Transfecting תאי RAW264.7 עם לוציפראז כתב ג'ין

Transfection של חומצות גרעין בתאים יש יישום מגוון במחקר מדעי. דוגמאות כוללות (1) גני כתב כדי ללמוד את התפקיד של גורמים גנטיים שונים בביטוי גנים, (2) פלסמידים ביטוי חלבון לביטוי יתר של החלבון של עניין, ו- (3) קטן מפריעים RNA לdownregulate ביטוי גנים. על ידי מניפולציה של רמת הביטוי של גנים מסוימים ומדידת השפעת ההפרש של מניפולציות כאלה, חוקרים יכולים להסיק את פונקציות הגן במערכות ביולוגיות שנבחרו. לא כל שיטות transfection לספק את אותה יעילות transfection, ואפילו באותה השיטה transfection לא transfect כל סוגי התאים באופן שווה ^1. לפיכך, שיטות transfection שונות פותחו כגון שיטת סידן זרחה, dextran DEAE, transfection השומנים קטיוני, transfection פולימר שאינו השומנים קטיוני, electroporation, וnucleofection ^2,3.

Transfection למקרופאגים הוא ESPEקשה cially בשל העובדה שמקרופאגים הם phagocytes המקצועי, כי הם מאוד רגישים לחומרים זרים ובם חיידקים נגזרו DNA (מפוגל) ^4. מבוא של דנ"א זר מפעיל את המסלול-כמו אגרת קולט 9 (TLR9) שמוביל לייצור של ציטוקינים ^ו5,6 תחמוצת חנקן. מקרופאגים מופעלים אלה עשויים להיות אז פחות מגיבים לטיפול שהחוקרים מתכוונים לבדוק.

המעבדה שלנו באופן שגרתי transfects שורת תאי מקרופאג RAW264.7 עם גני כתב בלוציפראז, ופתחנו פרוטוקול כי הוא חזק מספיק כדי להיות אות בלוציפראז גבוהה משמעותי מרקע, אבל גם עדין מספיק למקרופאגים להישאר במצב המנוחה שלהם. ההתנהגויות של תאי transfected הוערכו על ידי גן כתב גחלילית בלוציפראז מחסה אזור האמרגן של IκBζ (pGL3- IκBζ). ביטוי IκBζ הוא שהוגברו על ידי שפת רכיב קיר תא החיידקopolyssacharide (LPS) ^7,8, וdownregulated ידי ציטוקינים אנטי-דלקתיים, Interleukin-10 (IL-10) ^8. כדי להסביר את שונות בין transfection בארות, אנחנו שיתוף transfect פלסמיד שליטה המכיל את הגן בלוציפראז Renilla (למשל, phRL-TK) למטרות נורמליזציה. הפרוטוקול המתואר הוא מותאם לאחר בדיקת פרמטרים שונים, כולל תזמון של transfection, סוג של חומרים כימיים transfection, כמויות של חומרים כימיים transfection ושל פלסמיד דנ"א, כמו גם יחס של מגיב transfection לפלסמיד דנ"א. שני ריאגנטים transfection הכלולים בפרוטוקול זה הם (1) מגיב transfection שומנים מבוסס ו( 2) חלבון / מגיב transfection מבוסס polyamine.

1. פלסמיד דנ"א טיהור

1. תמצית ה- DNA פלסמיד באמצעות ערכת maxiprep פי הפרוטוקול של היצרן. פלסמיד דנ"א הגלול ב500 μl של TE חיץ.
2. בצע פנול: כלורופורם: מיצוי אלכוהול isoamyl והמשקעים isopropanol להסרת מזהמי חיידקי שייר. הנוכחות של LPS מפריעה transfection ^9.
   1. הוסף 500 μl של פנול: כלורופורם: אלכוהול isoamyl (25: 24: 1, pH 8) לפלסמיד דנ"א ולנער במרץ במשך 15 שניות. פנול גורם לכוויות בעור חמורות והוא הרדמה כך כוויות לא תמיד הרגישו עד שניזק חמור. בצע פנול: מיצוי isoamyl במנדף ולנקוט באמצעי זהירות: כלורופורם.
3. דגירה את התערובת במשך 5 דקות על RT. צנטריפוגה ב 13,000 XG במשך 10 דקות ב RT. העבר את 350 μl של שלב מימי העליון לתוך צינור 1.5 מיליליטר אוסף חדש.
4. להוסיף 350 μl של TE חיץ לצינור המכיל את השלב האורגני הנמוך. לנער במרץ במשך 15 שניות. צנטריפוגה ב 13,000 XG במשך 5 דקות על RT. העבר את 350 μl של שלב מימי העליון לאותו צינור איסוף 1.5 מיליליטר.
5. להוסיף 70 μl של 3 נתרן אצטט M (pH 5.2) ומערבבים היטב. להוסיף 700 μl של isopropanol 100%. מערבבים היטב דגירה 10 דקות ב RT. צנטריפוגה ב 13,000 XG במשך 10 מינת 4 מעלות צלזיוס. הסר את supernatant.
6. הוסף 500 μl של 75% אתנול לגלולה. דגימות מערבולת לערבב וצנטריפוגות ב XG 5000 במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס. הסר את supernatant. ה- DNA הוא בגלולה.
7. פתח את הכובע של הצינור ואוויר יבש גלולה ב RT עבור 5 - 10 דקות. גלולה צריכה להיות שקופה. הוסף 500 μl של TE חיץ לresuspend גלולה DNA. חום ב50 - 60 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי לפזר את גלולה DNA.
8. מדוד את הספיגה ב 260 ננומטר (A260) ו -280 ננומטר (A280) עם ספקטרומטר. חשב את הריכוז של ה- DNA על ידי הכפלת ערך A260 ב -50 ng / μl. להעריך את האיכות של ה- DNA על ידי calculatinז יחס A260 / A280. ה- DNA באיכות גבוהה צריך לתת יחס A260 / A280 של 1.8-2.0.

2. culturing תא וזריעה

1. תאי RAW264.7 תרבות DMEM בתוספת 9% בסרום עוברי עגל (FCS / 9% DMEM) ב37 ° C, חממה 5% CO _2. במהלך כל קטע, לנתק את התאים מהצלחת ידי pipetting הרציף בעזרת פיפטה פסטר. מעבר התאים כל 2 ימים, וזרע 1.5-2,000,000 תאים על צלחת טופלה תרבית רקמת 10 סנטימטרים כמניות. להפשיר מלאי חדש של תאים בכל 5-6 שבועות.
2. ביום transfection, זרע 200,000 תאים לכל גם בצלחת 24 גם בנפח של 500 μl של FCS / 9% DMEM. דגירה התאים במשך 4 שעות בחממת 37 ° C.
3. תאי Transfect גם עם מגיב שומנים מבוססי (שלב 3.1) או מגיב מבוסס polyamine חלבון / (שלב 3.2).

3. Transfection

1. transfection שומנים מבוסס:
   1. לחמם את reagen transfectionלא לRT בחושך. לחמם את מדיום סרום ללא וDMEM / 9% FCS 37 ° C.
   2. הוסף 0.5 מיקרוגרם של ה- DNA פלסמיד 50 μl של מדיום סרום ללא בצינור 1.5 מיליליטר. הוסף 2 μl של מגיב transfection עם קצה פיפטה מתחת לפני השטח של הנוזל. מערבולת 6 שניות.
   3. השאר את התערובת מגיב / DNA בחושך ב RT למשך 30 דקות.
   4. במהלך הדגירה 30 דקות, להסיר את המדיה מהבאר ולהוסיף 250 μl של FCS DMEM / 9% הטריים היטב כל אחד.
   5. לאחר 30 דקות, להוסיף 250 μl של DMEM / 9% FCS לתערובת מגיב / DNA. מערבבים היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה.
   6. להוסיף 300 μl של התערובת מדוללת היטב כל אחד. דגירה של 2-4 שעות ב37 ° C, חממה 5% CO _2.
   7. הסר פתרון transfection ולהוסיף 500 μl של FCS / 9% DMEM. דגירה של 24-48 שעות ב37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ באינקובטור לפני גירוי תא.
2. חלבון / transfection מבוסס polyamine:
   1. לחמם את הסרום ללאבינוני וFCS / 9% DMEM 37 ° C.
   2. להוסיף 0.75 μl של מגיב transfection ל18.75 μl של מדיום סרום ללא. בקצרה מערבולת לערבב. לדגור על RT במשך 5 דקות. הוסף 0.5 μl של 1 מיקרוגרם / μl DNA לדילול מגיב transfected. לדגור על RT במשך 10 דקות.
   3. במהלך הדגירה 10 דקות, להסיר את התקשורת מכל טוב של הצלחת 24 גם ולהוסיף 250 μl FCS / 9% DMEM הטרי היטב כל אחד.
   4. לאחר 10 דקות, להוסיף 250 μl של FCS / 9% DMEM לתוך התערובת מגיב / DNA.
   5. להוסיף 270 μl של התערובת מדוללת לטוב. דגירה 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ באינקובטור 2 - 4 שעות.
   6. הסר פתרון transfection ולהוסיף 500 μl של FCS / 9% DMEM. דגירה של 24-48 שעות ב37 ° C, חממה 5% CO _2.

4. גירוי תא וAssay בלוציפראז

1. החלף תקשורת בהיטב עם 250 μl של FCS / 9% DMEM הטרי.
2. הוסף 50 μl של LPS או LPS + IL-10 בריכוזים הרצויים לטוב. להחזיר את הצלחת לC ° 37, חממת 5% CO _2. לעורר ל2-6 שעות.
3. הסר פתרון גירוי על ידי שאיפה, לשטוף עם קרח הקר PBS, ולהוסיף 200 μl של 1x פסיבי תמוגה הצפת. רוק בRT למשך 30 דקות. לגרד ולהעביר את lysate לצינורות 1.5 מיליליטר ולהסיר פסולת תא על ידי צנטריפוגה ב -20,000 XG במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
4. העברה 40 μl של lysate פינה (supernatant) לצלחת לבנה, ברורה תחתונה 96-גם לקביעת אותות לוציפראז על פי הפרוטוקול של היצרן.
5. קראו את האות בלוציפראז עם luminometer פני כל ספקטרום האור הנראה.

ניתוח נתונים 5.

1. לחשב את הגחלילית: יחס Renilla ידי חלוקת ערכים אישיים של לוציפראז גחלילית על ידי הערכים של לוציפראז Renilla מכל טוב.
2. לחשב את שינוי הקיפול על ידי חלוקת גחלילית: יחס Renilla של מטופלים היטב על ידיכי הבאר שלא טופלה.

איור 1 משווה את יעילות transfection של שני ריאגנטים transfection בRAW264.7. מגיב השומנים מבוססי בדרך כלל נתן שיעור transfection כ -25% ואילו transfection מבוסס polyamine חלבון / הביא כ -5% יעילות (איור 1 א). ההבדל ביעילות transfection נצפה גם באותות בלוציפראז בתאי RAW264.7 transfected עם כתב אמרגן pGL3-IκBζ (איור 1). תוספת של LPS לתאי transfected אלה הגדילה את אות גחלילית בלוציפראז, אינדיקציה ישירה של פעילות שעתוק המוגברת של כתב אמרגן IκBζ. במילים אחרות, התוצאות הראו כי LPS הוגבר הביטוי של גן IκBζ, עולה בקנה אחד עם דיווחים קודמים 7,8. איור 2 מציג את התוצאות שהתקבלו בניסויים הטיפוסיים שלנו, באמצעות transfection שומנים מבוססי כדוגמא. לאחר קבלת ערכי אות בודדות מFiלוציפראז refly ולוציפראז Renilla (2A דמויות ו2B), האותות בלוציפראז גחלילית היו מנורמלים לאות לוציפראז Renilla (איור 2 ג). נורמליזציה מומלצת בשל וריאציה להיטב היטב ביעילות transfection. כדי לקבוע אם תנאי הטיפול (LPS או LPS + IL-10) שינו את אותות כתב, גחלילית: יחס Renilla (כלומר, האותות מנורמלים) של קבוצות הטיפול הושוו לזה של המדגם (איור 2 שלא טופלו (unstimulated) ). הנתונים שלנו הראו כי תאי RAW264.7 טיפול עם LPS הוגברו פעילותו של כתב אמרגן pGL3-IκBζ, מצביעים על כך שLPS הגביר את רמת השעתוק של גן IκBζ. בנוכחות של IL-10, כתב אמרגן IκBζ היה פעילות נמוכה יותר, מה שמרמז כי IL-10 הצליחו לעכב שעתוק מושרה LPS של גן IκBζ. החלבון / transfection מבוסס בדרך כלל polyamineנתן ערכים נמוכים יותר בשני לוציפראז הגחלילית ואותות בלוציפראז Renilla. איור 3 משווה את משך זמן מנוחה בין transfection וגירוי (24 שעות או 48 שעות), ומראה כי אותות לוציפראז ירידה לאורך זמן. הירידה באות לא להפריע לפרשנות נתונים כאשר מגיב transfection השומנים מבוסס שימשה (איור 3 א); אינדוקציה על ידי LPS ועיכוב על ידי IL-10 עדיין נצפתה לאחר 48 שעות של מנוחה. עם זאת, הירידה באות הייתה משמעותית יותר כאשר החלבון / מגיב transfection מבוסס polyamine שימש (איור 3), במיוחד את אותות לוציפראז Renilla. כתוצאה מכך, ההבדל בין קבוצות טיפול לא נצפה לאחר 48 שעות מנוחה.

השפעה לא רצויה אחד transfection היא מוות של תאים ולכן ההשפעה של כל שיטת transfection על התואר של אפופטוזיס הוערכה. תאים היו transfected, או לא, ונתונים לAnnexin-V ויודיד propidium (PI)מכתים. Lysates הוכן מהתאים אלה נותחו גם לנוכחות של חלבון פולי שלם ובקע ADP פולימראז ribose (PARP). ניתוח תזרים cytometric של Annexin-V / תאי PI מוכתמים הציע שtransfection השומנים מבוסס מעט הגדיל את חלקם של תאים חיוביים Annexin-V בהשוואה לתאי untransfected, בעוד transfection מבוסס polyamine חלבון / לא עשה (איור 4 א) . באופן דומה, המבוססים על השומנים transfected מעט הגדיל את חלקם של PARP ביקע בעוד transfection מבוסס polyamine חלבון / לא עשה (איור 4). עם זאת, למרות המספרים גבוהים של תאים אפופטוטיים, המורפולוגיה של התאים על ידי מיקרוסקופ אור לא השתנתה (איור 4C). יותר מכך, התגובה הביולוגית של תאי transfected שומנים מבוססי נשארה זהה לאלה של תאי untransfected (איור 4D). התאים היו מגורה עם LPS ± IL-10, ועל הסכומים של TNF ^5; מופרש לתוך supernatant התרבות היו לכמת ידי ELISA. שני תאי transfected untransfected ושומנים מבוססי עשו כמויות דומות של TNFα בתגובה לLPS ועוכבו על ידי התוספת של IL10. אין TNFα נעשה כאשר התאים לא מגורה (איור 4D) מצביע על כך שהתאים נשארו נאיביים לאחר transfection.

איור 1. transfection שומנים מבוססי נתן יעילות transfection גבוהה מהחלבון / transfection מבוסס polyamine. תאי RAW264.7 () היו transfected פלסמיד להביע GFP גם עם ריאגנטים transfection מבוססי polyamine חלבון / שומנים מבוססי או. אות ה- GFP נמדדה על ידי cytometry זרימה לאחר 24 שעות. תאים (B) RAW264.7 היו transfected עם כתב אמרגן pGL3-IkBζ. לאחר 48 שעות מנוחה, גאמות היו מגורה עם LPS עבור 6 שעות. אות בלוציפראז גחלילית נמדדה על פי הוראות יצרן. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

2. נתונים איור אופייניים assay בלוציפראז. תאי RAW264.7 היו transfected עם TK-Renilla וכתב אמרגן IkBζ. לאחר 24 שעות מנוחה, תאים היו מגורה עם LPS ± IL-10 לשעה 2. (א) בלוציפראז גחלילית ואותות בלוציפראז (B) Renilla נמדדו לפי הוראות יצרן assay בלוציפראז. פעילות כתב (C) הייתה מנורמלת לאות TK-Renilla ולהתוות כיחס Firefly / Renilla. (ד) מקפלים שינוי מחושב על ידי החלוקהגחלילית:. יחס Renilla של דגימות מגורה על ידי שמדגם unstimulated אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3. עוצמת אות בלוציפראז הוא תלוי זמן. מבוסס polyamine חלבון / תאים () transfected שומנים מבוסס ו( ב) transfected היו נחו או שעה 24 או 48 שעות לפני גירוי עם LPS ± IL-10 עבור שעה 2. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

(א) בתאי RAW264.7 היו transfected עם כתב אמרגן IkBζ. לאחר 24 שעות מנוחה, המוות של תאים הוערך על ידי Annexin-V וצביעת יודיד propidium (PI) על cytometer זרימה. תאים (B) transfected היו נתונים לimmunoblotting ניתוח לPARP (באורך מלא ובקעו) וGAPDH (שליטת טעינה). עוצמות להקה אז היו לכמת באמצעות תוכנת הדמיה. L = transfection שומנים מבוסס, P = חלבון / transfection מבוסס polyamine, STP = 0.1 מיקרומטר staurosporin. תמונות (C) מיקרוסקופים של תאי transfected עם מגיב transfection שומנים מבוסס. תאים (ד) transfected עם מגיב transfection שומנים מבוסס היו מגורה עם LPS ± IL-10 במשך 6 שעות, והרמות של TNFα ציטוקינים פרו-הדלקתי נמדדו באמצעות ELISA. אנא לחץ עליומחדש כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

יש המחברים אין לחשוף.