לומד סרטן לבלב גזע מאפייני תא לפיתוח טיפול חדש אסטרטגיות

סיכום

ניתן להרחיב תאי גזע של סרטן הלבלב (CSCs) במבחנה באמצעות טכניקת תרבית כדור בלתי תלויה בעיגון, המייצגת כלי רב עוצמה לחקר הביולוגיה של CSC ויכולה לשמש כצעד ראשון לפיתוח טיפולים חדשניים ממוקדי CSC. כאן ניתנת המתודולוגיה להרחבה, ניתוח ומיקוד של CSCs בלבלב.

תקציר

אדנוקרצינומה ductal לבלב (PDAC) מכילה תת-קבוצה של תאים סרטניים באופן בלעדי גזע סרטני (CSCS) אשר הוכחו לנהוג ייזום גידול, גרורות והתנגדות לradio- וכימותרפיה. כאן אנו מתארים מתודולוגיה ספציפית לculturing CSCS לבלב האנושי ראשוני כתחומי גידול בתנאי מעגן-עצמאי. תאים גדלים בתנאים שאינם חסיד סרום ללא כדי להעשיר לCSCS תוך progenies המובחן יותר שלהם אינו שורד ומתרבה בשלב הראשוני לאחר זריעה של תאים בודדים. assay זה יכול לשמש כדי להעריך את אחוז CSCS הנוכחי באוכלוסייה של תאים סרטניים. שני הגודל (אשר יכול לנוע 35-250 מיקרומטר) ומספר תחומים גידול שנוצרו מייצגים פעילות CSC טיפחה בשני אוכלוסיות בתפזורת של תאים סרטניים בתרבית או גידולים טריים שנקטפו ומתעכלים ^1,2. שימוש assay זה, מצאנו לאחרונה כי מטפורמין סלקטיבי ablates pancreatCSCS IC; ממצא זה אומת לאחר מכן נוסף על ידי הוכחת ביטוי מצומצם של גנים / סמני משטח הקשורים pluripotency ומופחת בtumorigenicity vivo של תאים שטופל במטפורמין. כצעד הסופי לפיתוח פרה-קליני שטופלנו עכברי נושאי גידולים הוקמו עם מטפורמין ומצאנו ממושכים הישרדות באופן משמעותי. מחקרים קליניים בודקים את השימוש במטפורמין בחולים עם PDAC נערכים כיום (לדוגמא, NCT01210911, NCT01167738, וNCT01488552). מכניסטי, מצאנו כי מטפורמין גורם למשבר אנרגיה חמור בCSCS ידי שיפור מיני חמצן מגיבים ייצור (ROS) וצמצום פוטנציאל הטרנסממברני המיטוכונדריה. לעומת זאת, אינו CSCS לא בוטל על ידי טיפול במטפורמין, אלא עבר עצירת מחזור התא הפיכה. לכן, המחקר שלנו משמש כדוגמא מוצלחת לפוטנציאל של היווצרות כדור במבחנה ככלי מיון לזהות תרכובות שעלולים להיות יעד CSCים, אך טכניקה זו תדרוש נוספת במבחנה ובאימות vivo לחסל תגליות שווא.

מבוא

אדנוקרצינומה ductal לבלב (PDAC) היא אחד מהגידולים מוצקים האגרסיביים ביותר. זה כרגע 4 ^th המוות הקשורים לסרטן הנפוץ ביותר בחברה מערבית, והוא צפוי לעלות ל ^-2 הגורם השכיח ביותר בעשור הקרוב (~ 400,000 מקרי מוות בשנה בעולם) ³ הורגש תכונת זמן אבחון 90% מהחולים בהווה עם מחלה מתקדמת, שבו יש 5 שנות הישרדות של פחות מ -5%. שיעור הישרדות זה נותר ללא שינוי ב -50 השנים האחרונות מאכזב למרות פעילות מחקר אינטנסיבית יותר ויותר ^4. של יתרת 10% מהחולים שיש להם פוטנציאל מחלת ריפוי "דרך כריתה כירורגית, 80% ימותו מהישנות בתוך 5 שנים. במשך שנים רבות את רמת הטיפול למחלה מתקדמת הייתה טיפול יחיד gemcitabine, אבל זה רק מקנה יתרון הישרדות שולי ^5. שיפורים קטנים בהישרדות לטווח קצר הושגו על ידי התוספתשל erlotinib ⁶ או ⁷ capecitabine, אולם יתרון ההישרדות הוא בסדר הגודל של שבועות עם חציון ההישרדות הכוללת עדיין ~ 6 חודשים. לאחרונה, תוצאות מעודדות יותר צמחו לgemcitabine / NAB -paclitaxel ⁸ ושילוב FOLFIRINOX משטר ^9,10. טיפולים אלה משפרים הישרדות החציוני על ידי צנוע חודשים 2 ו -4 בהתאמה, אבל הם רעילים ביותר וניצולים לטווח ארוך עדיין יוצא דופן. למרות שהטיפול מציע את הפוטנציאל לשיפור, אלה הם רעילים למשטרים שחולים רבים אינם מגיבים או רק להראות שיפור מצטבר בהישרדות כוללת. כתוצאה מכך, יש צורך דחוף להשלים טיפולים הנוכחיים ולפתח רומן, גישות טיפוליות multimodal הסבירות ביותר.

הטרוגניות גידול

זה הופך להיות ברור יותר ויותר כי ההטרוגניות הסרטן אינה מוגבלת רק לwithi subclones אבולוציונית נפרדn כל גידול ^11, אלא גם מונע על ידי פנוטיפי והטרוגניות פונקציונלית וגמישות בתוך כל subclone ^12. מה שנקרא תאי גזע סרטני (CSCS) או תאי קידום גידול אחראים להטרוגניות intraclonal ^13-16. באופן ספציפי, CSCS מייצג קבוצת משנה של תאי סרטן, שעבורו אנו ואחרים סיפקנו ראיות חותכות, עד לתא הבודד, שהם מייצגים את השורש של מחלה על ידי מתן עלייה לכל progenies המובחן בתוך כל subclone סרטן ^17. יותר מכך, תאים אלה הם חיוניים להתנהגות גרורתי וגם מהווים מקור חשוב להישנות מחלה לאחר טיפול, אפילו עם תרופות יעילות יחסית מסוגלת גרימת רגרסיה ראשונית גידול (למשל, -paclitaxel NAB) ^15,18-20. חשוב לציין כי CSCS אינו מיצג בהכרח תאי גזע בתום לב, ואין הם נובעים מתאי גזע רקמות במקרים רבים, אלא שהם צריכים ACQuired תכונות מסוימות של תאי גזע. רוב אלה תפקודי מוגדרים, לדוגמא CSCS מצויד ביכולת התחדשות עצמית בלתי מוגבלת הופכת אותם עמידה לכימותרפיה קונבנציונלית, ולהראות עליית הפולשנות שמקדמת פעילות גרורתי.

פנוטיפים תאי גזע סרטניים פונקציונליים

פנוטיפ הפונקציונלי של CSCS מבוסס על היכולת שלהם להגדרה עצמית, לחדש, אשר יכול להיבדק במבחנה באמצעות היווצרות כדור סידורי ומבחני הקמת המושבה בהתאמה. אפילו יותר מכך, CSCS מסוגל דוב התחדשות עצמית בtumorigenicity vivo אשר יכול להיבדק על ידי הגבלת דילול במבחני vivo כקריאת הנתונים הפונקציונליות האולטימטיבית, רצוי במהלך השתלה סידורי מעידה על tumorigenicity לטווח ארוך הבלעדי. יתר על כן, יש הטרוגניות בתוך תא CSC, עם תת-אוכלוסייה מובחנת של CSCS נושא את היכולת הבלעדית ללהצמיח גרורות שאינה רקתוצאה ישירה שלהם בלעדי בtumorigenicity vivo. ואכן, CSCS metastastitic לרכוש את היכולת להתחמק הגידול הראשוני, לשרוד anoikis וסופו של הדבר translocate וזרע אתרים משניים. ניתן לבדוק את היכולות הפונקציונליות המתקדמות אלה במבחנה באמצעות מבחני שונה פלישה וin vivo באמצעות מבחני גרורות.

מיקוד תאי גזע סרטני

אנחנו ואחרים סיפקנו ראיות משכנעות כי טיפולים המתמקדים בגידול בכמות גדולה של תאי PDAC מובחנים, אפילו בשילוב עם סוכני מיקוד סטרומה, אין להם השפעה גדולה על התקדמות גידול ותוצאה שלאחר מכן, אלא אם כן בשילוב עם אסטרטגית CSC מיקוד ^{21, 22.} לפיכך, המבוסס על הפונקציות חיוניות של CSCS בהתקדמות מחלה והתנגדות לטיפול, תאים אלה צריכים לסמן רכיב חיוני לכל גישת טיפול חדשנית ^18,20, אבל ידרשו הבנה הרבה יותר מעמיקה oF מכונות רגולציה של CSCS. למרות CSCS וprogenies המובחן יותר שלהם לשאת מדינות קרקע גנטיות זהות ביחס לשינויים גנטיים, CSCS להפגין ביטוי גנים שונה ובכך epigenetically נחוש פרופילי שמודולים שתפו עם תאי גזע pluripotent. רוב הגנים מעורבים בתאי גזע pluripotent מניבה מושרה (Nanog, Oct3 / 4, Klf4, Sox2) לא רק קשור לסרטן, אבל הביטוי שלהם הוא בעיקר מוגבל לתא CSCS. יתר על כן, את הרלוונטיות הפונקציונליות של CSCS על ידי ניסויי פסד של פונקציה באמצעות כלים גנטיים למיקוד CSCS כעת מבוססים היטב את מושג CSC לכמה סוגי הסרטן ^23-25. בעוד שרוב הגישות אלה מבוססים על מודלים של עכברים, ולכן הם לא בקלות להעברה למרפאה, הם מספקים הוכחה של קונספט להרלוונטיות קלינית הפוטנציאלית של מיקוד CSCS בשילוב עם תאי גידול בתפוצה רחבה.

לומד תאי גזע סרטניים וביtro לזהות עקב אכילס שלהם

על מנת לזהות דרכים חדשות וקליני רלוונטיות למיקוד CSCS, התכונות שלהם הם למדו באופן קבוע במבחנה והיווצרות כדור נמצאת בשימוש נרחב בהקשר זה. פותח במקור ללימוד ביולוגיה של תא גזע נורמלי, לרבות חידוש עצמי ויכולת הבחנה, assay זה היה מאוחר יותר מותאם ללמוד CSCS במבחנה והיה בשימוש כבר חוקר CSCS מבודד מPDAC ^20. מצאנו כי תחומי גידול שנוצרו מתאי PDAC אנושיים ראשוניים לשאת את כל התכונות הייחודיות של CSCS, לכן מציין שהם מכילים CSCS לבלב בתום לב ^21. לפיכך, assay תחום גידול מייצג כלי רב עוצמה למסך לטיפולים יעילים יותר במבחנה, אבל תוצאות צריכה להיות מוערכות יותר במחמיר יותר במבחני vivo. ואכן, יש להתייחס אל הנתונים שנוצרו עם assay זה במבחנה בזהירות רבה כמו הassay הדואר יכול להיות כפוף לשגיאה משמעותית. פרוטוקולים סטנדרטיים ביותר, כולל ספירה אוטומטית של תחומים נוצרו, יש להקים כדי להבטיח נתונים לשחזור וחיזוי.

בהקשר זה, לאחרונה בשימוש assay זה מסך CSCS לבלב נגזר מקבוצה מגוונת של PDACs האנושי הראשוני, והראינו כי תאים אלה הם פגיעים מאוד לתכנות מחדש על ידי חילוף חומרים מטפורמין מתחם נגד סוכרת. בעבר, מטפורמין כבר הוכיח לעכב התפשטות תאים סרטנית על ידי הפעלה עקיפה של קינאז מופעל-AMP חלבון (AMPK) איתות ועיכוב הבא של mTOR ^26, וכתוצאה מכך סינתזת חלבון מופחתת ותא התפשטות ^27. בנוסף להשפעות אלה על אוכלוסיית הגידול בתפוצה רחבה, אנו ואחרים מצאנו כי מטפורמין יכול למקד ולמעשה לחסל את תת-האוכלוסיה CSCS במספר גידולים מוצקים כגון שד, סרטן הוושט, סרטן הלבלב וגליובלסטומה ^{28-31 <}/ Sup>. לפיכך, מטפורמין מייצג אסטרטגיה טיפולית חדשה ומבטיחה ובטוחה לכמה סוגי סרטן עם צורך רפואי כיום. יתר על כן, באמצעות יצירת מרחב כדרך להעשיר לCSCS, הראו שההשפעות העיקריות של מטפורמין על CSCS הלבלב היו עצמאית של הפעלת AMPK והסתמך בעיקר על הרעילות של המיטוכונדריה הצנועה שלה (באמצעות בלימה שלי מורכב), שככל הנראה הייתה קטלני לקבוצת משנה של CSCS בלבד. לזה האחרון שהיינו מסוגל להעריך ייצור צריכת החמצן וROS המיטוכונדריה הסלולרי שלהם כמדדי הרעילות של התרופה ברמה התאית. בהמשך לכך, במבחנה נתונים אלה ניתן היו לאמת במודלים של עכברים פרה-קליניים ואכן הביאו ממושך הישרדות ³¹ באופן משמעותי. המתודולוגיה המוצגת כאן מאפשרת לדור המהיר של פרופילי רגישות התרופה לCSCS, כוללים מחקרים על ההשפעות שלהם על חילוף חומרים CSC. עכשיו אנו מספקים הוארכו פרטים ניסיוניים על com מנוצלplementary במבחנה ובנהלי vivo.

פרוטוקול

גידולי PDAC אנושיים התקבלו עם כתב הסכמה מהדעת (Comunidad de מדריד, ספרד (CP CNIO-CTC-11 -. 11 CI / 103-E) השרשה של גידולים בלבלב אנושיים לעכברים immunodeficient דורשת האישור של מועצה לביקורת מוסדית, כמו גם מוסדית . טיפול בבעלי חיים ועדת שימוש (IACUC) הנהלים של מודלים עכבר גידול בלבלב xenograft חייבים להתנהל בהתאם לתקנות מוסדיות ולאומיות (כאן ועדת אתיקה של Instituto de Salud קרלוס השלישי; מדריד, ספרד; פרוטוקול רשות 34_2012).

1. תרבות מדיה

1. הכן בינוני מלא.
   1. להשלים בינוני RPMI עם 10% FBS, 100 יחידות / מיליליטר פניצילין / סטרפטומיצין. עבור 500 מיליליטר של RPMI להוסיף 55 מיליליטר של FBS חום מומת ו -6 מיליליטר של פניצילין / סטרפטומיצין (10,000 U / ml, 100X).
   2. אחסן את המדיום המלא על 4 מעלות צלזיוס.
2. הכן CSCS בינוני.
   1. להשלים את DMEM / mediu F12 הסרום ללאמ 'עם 100 יחידות / פניצילין / סטרפטומיצין מיליליטר ו -2 גלוטמין מ"מ.
   2. אחסן בינוני CSC ב 4 מעלות צלזיוס. B27 (01:50) ו- 20 ng / ml bFGF מתווספים טרי עד הבינוני לפני כל ניסוי.
      הערה: התוספת של B27 הוכחה להגדיל היווצרות כדור גידול ולקיים כמה קטעים של תרבויות תחום ^32. הרכב הבינוני הוא צעד חיוני ויש להיבדק לכל סוג תא בתרבות. אנו ממליצים בדיקת התחדשות עצמית ויכולת התמיינות של תחומים ולנתח ביטוי של סמני CSC ידי cytometry זרימה (כלומר, CD133 + וCD44 +).
3. הכן תאי שטף Assay בינוני.
   1. המדיום הספציפי הזה הוא DMEM הבסיסי 5030 המכיל ויטמינים, aminoacids ותוספי מזון אחרים, אבל חסרי גלוטמין, גלוקוז, פירובט וביקרבונט.
   2. עבור assay הנוכחי, להשלים בינוני עם 2 גלוטמין מ"מ, גלוקוז 8 מ"מ ופירובט נתרן 2 מ"מ לפעילות המטבולית של המיטוכונדריה מלאה.
      הערה: היעדר סודיום ביקרבונט הוא חיוני על מנת למדוד החמצה תאית של תאים גדלו בתרבות בצורה מדויקת, שכן ביקרבונט בינוני מכיל רגיל חיץ וריאציות pH במהלך assay. בנוסף, השימוש במדיום בסיסי מאפשר פיקוח הדוק של הריכוז של L-גלוטמין (כמו L-alanyl-גלוטמין) גלוקוז, או פירובט נתרן ההכרחי לתנאי assay שונים ו / או יישומים.

2. כדור יצירת Assay וניתוח

הערה: כל הפרוטוקולים בתרבית רקמה והמניפולציות חייבים להתבצע תוך שימוש בטכניקות סטרילי עם תשומת לב רבה באמצעות, כלי זכוכית סטרילית ונקיים, ללא חומרי ניקוי. לפני השימוש, טרום חם כל המדיום והפתרון במי אמבט 37 ° C (כחלופה, אתה יכול להשתמש במדיום ופתרונות מחוממים מראש ב RT). להשיג גידולי PDAC האדם כמפורט ²¹ בעבר.

1. בידוד של CSCS מPDAC האדם (איור1)
   1. בארון בטיחות ביולוגית סטרילי להעביר את רקמת PDAC אדם למנת תרבות מ"מ 60 x 15 המכילה 1 מיליליטר של תמיסת מלח סטרילית 1X פוספט (PBS). לרכך את הגידול לחתיכות קטנות (1 - 5 מ"מ) באמצעות אזמל ומלקחיים סטריליות.
   2. הוסף 1 מיליליטר של סטרילית 1X PBS למנה התרבות ולחזור על שלב טחינה דקה עד הרקמה ניתקה לחלוטין, באופן קבוע זה דורש 3-4 סיבובים. מעבירים את ההשעיה הרקמה (למעלה עד נפח סופי של 5 מיליליטר עם 1X PBS) לתוך צינור סטרילי ומכאני homogenize זה עם Dissociator כגון gentleMACS.
   3. דגירה הרקמה הומוגני עם collagenase (להשתמש 2.5 מ"ג / מיליליטר של collagenase ב1X PBS) במשך 60 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ואז צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 900 x גרם. למזוג supernatant ו resuspend את כדורי התא ב 10 מיליליטר של מדיום שלם. סנן את ההשעיה התא דרך מסננת 40 מיקרומטר וצנטריפוגות במשך 5 דקות ב 900 x גרם.
   4. למזוג supernatant ו resuspendגלולה עם 5 מיליליטר של חיץ תמוגה תא דם האדום (אמוניום-כלוריד, אשלגן, ACK), ודגירה
   5. Resuspend גלולה במדיום CSCS, צלחת על צלחת מצופה ג'לטין, ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. צעד זה להסיר את רוב תאי פיברובלסטים שלצרף במהירות לצלחת.
   6. הסר את הצלחת מן החממה ולשחזר השעיה תא בזהירות ולכמת את מספר תאי קיימא (trypan הכחול-שליליים) באמצעות hemocytometer. לשם כך, לערבב בעדינות את ההשעיה ופיפטה 20 μl של ההשעיה לצינור Eppendorf. הוסף 20 μl (1: 1 יחס) של trypan כחול לתאים בצינור microcentrifuge ומערבבים היטב. פיפטה כ 10 μl של התערובת על hemocytometer.
   7. לספור את כל התאים ברורים בתוך ארבעה הרביעים הפינה של חדר הספירה לספירת תאי קיימא. הערה: הכדאיות והתשואה של תאים עשויות להשתנות במידה ניכרת בין דגימות גידול. לPDAC כדאיות דגימות נעה betwe באופן קבועen 45-70%, וחלקי רקמה ממדגם גידול מקרוסקופית בקוטר של 3 - 5 מ"מ אמורים להניב כ 5x10 ⁶ תאי קיימא.
2. גיבוש תחום Assay ומטפורמין טיפול
   1. קח את המספר הדרוש של תאים ולהוסיף הנפח המתאים של מדיום CSCS להכין ריכוז תא של 2,000 תאים / מיליליטר. אל תשמור את ההשעיה התא על קרח לא יותר מ1H ומעורבב היטב לפני הציפוי.
   2. הוסף 500 μl של 1X PBS לשורה הראשונה והאחרונה של צלחת 24 גם ללחלוח כדי לעזור למזער אידוי בינוני. זרעי התאים לתוך צלחות תאים מצורפים נמוכים במיוחד בצפיפות של 2,000 תאים לכל גם ב 1 מיליליטר של מדיום תחום גידול (2,000 תאים / מיליליטר).
      הערה: מספר התאים המשמשים למבחני היווצרות כדור גידול עשוי להשתנות בין סוגי גידולים.
   3. פנק לפחות 4 בארות עם רכב (שליטה שלילית) ו -4 בארות עם כל טיפול שהוקצה, למשל., 3 מ"מ של מטפורמין. Plאס התאים בחממה מוגדרת 37 ° C ולספק את התאים עם 5% CO ₂ במשך שבוע אחד.
      הערה: הבינוני לא צריך להיות שונה על מנת לאפשר את ההיווצרות ללא הפרעה של תחומי גידול, אך ניתן עקף עם גורמי גדילה על בסיס יומי כפי שהם לא יציבים במדיום התרבות.
   4. בכל יום אחר להוסיף טיפול, למשל., 3 מ"מ של מטפורמין או רכב לכל אחד מהבארות. להעריך את מספר תחומי גידול שנוצרו לאחר 5 ו / או 7 ימים על ידי השימוש בדלפק תא אוטומטי המאפשר לספירת מבנים גדולים יותר (איור 2).
      הערה: רק תחומי גידול עם לפחות 40 מיקרומטר צריכה להיחשב ויכולה להיות מסווגת כקטן (40-80 מיקרומטר) או גדול (80-120 מיקרומטר), בהתאמה. ניתן להדגים את התוצאות כאחוז מתחומי גידול מחולק במספר הראשוני של תאי זרע (למשל, 2,000 תאים).
3. Passaging הסידורי של תחומי גידול הדור הראשון
   1. לאחר 7 ימים של דגירה לקצור את תחומי גידול באמצעות מסננת תא 40 מיקרומטר ו צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 900 XG ב RT.
   2. לנתק את גלולה של תחומי גידול לתאים בודדים באמצעות טריפסין, ולאחר מכן להרחיב את ההשעיה תאי תא בודדים שהושגה שוב לעוד 7 ימים כפי שתואר לעיל (ראה 2.2).

3. מטבוליזם ניתוח (ROS ייצור וצריכת חמצן)

1. ROS ייצור
   1. בפרוטוקול זה, השתמשנו carboxy-DCFDA כדוגמא למדידת ייצור ROS שכן הוא בדיקה סביר, מהירה ושימוש נרחב לגילוי ROS. עם זאת, יש כמה בדיקות אחרות ומתודולוגיות שיכולים לשמש לassay זה.
   2. פנק את תחומי גידול עם מטפורמין, כמתואר ב2.2 לסכום שהוקצה זמן. בסופו של טיפול, תחומי גידול יבול באמצעות מסננת תא 40 מיקרומטר, צנטריפוגה התאים ב 900 XG במשך 5 דקות ו resuspend גלולה ב 1 מיליליטר של trypsב. דגירה של 20 דקות על 37 מעלות צלזיוס.
   3. ברגע שתאי singularized, צנטריפוגות ב 900 XG וresuspend תאי HBSS המכילים 2.5 מיקרומטר carboxy-DCFDA. דגירה התאים במשך 20 דקות על 37 מעלות צלזיוס בחושך.
   4. לפני ניתוח תזרים cytometry להגן על תאים מוכתמים מהאור כcarboxy-DCFDA יכול להיות נותן תוצאות חיוביות שגויות חמצון תמונה. מניחים צינורות על קרח עד ניתוח.
      הערה: carboxy-DCFDA הוא ניאון לאחר תגובה עם מגוון רחב של מיני חמצן וחנקן תגובתי, שיראו בFL1 (לשעבר 488nm, 520nm..).
2. מדידת צריכת חמצן
   1. לפרוטוקול זה, אנו משתמשים במערכת תאי השטף Analyzer מBiosciences סוסון הים, כדוגמא. מעיל צלחת תרבית תאים הרצוי עם פתרון של 22.4 מיקרוגרם / מיליליטר של תא ודבק רקמות במשך 20 דקות ב RT. יש לשטוף את בארות מים 2 - 3 פעמים לפני זריעת התאים.
   2. בסופו של טיפול, תחומי גידול יבול באמצעות 4מסננת 0 מיקרומטר תא, צנטריפוגה התאים ב 900 XG במשך 5 דקות ו resuspend גלולה ב 1 מיליליטר של טריפסין. דגירה של 20 דקות על 37 מעלות צלזיוס.
   3. צלחת singularized תאים בצלחת תרבית תאים בצפיפות של 30,000 תאים / גם לצלחת גם 96 (נפח סופי: 150 μl). Resuspend התאים בינוני assay צריכת חמצן המכיל 8 מ"מ וגלוקוז 2 פירובט נתרן מ"מ.
   4. צנטריפוגה התאים לתחתית הבאר ידי צנטריפוגה ספין של הבארות עד שהגיע ל -100 XG ולאחר מכן אפשר להפסיק צנטריפוגות עם בלם משם. הפוך את הכיוון של הצלחת וחזור על התהליך. העבר את הצלחת לחממת 37 ° C, ללא תוספת של CO ₂ למשך 30 דקות.
   5. בינתיים, מכין את המחסנית עבור assay. לכל אחד יש גם 4 מזרקים שונים כדי לטעון (25 μl / יציאה):
      1. נמל: מטפורמין. כדי להשיג ריכוז סופי של 3 מ"מ בבאר, להכין פתרון 8x (24 מ"מ) כנפח הסופי יהיו 175μl לאחר ההזרקה של א 'הנמל
      2. נמל B: מטפורמין. כדי להוסיף 3 מ"מ ולהשיג ריכוז סופי של 6 מ"מ בבאר, להכין פתרון 9x (27 מ"מ) כנפח הסופי יהיה 200 μl לאחר ההזרקה של B. הנמל
      3. נמל C: מטפורמין. כדי להוסיף 3 מ"מ ולהשיג ריכוז סופי של 9 מ"מ בבאר, להכין פתרון 10x (30 מ"מ) כנפח הסופי יהיה 225 μl לאחר ההזרקה של ג הנמל
      4. הנמל D: rotenone 11 מיקרומטר, כדי להשיג 1μM כריכוז סופי בבאר (11x). הערה: rotenone מעכב כל פעילות המיטוכונדריה שייר לחלוטין.
   6. כייל את המחסנית וטען את צלחת תרבית תאים. בצע את assay עם הפרוטוקול הסטנדרטי של ערבוב ומדידה.
   7. לחשב את אחוז העיכוב של הנשימה המיטוכונדריאלי הכוללת שהושגה על ידי מטפורמין כאחוז מעיכוב שהושג עם rotenone (מוגדר כ100%).

4.Xenograft דגם לאדם בסרטן הלבלב בעכברים מדוכאי חיסון

הערה: להזמין כמות מספקת של מודלים נשיים athymic בעירום או אחרים, מדוכאי חיסון יותר עכבר כגון NOD-SCID, SCID-בז ', או NSG לניסויים ^33. החיטוי כל מכשירי הניתוח לפני הניסוי ולאפשר להם להתקרר לRT לפני השימוש. לגידולים תת עורית השתמשנו מינימום של 4 עכברים לכל מצב עם גידול אחד לכל אגף בסכום כולל של 8 גידולים.

1. Xenograft השתלה
   1. הכן חתיכות גידול מדגימות רקמת סרטן לבלב אנושיות. העבר את הגידול לתוך צלחת פטרי ולנתח את הרקמה לחתיכות קטנות (2 מ"מ בקוטר, ~ 8 מ"מ ³⁾ באמצעות אזמל ומלקחיים כדי להחזיק את הרקמה. טובלים את החתיכות שהושגו לפתרון תערובת חלבונים דביק שמר על קרח.
   2. הרדימי עכברים באמצעות 1 - isofluorane 3% או הרדמה inhalative או בזריקות אחרות.
      הערה: לפני שמתחיל כל proc כירורגיתedure, להבטיח כי העכברים שאיבדו לחלוטין את ההכרה על ידי גירוי עור הבטן או גוררים עם זוג המלקחיים קיסם. החל משחה העין כדי למנוע יובש.
   3. לאחר ההרדמה נקטה השפעה, לנגב את הגב של העכברים עם עור המכיל אתנול חיטוי. לנהל עצירות (0.05 מ"ג / קילוגרם BW) לפני ניתוח על מנת להבטיח שיכוך כאבים שלאחר ניתוח.
   4. הרם את עור הגב עם מלקחיים, לעשות 0.7 - חתך ארוך 1.0 סנטימטר עם מספריים מייקר סטרילי ולאחר מכן בבוטות להכין כיס קטן תת עורי, שבו פיסת רקמת סרטן לבלב שמקורם בחולה מוכנסת (~ 8 מ"מ ^3).
   5. לסגור את הפצע באמצעות 1 - 2 סיכות עור. להסיר אותם לאחר 7 ימים. להחזיר את העכברים לכלובים שלהם ולשמור אותם על כרית חימום או תחת מנורת חימום עד שהם פעילים באופן מלא שוב.
   6. בעקבות השתלת גידול, לפקח על העכברים לפחות פעמיים בשבוע לצמיחת גידול וסימנים כלליים של תחלואה הנובע כגון פרווה פרעה, huncheיציבת ד, וחוסר תנועה.
   7. ברגע שהגיעו לגידולים בגודל ממוצע של 200 מ"מ ^3, עכברים חולקו באקראי לטיפול המתאים. לנהל רכב או מטפורמין יומי באמצעות זריקות IP (150 מ"ג / קילוגרם BW) או באמצעות מי השתייה (150 מ"ג / קילוגרם BW) עם שפעות טיפול דומות.
   8. צג נטל גידול באמצעות קליפר ולחשב נפח גידול פעם בשבוע (מדידה של נפח גידול = 1/2 אורך נשימת × × 'רוחב).
   9. להקריב את העכברים פעם גידולים הגיעו 1 סנטימטר קוטר או עכברים מתחילים להראות סימנים של כאב חמור או מחלה כמפורט לעיל.

תוצאות

מטפורמין סלקטיבי מטרות CSCS לבלב

בדקנו ראשון השפעות התפקודיות של טיפול מטפורמין על יכולת התחדשות עצמית במבחנה של CSCS. לצורך כך, ערכנו מבחני היווצרות כדור באמצעות תאים ראשוניים אדם לבלב סרטן מבודד מרקמות PDAC במהלך ניתוח כריתה. הבחנו כי מטפורמין חזק ירד בגודל של כדורים נוצרו (איור 1 א). זה היה ככל הנראה על ידי עיכוב התפשטות progenies של CSC, שעדיין מייצג את חלק הארי של תאים הנמצאים בתחומים שהם מועשרים רק לCSCS. ואכן, תחומים יותר מתורבתים ללא passaging נרחב יותר הרחבת progenies המובחן יותר יהיה. כך מצאנו מטפורמין כדי להקטין באופן משמעותי את מספר התחומים יצרו למעשה ללא קשר לגודלם, המתרחש באופן תלוי מינון מציע עיכוב חזק של יכולת ההתחדשות העצמית של Cמאמנים (מידע לא מוצג). מצאנו מטפורמין שב -3 מ"מ ירד מספר תחומים נוצר (איור 1) באופן משמעותי. כדי ללמוד יותר מחמיר ההשפעות ארוכת הטווח של מטפורמין על יכולת ההתחדשות העצמית של CSCS, אנחנו לאחר מכן passaged תחומים העיקריים נוצרו לתחומים שניוניים ושלישונית. למרות שטופלו רק תחומים עיקריים עם מטפורמין, ההיווצרות של תחומים בקטעים השני והשלישי הייתה באופן דרסטי ויותר ויותר מופחת, לסבך את טיפול מטפורמין אכן בלתי הפיך בוטל רוב CSCS (איור 1 ג). כך, הנתונים שלנו הראו השפעות טיפול משמעותיות למטפורמין על יכולת ההתחדשות העצמית של CSCS לבלב העיקרי ובכך עודדו אותנו לבצע מכניסטית נוסף, כמו גם מחקרי in vivo.

מטפורמין מעכב צריכת חמצן מיטוכונדריאלי וגורם ייצור ROS

מאז metformin הוצג לפעול כרעל המיטוכונדריה על ידי באופן חלקי עיכוב אני פעילות מורכבת, אנחנו הבאים בחנו את ההשפעות אקוטיות של מטפורמין על צריכת חמצן סלולרית בתאים שמקורם תחום. לשם כך, אנו נבחרו תאים נגזרים משני גידולים עיקריים PDAC נציג ומדדנו את צריכת החמצן לאורך זמן לאחר הזרקה רציפה של 3 מ"מ מטפורמין (שלוש זריקות) וrotenone 1 מיקרומטר (זריקה אחת). כפי שניתן לראות באיור 2 א, הזרקת מטפורמין ביאה לירידה מהירה ותלוי-מינון בצריכת חמצן, שהייתה שונות משמעותי בין הגידולים השונים. חישבנו את פעילות המיטוכונדריה שייר על טיפול מטפורמין על ידי הזרקת rotenone, מורכב חזקה אני מעכב, אשר מסוגל עיכוב צריכת חמצן במיטוכונדריה לחלוטין. רגישות למטפורמין במונחים של צריכת חמצן במיטוכונדריה מתואמת עם היכולת שלה לגרום לייצור ROS המוגדר כעקירה של הממוצע של popuויסות לאחר טיפול מטפורמין (איור 2, פנל משמאל), שניתן לכמת (איור 2, פנל מימין) בקלות. כצפוי, התאים הראשוניים שהיו רגישים ביותר לעיכוב של צריכת חמצן גם הראו העלייה החזקה ביותר בייצור ROS על טיפול מטפורמין. לפיכך, חילוף חומרים במבחנה ניסויים אלה מראים כי CSCS מטרות מטפורמין על ידי עיכוב התלות שלהם בתפקוד המיטוכונדריה, וכתוצאה מכך עלייה שלאחר מכן בייצור ROS המיטוכונדריה וסופו של דבר אינדוקציה של אפופטוזיס.

מטפורמין הדוכנים PDAC התקדמות in vivo

לבסוף בחנו את ההשפעות של מטפורמין in vivo באמצעות xenografts רקמה נובע מחולים שונים עם PDAC. צפינו ירידה משמעותית בהתקדמות גידול לעכברים שטופל במטפורמין לעומת קבוצת הביקורת, אך לא גידולי Disa לחלוטיןppeared (איור 3). בהמשך לכך, במהלך תקופת מעקב כל הגידולים ארוך טווח הישנות סופו של דבר המצביעה על התנגדות מטפורמין של תאים ששרדו את השלב הראשון של טיפול. עם זאת, הטיפול במטפורמין, אפילו כשהם מיושמים כסוכן יחיד, הרחיב באופן משמעותי את הישרדות בכל העכברים.

איור 1. מטפורמין סלקטיבי מטרות CSCS. () מטפורמין ירידה בגודל של כדורים. נציג תמונות של תחומים המתקבלות לאחר הטיפול עם המינונים המצוין של מטפורמין במשך 7 ימים (פנל מימין). כימות של גודל כדור (n≥6) (פנל משמאל), המספרים שצוינו בציר abscissas מייצגים גידול בודד. יכולת היווצרות כדור בנוכחות או עדר של מטפורמין במשך 7 ימים (n≥6), המספרים שצוינו בabscissas (ב)ציר מייצג גידול בודד. גרף נציג יכולת התחדשות עצמית CSC בתחומים שניוניים ושלישונית של תאי סרטן לבלב עיקריים (C). טופלו התחומים רק במהלך היווצרות כדור הדור הראשון עבור הסכום כולל של 7 ימים (n = 6). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2. צריכת חמצן מטפורמין הטיפול מעכב וגורם ROS ייצור. () בנוסף מטפורמין מעכבים צריכת חמצן (OCR) של תאים שמקורם בתחום. טופלו שני תחומים משניים PDAC שונים עם מטפורמין ושינויי OCR נמדדו על ידי ניתוח שטף תאי. הזרקת Rotenone שימשה כביקורת לצריכת OCR המיטוכונדריה.ציר ה- X מייצג את שיעור צריכת החמצן בpmol של חמצן / שעה מנורמלות על ידי תכולת החלבון בכל טוב. תחומי PDAC (ב ') בשימוש בטופלו במשך שעה 8 עם מטפורמין וייצור ROS הוערך על ידי cytometry זרימה באמצעות carboxy-DCFDA. עזבתי זרימת נציג, cytometry מגרשים. נכון, סיכום של נתונים משלושה ניסויים בלתי תלויים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3. מטפורמין דוכנים PDAC התקדמות in vivo. שתי רקמות xenograft PDAC שונות הושתלו לעכברים דיכוי חיסוניים וטיפול הוקצה לאחר לקחת גידול ראשוני אומת. (150 מ"ג / קילוגרם גוף טופלו עכברים עם מטפורמין (Met) הוסיפו למים שתיית ווילהילחם; בהתבסס על 5 מיליליטר של צריכת מים ליום). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

דיון

עם הופעתה ולאחר מכן אימות של מושג CSC לגידולים רבים, תחום פיתוח תרופות צבר תאוצה חדשה, עם הפוטנציאל לפיתוח טיפולים יעילים יותר בסרטן ובהמשך הפחתת סיכון להשנות מחלה. עם זאת, בתחום CSC הוא עדיין במצב מוקדם יותר וצריכים להיות מושגים במונחים של הבנת מקור CSC והתפשטות, ותפקידם בעיצוב ארכיטקטורת הגידול וקידום גרורות.

בהקשר זה, השימוש במבחני CSC לשחזור ומשמעותיים, כמו גם את הפרשנות מושכלת של נתונים המתקבלים מהווה מרכיב חיוני לקידום ההבנה של הביולוגיה CSC שלנו. מהרבה נקודות מבט ביולוגיות, היווצרות הכדור התפתחה כassay יקר מאוד; בכל זאת משתמשים צריכים להיות מודעים למגבלותיה כדי לפרש כראוי תוצאות הניסויים שלהם. היבט חשוב לשקול עוד לפני ההערכה של פורם תחוםנתונים tion הוא המקור של המדגם נחקר, שכן התוצאות המתקבלות מדגימות שמקורם בחולה טריות יכולות להיות שונות באופן משמעותי מאלה המתקבלים משורות תאי הסרטן שהוקמו.

מבחני היווצרות כדור קלאסיים כרוכים בזריעת תאים בצפיפות משובט בצלחות ultralow-התקשרות והערכת היווצרות כדור בנוכחות גורם הגדילה באפידרמיס (EGF) ו / או הגורם בסיסי צמיחת פיברובלסטים (ב-FGF) מועשר, אבל בינוני סרום ללא ^{21, 34.} הרכב בינוני התרבות הוא גם נושא חשוב לשקול. מניסיוננו מצאנו כי DMEM / F12 בתוספת B27, bFGF וגלוטמין בהעדר הסרום היה בינוני אופטימלי לגדול, להתרחב ולשמור על CSC בתנאים שלא עברו התמיינות. מצאנו כי במצב זה תרבות (בינוני והשעיה) התאים לבטא כמויות גבוהות של סמני תא גזע סרטני (כולל CD133 +, CD44 + וCD24 +) ואינו מבטאים את החלבונים הקשורים בידול (CK-20 וCK-19).

אחת מהנחות היסוד למבחנים אלה הוא שכל תחום הוא משובט, כלומר, כדור אחד כתוצאה מהתרחבות של תאי גזע בודדים. עם זאת, התחומים הם במהות מבנים דינמיים שנוטים הפתיל אפילו בצפיפות זריעה נמוכה ^35. תאי ציפוי הוא שלב קריטי בפרוטוקול והצפיפות של תא אחד / טוב בהחלט יכול לעקוף את הבעיה הצבירה. אבל גם לאבות מסודרים מכאן ולהבא, זה תוצאות באופן קבוע בהיווצרות כדור נמוכה מאוד בשל פעילות היווצרות כדור פנימית נמוכה ויכול גם להיות מיוחס לגירוי autocrine מוגבל בשל תופעות דילול. מניסיוננו אנו ציינו כי רק 30% מתאים מצופים מסוגלים ליצור כדורים. אנו ממליצים להשתמש בלפחות 100 תאים / טובים כדי להשיג תוצאות עקביות לשחזור.

שיטות אחרות לתרבות CSC צמיחה מבוססות על תרבויות 3D מוצקות או חצי מוצק (למשל, מבוססת על מ 'atrigel, קולגן או methylcellulose). שיטות אלה היו בשימוש כדי להגביל את הניידות תא ותא צבירה לאחר ^36. עם זאת, כל אחד ממטריצות אלה נושא מגבלות שלהם. לדוגמא, matrigel הוא קרום מסיס מרתף מבודד מEngelbreth-הולם-סוואן (EHS) גידול ואף לחלץ דומה סביבת גידול תאית המורכבת הנמצאת ברקמות רבות, הוא מכיל גורמי גדילה מוגדרים יותר או פחות מרובים אשר לעתים קרובות הופך מכניסטית לימודים לאלמנטי רגולציה ספציפיים קשים מאוד. נקודת השיקול נוספת היא שפונקציות תא קיבולת וגזע יוצרי תחום אינן תנאים להחלפה ^34. בעוד תאי גזע ואב מסוימים הוכחו תערוכה כישלון להרכיב תחום יכולת ^37, ליצור כדורים במבחנה אינו שולל in vivo תפקוד גזע / אב. לדוגמא, תאי גזע שקטים יכולים פשוט לא להגיב לרמזים תאיים הניתנים על ידינבחר בתנאי תרבות חוץ גופית. כך, לטווח ארוך במבחנה וביכולת התחדשות עצמית vivo של אוכלוסיות תאים מטוהרים, מעדיף בpassaging הסידורי, יש לבחון על מנת להוכיח או להפריך תפקוד תא גזע. בהקשר זה, את היכולת מכאן ולהבא ובו זמנית כדי להפיץ אוכלוסיות מגוונות של תאי גזע ואב הוא היבט קריטי של assay יוצרי תחום והופך assay זה יקר מאוד לשדה CSC; כל עוד המגבלות שלה נשמרות במוח לפרשנות של נתונים המתקבלים.

מבחני יוצרי כדור היו בשימוש נרחב לזהות למפרע תאי גזע המבוססים על היכולת שלהם לחידוש עצמי ובידול ברמת התא הבודד במבחנה. הגילוי של סמנים המאפשרים בידוד הפוטנציאלי של תאי גזע וצאצאיהם מהנישה שלהם in vivo מאפשר התכונות הפונקציונליות של אוכלוסיות מטוהרים להיות מוגדרות. גombination של assay היווצרות הכדור וFACS הוא אסטרטגיה מוצלחת לבודד תאים מרקמות מוצקות או להעשיר תת-אוכלוסיות ספציפיות של PDAC בתרבות. לדוגמא, ביטוי בו זמני של EpCAM, CD24 וCD44 מגדיר תת-אוכלוסייה של CSCS מסוגל: התחדשות עצמית, להבדיל וליזום גידול, המשקף את ההטרוגניות של הגידול המקורי. הרמן ואח '. הראה כי תאי CD133 + דיבוק יכולת שגשוג מוגבר וCSC כולל ^15. סמנים אחרים יש גם שימשו לאפיון של CSCS: הביטוי (dehydrogenase-1 אלדהיד) ALDH- 1 קשור לתאים סרטניים מאוד בסרטן לבלב ^38; תאים מסוגלים להוציא את צבע DNA Hoechst 33342, אוכלוסיית צד בשם תאים (SP), יש את היכולת המוכחת ליזום גידולים ^39. לאחרונה הראו כי תא autofluorescence subcellular מאפיין אוכלוסייה מובחנת של תאים אנושיים עם תכונות CSC בלעדיות על פני סוגים שונים של גידול^40. למרות שאף אחד מסמנים אלה מופיע לאפיין אוכלוסייה טהורה של CSCS סלקטיבי, יותר ומורכבים יותר שילובים של סמנים צריכים לשמש כדי לטהר FACS אוכלוסיות מעודנות יותר של תאים.

שאלות רבות עדיין נותרו על התפקיד המדויק של CSCS במקור, ההתקדמות, והעמידות לתרופות של גידולים. לדוגמא, דרך אחת להתייחס לשאלה של התפתחות משובט להגדיר אם וכיצד CSC אחד יוזם גידול, יכול להיות לנתח דגימות מטופל בשלבים שונים של המחלה, ובמיוחד אחרי המספרים של CSCS במהלך ואחרי הטיפול. על ידי מענה על שאלות אלה, אנחנו יכולים לעשות התקדמות משמעותית של הידע שלנו על CSCS בגידולים מוצקים ולפתח טיפולים תרופתיים למניעת התקדמות גידול והישנות סופו של דבר.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
תא ספירה/המוציטומטר	Hausser Scientific Co	3200
CASY מונה תאים ומנתח למדידת התפשטות וכדאיות	Roche Innovatis	AG CASY דגם TTC 45,60,150 μ מ
GentleMACS Dissociator	Miltenyi Co	130-093-235
צינורות GentleMACS C	Miltenyi Co	130-093-237
24 בארות צלחות חיבור נמוכות במיוחד	קורנינג	3474
כלי תרבית רקמות 100 מ"מ	מסננת BD Falcon	353803
Cell	BD Falcon	352350
צינור חרוטי פוליפרופילן 15 מ"ל	בז BD	352097
צינור חרוטי מפוליפרופילן 50 מ"ל	בז BD	352070
שפופרות סטריליות 1.5 מ"ל	אפנדורף	0030 120.086
צינורות צנטריפוגה 50 מ"ל	קורנינג	430828
צלחות פטרי סטריליות, כלי 10 ס"מ	353003		מחטי קורנינג
26 גרם	מזרק BD Falcon	300600
100 ul המילטון	מזרק המילטון Co	81075
קולגנאז מסוג IV	טכנולוגיות תאי גזע	7909
RPMI בינוני 1640	טכנולוגיות חיים	11875-085
תמיסת פניצילין/סטרפטומיצין, 100X	טכנולוגיות חיים	SV30010
מטפורמין	סיגמא	D150959-5G
L-גלוטמין, 200 מ"מ, 100X	טכנולוגיות חיים	25030-081
D-גלוקוז	Sigma	G8270
100mM תמיסת נתרן פירובט	טכנולוגיות חיים	11360-070
מדיום בדיקת סוסון ים	Seahorse Bioscience	100965-000
BD Cell-TAK דבק תאים ורקמות	BD Biosciences	354240
תמיסת טריפסין, 0.05%	טכנולוגיות חיים	25300054
תוסף B27 50x	Life Technologies	17504-044
גורם גדילה בסיסי של פיברובלסטים	סיגמא	F0291
אלבומין סרום בקר	סיגמא	A9576
דולבקו s Modified Eagle Medium/F12	Sigma	D8437
סטרילי 1x Dulbecco' s פוספט חוצץ מלח	סיגמא	D8537
טריפן כחול	טכנולוגיות חיים	15250-061
Carboxy-DCFDA(5-(ו-6)-Carboxy-2',7'-DichlorofluoresceinDiacetate)	טכנולוגיות חיים	C-369
רוטנון	סיגמא	R8875
אתנול 70% (נפח/נפח)	Sigma	459844
Isofluorane	IsoVet, בראון	571105.8
Matrigel	BD Biosciences	35620
אפליקטור סטרילי עם קצה כותנה	Puritan medical
XF96e FluxPak עם לוחות תאים, קליברנט ומחסניות	Seahorse Bioscience	102416-100
XF96e מנתח שטף חוץ-תאי	Seahorse Bioscience
Incubator עם קלט CO2;
מיקרו מספריים
מלקחיים
מלקחיים
קליפר