. טווח דומה "בינוני עצם demineralized מיזוג מטריצה" כבר נטבע בשנת 1996 ותומך ברעיון הכללי של פונקציה אוטוקריני של עצם, גם כאשר מעובד על ידי איבוד מינרלים ^17. למטרות שלנו, BCM יכול להיות מוכן מחזיר טרי לסתות ^10,11. ניתוחי proteomic של BCM חשפו את ההרכב המורכב, הכוללים למעשה צמיחהORS ומרכיבים של מטריקס ^10, גם הרחבת ידע הקיים בפרוטאזום של כל עצם ^18,19. לפיכך, BCM צריך לשקף את הפעילות המסחרית של שינויים שונים של שתלי עצם במבחנה.

מה קורה כאשר תאי mesenchymal, למשל אלה מבודדים משבבי עצם או מרקמות רכות בעל פה, נחשפים לBCM? במבחנה, BCM מפחית osteogenic ובידול adipogenic, ומעורר עלייה חזקה של ביטוי IL11 ^11. הגנום microarray הרחב גילה גנים רבים יותר לבוא לידי ביטוי באופן דיפרנציאלי בתאי mesenchymal בתגובה לBCM. בין הגנים הללו adrenomedullin (ADM) הם, IL11, IL33, מונואמין NADPH 4 (NOX4), פרוטאו 4 (PRG4, או lubricin) וpentraxin 3 (PTX3) ^15. BCM מתקבל משבבי עצם autoclaved לא הצליח לשנות את הביטוי של גנים בהתאמה ^14. BCM משבבי עצם שעברו פסטור והקפאה היה מסוגללשנות ביטוי גני ^14. בינוני גם מותנה של מטריצת demineralized עצם (DBM-CM) משנה את הביטוי של TGF-β-מוסדרת גנים ^20. מעניין לציין, קרומי מחסום קולגן משמשים להגן על שבבי עצם מהרקמות הרכות סביב ^21,22, נספחים אותם חלקים של BCM שאחראים לשינויים בביטוי הגנים ^23. מחקר BCM יכול להתארך עד סוגי תאים אחרים מעורבים בהתחדשות עצם כגון osteoclasts resorbing-עצם ותאי האנדותל, עד כמה שם. בסך הכל, במבחנה נתוני צבירה לספק את הבסיס המדעי לעיצובו של מחקר פרה-קליני.

הפרוטוקול הנוכחי הוא כפול: ראשית, הוא מראה כיצד להכין BCM. שנית, הוא מראה איך לבדוק הפעילות הביולוגית שלה מבוסס על תאי mesenchymal במבחנה.

פרוטוקול

1. הכנת BCM

1. להשיג לסתות חזיר מהקצב המקומי הטרי ככל האפשר. מניחים את הלסתות על משטח יציב ולשחרר דש בעובי מלא תשומת לב מיוחדת שלא להשאיר את כל רקמה רכה או periosteum מצורף לעצם. לעבוד בסביבה נקייה ללא הצורך לעבוד תחת מכסה המנוע הזרימה.
2. ברגע שדש בעובי מלא הוא שוחרר, להשתמש מגרד עצם לקצור את שבבי עצם מהצד הלחי. שים לב שמגרד העצם צריך להיות חד. ידית בחוזקה מגרד העצם ועם תנועות ארוכות לאסוף את העצם. בטל שבבי עצם קטנים יותר 1 מ"מ ש.
   1. כדי לשמור על שבבי עצם ילידים, למקם ישירות שבבי העצם בצלחות פלסטיק של 10 ס"מ קוטר עם המדיום של הנשר השתנה Dulbecco (DMEM) בתוספת אנטיביוטיקה 1% וantimycotics לא לתת להם להתייבש.
   2. כדי להעריך את ההשפעה של עיבוד תרמי, שבבי עצם כפופים לפסטור למשך 30 דקות ב 80 מעלות צלזיוס אוהחיטוי במשך 20 דקות ב 121 מעלות צלזיוס.
   3. כדי להעריך את ההשפעה של איבוד מינרלים, לנער שבבי עצם ב 1 M HCL במשך 4-6 שעות על 4 מעלות צלזיוס ולשטוף שוב ושוב עם מדיום התרבות עד pH ניטראלי.
3. הנח כולל של 5 גרם של שבבי עצם לDMEM הטרי 10 מיליליטר בתוספת אנטיביוטיקה 1% וantimycotics לתוך צלחת פלסטיק חדשה.
4. מניחים את צלחות פלסטיק באווירת humidified על 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות. לאחר מכן, BCM קציר. צנטריפוגה BCM ב XG 200 במשך 10 דקות כדי להסיר שאריות, לסנן אותה (ננומטר 0.2) סטרילי, ולשמור aliquots הקפוא ב -80 ° C.
5. להפשיר את מניית BCM מייד לפני השימוש ולהימנע ממחזורים חוזרים ונשנים של הקפאה והפשרה.
6. בניסויים שצוינו, לספוג קרומי קולגן עם מדיום BCM או סרום ללא עבור שעה 1 ב RT. לשטוף במרץ הקרומים עם PBS ולהכניס אותם לתוך 96 צלחות גם. קרומים רטובים הם זורעים עם תאים.
7. תהליך הכנת BCM מסוכם באיור 1.

2. bioassays המבוסס על תאי mesenchymal

1. תאי זרע אנושיים mesenchymal (לדוגמא תאי עצם, חניכיים ופיברובלסטים רצועת חניכיים) לתוך צלחת 12 גם עם ריכוז של 30,000 תאים / ² סנטימטר. זרע התאים להשתמש מדיום גידול בהיקף של DMEM, 10% בסרום עגל עוברי ואנטיביוטיקה. בואו התאים לצרף N / O הצלחת.
2. מחק את מדיום התרבות לשטוף את התאים עם PBS מראש חימם על 37 מעלות צלזיוס. לעורר את התאים על ידי הוספת תרבות בינוני סרום ללא מחוממת מראש עם ובלי BCM 20%. מניחים את התאים באווירת humidified על 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות.
3. מחק את מדיום התרבות, לשטוף את התאים עם PBS מראש חימם ולחלץ את RNA על פי הפרוטוקול המועדף עליך.
4. התאם את הריכוז של רנ"א כדי שתהיה לה הכמות של RNA בכל דגימה. הכן cDNAs ולבצע qRT-PCR לנתח את הגנים שנבחרו באמצעות פריימרים מוצגים בטבלה 1.
   הערה: אלה הם דילולים של כל רכיב: 2x SYBR הירוק, 20x פריימר קדימה, 20x הפוך פריימר, מים DD סטרילי 5x, 5x cDNA. QRT-PCR מתבצע ב40 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס 15 שניות ו -60 מעלות צלזיוס 1 דק '.
5. לחשב את רמות הביטוי היחסית על ידי נרמול לGAPDH גן המשק בשיטת Δ (ΔCt) בי ΔCT היא יעד CT - CT GAPDH וΔ (ΔCT) הוא ΔCT המגורה - ΔCT שליטה.
6. לאחר בקרת איכות זו, להוסיף BCM למדיום תרבות כדי לעורר את כל סוגי תאים, כולל תאי mesenchymal, תאי hematopoietic או תאי האנדותל.

תוצאות

בינוני אוויר עצם מוכן משבבי עצם חזירי טריים. סקירה כללית של התהליך להכנת BCM ולהשתמש בביו-חומרים בשילוב עם BCM מוצגת באיור 1 ואיור 2 בהתאמה. במהלך הכנת BCM, חשוב להשיג שבבי עצם גדולים עם תנועות ארוכות כתנועות קצרות או שבבי עצם קטנים מאוד יכול להשפיע על האיכות של BCM הסופי. איכות של BCM יכולה להיות נשלטה על ידי ניתוח ביטוי גנים של גני מטרת BCM: ADM, PTX3, IL11, IL33, NOX4 וPRG4 (איור 3). ADM וPTX3 מוסדרים מטה-מטה ל -0.4 פי וIL11, IL33, NOX4 וPRG4 י...

דיון

בינוני-מותנה עצם משקף את הפעילות המסחרית של שתלי עצם בשלבים המוקדמים של התחדשות עצם השלבים. הפרוטוקול המתואר כאן ניתן להתאים ללמוד את תגובת סוגים שונים של תאים מעורבים בהתחדשות עצם של. יתר על כן, הפרוטוקול יכול לשמש כדי להכין מדיום מותנה ממילוי עצם או עצם מעובד. השיטות קלים לביצוע ומסתמך על רעיון פשוט: הגורמים שוחררו מעצם ילידי מעובד ושונים. ההבנה כיצד BCM משפיעה על תאי mesenchymal יכולים לעזור כדי ללמוד עוד על איחוד שתל ומאפיינים של autografts עצם. בהתבסס על תפיסה זו שצברנו ידע ע...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
לסת תחתונה	חזיר מגרד
		PPBUSE2/36
אנטיביוטיקה & Antimicotics	All Life Technologies	15240-062
ממברנות קולגן (Bio-Gide)	Geistlich
סרום עגל עוברי	Invitrogen Corporation	16030074
DMEM	Invitrogen Corporation	21885-025
ערכת בידוד RNA טהורה גבוהה	Roche	11828665001
Transcriptor First ערכת סינתזה של Strand cDNA
	Roche Microsynth
SYBR Green (עבור Q-RT-PCR)	Roche	4673484001
PBS	Roche	11666789001