מאמר שיטה

שיטה למדידת הפעילות של אנזימי Deubiquitinating בשורות תאים ודגימות רקמה

DOI:

10.3791/52784

⸱

10 במאי 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neuroscience, University of Minnesota, 2Institute for Translational Neuroscience, University of Minnesota, 3Department of Obstetrics, Gynecology, and Women’s Heath, University of Minnesota, 4Masonic Cancer Center, University of Minnesota

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול הנוכחי מפרט שיטה למדידת הפעילות של אנזימים תפקודי הומולוגי deubiquitinating. בדיקות מיוחדות קוולנטית לשנות את האנזים ולאפשר לגילוי. שיטה זו מחזיקה את הפוטנציאל לזהות מטרות טיפוליות חדשות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לאחרונה מערכת היוביקוויטין-פרוטאזום הייתה מעורבת בפתולוגיות שונות כולל מחלות ניווניות וסרטן. לאור זאת, טכניקות ללימוד מנגנון הרגולציה של מערכת זו הן חיוניות להבהרת התהליכים התאיים ומולקולריים של המחלות הנ"ל. השימוש בבדיקות היוביקוויטין hemagglutinin נגזר המתוארות במאמר זה משמש ככלי רב ערך למחקר של מערכת זו. מאמר זה מפרט שיטה המאפשרת למשתמש לבצע מבחני שנותנים להדמיה ישירה של deubiquitinating פעילות אנזים. אנזימי Deubiquitinating לשלוט השפלה proteasomal ולשתף הומולוגיה פונקציונלית באתרים הפעילים שלהם, המאפשר למשתמש לחקור את הפעילות של אנזימים רבים בassay אחד. מתקבל lysates דרך הפרעה תא מכאנית עדינה וטופחו עם בדיקות מכוונות אתר פעיל. אנזימים פונקציונליים מתויגים עם הבדיקות תוך אנזימים פעילים יישארו מאוגד. על ידי הפעלהנינג assay זה, המשתמש מקבל את המידע משני הפעילות וביטוי פוטנציאל של אנזימי deubiquitinating מרובים באופן מהיר וקל. השיטה הנוכחית היא באופן משמעותי יעילה יותר באמצעות נוגדני פרט למאה האנזימים deubiquitinating חזו בתא האנושי.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מערכת היוביקוויטין-פרוטאזום (UPS) משמשת כאחד ממסלולי השפלה המרכזיים בתא היונקים. מצעים מחויבים לפירוק בפרוטאזום מתויגים קוולנטית עם פולימרים של היוביקוויטין (UB) 1. לפני המצע הממוקד נכנס לפרוטאזום לשפלה, יש להסיר את תג פולי-יוביקוויטין. כיתה של אנזימים המכונים deubiquitinating אנזימים (dubs) אחראית לפינוי והמיחזור של מולקולות יוביקוויטין 2. זה כבר חזה מהגנום האנושי שיש כמעט מאה ממכן עובד בתא 3. עם מספר כה גדול של ממכן שליטה תהליכים תאיים בתיווך UB, לומד אנזימים אלה מציב אתגר מאז טכניקות mRNA לא נותנים מידע על פעילות ומערבית סופג רק נותן מידע על רמות ביטוי.

השימוש בhemagglutinin השפעת (HA) מתויג, UB-נגזר בדיקות אתר מכוונות פעילים מאפשר לmod קוולנטייםification של ממכן הפונקציונלי ולכן נותן להדמיה ישירה של הפעילות של אנזימים אלה על כתם מערבי 4. יש בדיקות קבוצה תגובתי תיאול C-מסוף המשמשת כמצע להתאבדות שאריות ציסטאין אתר הפעיל 5. עם בדיקות אלה, ניתן ללמוד את הפעילות וביטוי פוטנציאל של ממכן רבים תחת שני מצבים פתולוגיים ופיסיולוגיים של התא.

שינויים בפעילות DUB היו מעורבים במגוון של מצבים פתולוגיים כגון פרקינסון, אלצהיימר, אנמיה וסוגי סרטן שונים 6-10. טכניקה זו מספקת כלי רב עוצמה לחקר המחלה. בעבודה הנוכחית, אנו מציגים את היישום של טכניקה זו בתאי הלה וM17 שכבר lysed באמצעות חרוזים זכוכית. בנוסף, אנו מתארים כיצד להשתמש בשיטה זו בדגימות רקמת חוט השדרה עכבר. המידע שהתקבל מטכניקה זו יכול לשמש כנקודת פתיחה לזיהוימטרות טיפוליות, כמו גם דגמי ההקמה לחקר תנאי מחלה שונים. השירות האמיתי של טכניקה זו הוא ביכולתה לספק מידע על ממכן מרובה בassay אחד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. תמוגה הצפת הכנה

  1. לפזר סוכרוז במים ללא יונים (DI) כדי להפוך את פתרון מניות 2 M. סנן פתרון 2 M של סוכרוז באמצעות ואקום מונע 0.22 מיקרומטר פלואוריד polyvinylidene מסנן (PVDF).
  2. לפזר dithiothreitol (DTT) במי DI לעשות פתרון 500 מ"מ מניות וחנות בתנאים אנאירוביים. לפזר מגנזיום כלוריד (MgCl 2) במי DI לעשות פתרון מניות 100 מ"מ. לפזר אדנוזין טריפוספט disodium מימה (ATP) במי DI לעשות פתרון מניות 50 מ"מ.
  3. איפור פתרון טריס בpH 7.4 ידי המסת hydrochloride Trizma במי DI והתאמת pH באמצעות נתרן הידרוקסידי (NaOH).
  4. לשלב חלקים מפתרונות המניות במים די כדי להפוך את מאגר תמוגה עם ריכוז סוכרוז של 250 מ"מ, ריכוז DTT של 1 מ"מ, MgCl 2 ריכוז של 5 מ"מ, ריכוז ה- ATP של 1 מ"מ וריכוז טריס של 50 מ"מ . לדוגמא, לערבב 535.3 μl של טריס, 500 μl של MgCl 2, 1.25 מיליליטר של סוכרוז, 20 μl של DTT, 200 μl של ה- ATP ו7.4947 מיליליטר של מים די כדי להפוך את 10 מיליליטר של חיץ תמוגה. זה יכול לשמש לכ -20 ניסויים.

2. תאים culturing לניסוי

  1. להפוך את התקשורת על ידי aliquoting 30 מיליליטר של DMEM + 10% בסרום שור עוברי (FBS) לצינור חרוטי 50 מיליליטר.
  2. העבר את תאי M17 או הלה קפוא מאחסון חנקן נוזלי לכוס קטנה עם מים פושרים.
  3. להעביר את תאי צינור חרוטי 50 מיליליטר. ראשית, להוסיף קצת תקשורת לבקבוקון התא. לאחר מכן להעביר את תאי resuspended בתוך 5 שניות של הפשרה.
  4. צנטריפוגה ההשעיה התא ב 450 XG במשך 5 דקות כדי לקבל תא גלולה. הוסף 20 מיליליטר של תקשורת לתוך בקבוק T75.
  5. הסר את המדיה מהתאים באמצעות יניקה. הוסף 5 מיליליטר של תקשורת טריות לתא גלולה וגלול.
  6. מעבירים את ההשעיה התא 5 מיליליטר ל -20 מיליליטר של תקשורת בבקבוק T75 ולדגור על 37 מעלות צלזיוס. ChAnge התקשורת בכל 3 ימים.

קציר 3. סלולארי

  1. הסר את המדיה באמצעות יניקה, נזהר שלא לגעת בתאים.
  2. לשטוף את התאים עם 5 מיליליטר של תמיסת מלח שנאגרו פוספט (PBS). הסר PBS באמצעות יניקה.
  3. להוסיף 3 מיליליטר של חומצת טריפסין-ethylenediaminetetraacetic (EDTA) לבקבוק T75 ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות.
  4. הוסף 6 מיליליטר של תקשורת טריות לבקבוק וresuspend התאים.
  5. מעבירים את ההשעיה לצינור חרוטי 15 מיליליטר ו צנטריפוגות ב 290 × גרם במשך 5 דקות.
  6. הסר את supernatant ולהוסיף 5 מיליליטר של PBS. לטפוח בעדינות את החלק התחתון של הצינור כדי לשבור את גלולה. צנטריפוגה ב 290 XG במשך 5 דקות.
  7. חזור על שלב 3.6 שלוש פעמים.
  8. הסר PBS וresuspend התאים 1 מיליליטר של PBS הטרי. העברה לצינור Eppendorf (1.5 מיליליטר). ספין ב290 XG במשך 5 דקות.

4. תא תמוגה

  1. מדוד את הנפח המשוער של גלולה באמצעות פיפטהd לשקול את חרוזי זכוכית במסה: יחס נפח של 1: 1. להוסיף פעמיים הנפח של גלולה במאגר תמוגה.
    הערה: להוסיף למאגר לפני הוספת חרוזי הזכוכית.
  2. Lyse התאים בצינור Eppendorf בתסיסה המרבית למשך 30 דקות ב 4 ° C על ידי vortexing בחדר קר.
  3. בקצרה צנטריפוגות ב XG 200 במשך 30 שניות כדי ליישב את חרוזים. לאסוף את supernatant.
  4. להוסיף את אותו הנפח של חרוזי זכוכית כמו קודם לsupernatant.
  5. מערבולת שוב בתסיסה המרבית למשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
  6. בקצרה צנטריפוגות ב XG 200 במשך 30 שניות כדי ליישב את חרוזי הזכוכית. לאסוף את supernatant.
  7. צנטריפוגה ב 5,030 XG במשך 5 דקות כדי להסיר את הגרעינים, וקרומי תאים רצופים. לאסוף את supernatant, המהווה את lysate התא.

Homogenization 5. רקמות

  1. הפוך המוני: נפח של 1: 9 פתרון של רקמת חוט השדרה עכבר למאגר תמוגה.
    הערה: שיטה זו ישימה למגוון שונהדגימות רקמה אף אוזן גרון.
  2. Homogenize הרקמות באמצעות הגדרה של רמה 2 על homogenizer למשך 30 שניות כדי לוודא שאין גושים שנותרו.
  3. ספין למטה ב5,030 XG במשך 3 דקות כדי להסיר את הגרעינים, וקרומי תאים רצופים.
  4. לאסוף את supernatant, המהווה את lysate.

Derivatization 6. לדוגמא

  1. בצע חומצת bicinchoninic (BCA) בניתוח צלחת 96-היטב כדי לקבוע את ריכוז החלבון של lysate הרקמות באמצעות קורא צלחת 96-היטב colorimetric כמפורט בפרוטוקול ערכת assay חלבון BCA פירס.
  2. להביא aliquot המתאים עד 20 מיקרוגרם של חלבון הכולל 50 μl באמצעות מים מיוננים דה (DI).
  3. הוסף 2 μl של 1.35 מיקרומטר של sulfone HA-UB-ויניל (VS) לפתרון דגירה עבור שעה 1 על 37 מעלות צלזיוס. התוצאה 20 מיקרוגרם של lysate 50 ננומטר של בדיקה בתערובת התגובה הסופית. זה בעודף טוחנת גדול כדי להבטיח תיוג של ממכן פונקציונלי.
  4. אניncubate המדגם במאגר המדגם של Laemmli במשך 5 דקות על 95 מעלות צלזיוס. לתגובת שימוש נפח 52 μl 26 μl של חיץ מדגם 2x, 13 μl של חיץ מדגם 4x או 8.87 μl של חיץ מדגם 6x.
  5. מגניב על קרח לפני טעינת ג'ל.

7. מערבי כתם

  1. לטעון 4-20% ג'ל טריס-גליצין 12 גם עם 40 μl של המדגם מוכן
  2. הפעל את הג'ל על 95 V עד חזית היון מגיעה לתחתית.
  3. לבצע העברת לילה של הג'ל על קרום difluoride polyvinylidene (PVDF).
  4. דגירה הקרום בכתם השחור amido ולסרוק membane לקבל תמונה המציגה את כמות החלבון בכל מסלול.
  5. Destain קרום דגירה ב 5% בחלב PBS עבור שעה 1 לחסום.
  6. דגירה הקרום בנוגדן אנטי HA העיקרי בריכוז של 1: 10,000 בחלב 5% ב PBS או לילה ב 4 מעלות צלזיוס או במשך 4 שעות בטמפרטורת חדר.
  7. בצע 3 שוטף Fאו 5 דקות כל אחד בPBS עם 0.1% אבקת Tween-20.
  8. דגירה הקרום בperoxidase חזרת עכבר בריכוז של 1: 10,000 בחלב 5% ב PBS לפחות 2 שעות.
  9. בצע 3 שוטף במשך 5 דקות כל אחד בPBS עם 0.1% אבקת Tween-20.
  10. לבצע שטיפה 1 למשך 5 דקות בPBS.
  11. דגירה הקרום במגיב איתור chemiluminescent במשך 10 דקות ולזהות באמצעות גלאי chemiluminescent. השתמש בחשיפה האוטומטית הגדרה בגלאי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי M17 והלה תרבותיים נקצרו בשיטה מפורטת ב( קציר Cell 3.) פרוטוקול ורקמת חוט השדרה עכבר הושגה. תא גלולה / רקמת חוט השדרה הוצבה בצינור עם חיץ תמוגה המתואר בסעיף הכנת מגיב. כדורי תא היו lysed באמצעות חרוזים זכוכית (איור 1 א) ודגימות רקמת חוט השדרה עכבר היו הומוגני באמצעות homogenizer (איור 1). לאחר תמוגה או הומוגניות, המדגם centrifuged אז ב5,030 XG להסיר את חרוזי זכוכית ו / או קרומים רצופים ואברונים (איור 2). שתי שיטות אלה הם אמצעים...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאז ubiquitination היא פעילות סלולרית בסיסית, הבנת מנגנוני הרגולציה יכולה להיות המפתח לחושף את תהליכי המחלה ופתולוגיה. השימוש בHA מתויג בדיקות אתר מכוונות פעילים נגזרות UB דיווחו כאן מספקת שיטה קלה, אבל זה אפשרי מאוד ללימוד פירוק חלבונים בתיווך UB. שיטה זו היא מהירה יותר וזול יותר מאשר לימוד כל אחד מממכן בנפרד.

בשיטה זו, תמוגה של התאים מושגת באמצעים מכאניים - באמצעות חרוזי הזכוכית. שיטה עדינה זה של תמוגה שומרת תמ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יש המחברים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ברצוננו להודות למעבדה שלי באוניברסיטת מינסוטה למתן דגימות רקמת חוט השדרה העכבר שהיו בשימוש. עבודה זו נתמכה על ידי המחלקה לתכנית ביטחון סרטן השחלות מחקר (OCRP) OC093424 לMB, על ידי חקר הסרטן וקהילה קרן רנדי מכונת גילוח לMB ועל ידי השחלות ברית סרטן מינסוטה (MOCA) לMB. היו הממנים לא היה תפקיד בעיצוב מחקר, איסוף נתונים וניתוח, החלטה לפרסם או הכנת כתב היד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
PowerGen 125 (הומוגנייזר)Fischer Scientific14-261-02P
מסננים מונעי ואקום 0.22 ומיקרו; mBPV2210
חרוזי זכוכית, שטופים בחומצה ו-le; 106 ומיקרו; m (~140 מסננת ארה"ב)סיגמא-אולדריץ'G4649-10G
סוכרוזפישר סיינטיפיקS6-212
DL-דיתיותרייטולסיגמא-אולדריץ'D0632
מגנזיום כלורידסיגמא-אולדריץ'M8266
אדנוזין 5'-טריפוספט מלח דיסודיום הידרטסיגמא-אולדריץ'A26209
טריזמה הידרוכלורידSigma-AldrichT3253
Modified Eagle MediumLife Technologies11965-092
פוספט חוצץמלח Life Technologies10010-023
בקבוק תרבית רקמות 75 ס"מ2 עם פילטר 250 מ"ל 120/csCellstarT-3001-2
0.05% Trypsin-EDTA (1x)Life Technologies25300-054
HI FBSLife Technologies16140-071
נוגדן חד-שבטי נגד HA המיוצר בעכברSigma-AldrichH9658
יוביקוויטין ויניל סולפון (HA-tag)Enzo Life SciencesBML-UW0155-0025
מאגר דגימת SDS של Laemמלי (פי 4, מפחית)Boston BioProductsBP-110R
פירס BCA חלבון ערכת בדיקהThermo Scientific23225
של Dulbecco

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ovaa, H., Kessler, B. M., Rolén, U., Galardy, P. J., Ploegh, H. L., Masucci, M. G. Activity- based ubiquitin-specific (USP) profiling of virus-infected and malignant human cells. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (8), 2253-2258 (2004).
  2. Wilkinson, K. D. Ubiquitination and deubiquitination: Targeting of proteins for degradation by the proteasome. Semin Cell Dev Biol. 11 (3), 141-148 (2000).
  3. Ziad, M. E., Wilkinson, K. D. Regulation of proteolysis by human deubiquitinating enzymes. Biochim Biophys Acta. 1843 (1), 114-128 (2014).
  4. Rolén, U., et al. Activity Profiling of Deubiquitinating Enzymes in Cervical Carcinoma Biopsies and Cell Lines. Mol Carcinog. 45 (4), 260-269 (2006).
  5. Borodovsky, A., et al. Chemistry-Based Functional Proteomics Reveals Novel Members of the Deubiquitinating Enzyme Family. Chem Biol. 9 (10), 1149-1159 (2002).
  6. Andersson, F. L., et al. The effect of Parkinson’s-disease-associated mutations on the deubiquitinating enzyme UCH-L1. J Mol Biol. 407 (2), 261-272 (2011).
  7. Poon, W. W., et al. β-Amyloid (Aβ) oligomers impair brain-derived neurotrophic factor retrograde trafficking by down-regulating ubiquitin C-terminal hydrolase UCH-L1. J Biol Chem. 288 (23), 16937-16948 (2013).
  8. Nijman, S. M., et al. The deubiquitinating enzyme USP1 regulates the Fanconi anemia pathway. Mol Cell. 17 (3), 331-339 (2005).
  9. Stevenson, L. F., Sparks, A., Allende-Vega, N., Xirodimas, D. P., Lane, D. P., Saville, M. K. The deubiquitinating enzyme USP2a regulates the p53 pathway by targeting Mdm2. EMBO J. 26 (4), 976-986 (2007).
  10. Coughlin, K., et al. Small-molecule RA-9 inhibits proteasome-associated DUBs and ovarian cancer in vitro and in vivo via exacerbating unfolded protein responses. Clin Cancer Res. 20 (12), 3174-3186 (2014).
  11. Colla, E., et al. Endoplasmic Reticulum Stress Is Important for the Manifestations of α-Synucleinopathy In. Vivo. J Neurosci. 32 (10), 3306-3320 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

HAWestern BlotPVDF

מאמרים קשורים