הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

Transfecting תאי RAW264.7 עם לוציפראז כתב ג'ין

21.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/52807

⸱

18 ביוני 2015

 ,  ,  , 
1Immunity and Infection Research Centre, Vancouver Costal Health Research Institute, 2Department of Surgery, University of British Columbia, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of British Columbia

במאמר זה

סיכום

טרנספקציה לקו תאי המקרופאגים, RAW264.7, קשה בשל התגובה הטבעית של התא כנגד חומרים זרים. תיארנו כאן הליך עדין אך חזק להעברת גנים מדווחים על לוציפראז לתאי RAW264.7.

תקציר

העברה של חומרים גנטיים רצויים לתאים היא הליך בלתי נמנע במחקרים ביו-רפואיים. בעוד שתוארו שיטות רבות, סוגים מסוימים של תאים עמידים לרבות מהשיטות הללו ומניבים יעילות טרנספקציה נמוכה1, מה שעלול לעכב את המחקר בסוגי תאים אלה. בפרוטוקול זה, אנו מציגים הליך טרנספקציה אופטימלי להכנסת גנים מדווחים של לוציפראז כ-DNA פלסמיד לקו תאי המקרופאגים RAW264.7. מתוארים שני סוגים שונים של ריאגנטים טרנספקציה (מבוססי שומנים ומבוססי פוליאמין), והערות חשובות ניתנות לאורך הפרוטוקול כדי להבטיח שתאי RAW264.7 ישתנו באופן מינימלי על ידי הליך הטרנספקציה וכל נתוני הניסוי המתקבלים הם התוצאות הישירות של הטיפול הניסיוני. בעוד שיעילות הטרנספקציה עשויה שלא להיות גבוהה יותר בהשוואה לשיטות טרנספקציה אחרות, ההליך המתואר חזק מספיק לזיהוי אות לוציפראז ב-RAW264.7 מבלי לשנות את התגובה הפיזיולוגית של התאים לגירויים.

מבוא

Transfection של חומצות גרעין בתאים יש יישום מגוון במחקר מדעי. דוגמאות כוללות (1) גני כתב כדי ללמוד את התפקיד של גורמים גנטיים שונים בביטוי גנים, (2) פלסמידים ביטוי חלבון לביטוי יתר של החלבון של עניין, ו- (3) קטן מפריעים RNA לdownregulate ביטוי גנים. על ידי מניפולציה של רמת הביטוי של גנים מסוימים ומדידת השפעת ההפרש של מניפולציות כאלה, חוקרים יכולים להסיק את פונקציות הגן במערכות ביולוגיות שנבחרו. לא כל שיטות transfection לספק את אותה יעילות transfection, ואפילו באותה השיטה transfection לא transfect כל סוגי התאים באופן שווה 1. לפיכך, שיטות transfection שונות פותחו כגון שיטת סידן זרחה, dextran DEAE, transfection השומנים קטיוני, transfection פולימר שאינו השומנים קטיוני, electroporation, וnucleofection 2,3.

Transfection למקרופאגים הוא ESPEקשה cially בשל העובדה שמקרופאגים הם phagocytes המקצועי, כי הם מאוד רגישים לחומרים זרים ובם חיידקים נגזרו DNA (מפוגל) 4. מבוא של דנ"א זר מפעיל את המסלול-כמו אגרת קולט 9 (TLR9) שמוביל לייצור של ציטוקינים ו5,6 תחמוצת חנקן. מקרופאגים מופעלים אלה עשויים להיות אז פחות מגיבים לטיפול שהחוקרים מתכוונים לבדוק.

המעבדה שלנו באופן שגרתי transfects שורת תאי מקרופאג RAW264.7 עם גני כתב בלוציפראז, ופתחנו פרוטוקול כי הוא חזק מספיק כדי להיות אות בלוציפראז גבוהה משמעותי מרקע, אבל גם עדין מספיק למקרופאגים להישאר במצב המנוחה שלהם. ההתנהגויות של תאי transfected הוערכו על ידי גן כתב גחלילית בלוציפראז מחסה אזור האמרגן של IκBζ (pGL3- IκBζ). ביטוי IκBζ הוא שהוגברו על ידי שפת רכיב קיר תא החיידקopolyssacharide (LPS) 7,8, וdownregulated ידי ציטוקינים אנטי-דלקתיים, Interleukin-10 (IL-10) 8. כדי להסביר את שונות בין transfection בארות, אנחנו שיתוף transfect פלסמיד שליטה המכיל את הגן בלוציפראז Renilla (למשל, phRL-TK) למטרות נורמליזציה. הפרוטוקול המתואר הוא מותאם לאחר בדיקת פרמטרים שונים, כולל תזמון של transfection, סוג של חומרים כימיים transfection, כמויות של חומרים כימיים transfection ושל פלסמיד דנ"א, כמו גם יחס של מגיב transfection לפלסמיד דנ"א. שני ריאגנטים transfection הכלולים בפרוטוקול זה הם (1) מגיב transfection שומנים מבוסס ו( 2) חלבון / מגיב transfection מבוסס polyamine.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. פלסמיד דנ"א טיהור

  1. תמצית ה- DNA פלסמיד באמצעות ערכת maxiprep פי הפרוטוקול של היצרן. פלסמיד דנ"א הגלול ב500 μl של TE חיץ.
  2. בצע פנול: כלורופורם: מיצוי אלכוהול isoamyl והמשקעים isopropanol להסרת מזהמי חיידקי שייר. הנוכחות של LPS מפריעה transfection 9.
    1. הוסף 500 μl של פנול: כלורופורם: אלכוהול isoamyl (25: 24: 1, pH 8) לפלסמיד דנ"א ולנער במרץ במשך 15 שניות. פנול גורם לכוויות בעור חמורות והוא הרדמה כך כוויות לא תמיד הרגישו עד שניזק חמור. בצע פנול: מיצוי isoamyl במנדף ולנקוט באמצעי זהירות: כלורופורם.
  3. דגירה את התערובת במשך 5 דקות על RT. צנטריפוגה ב 13,000 XG במשך 10 דקות ב RT. העבר את 350 μl של שלב מימי העליון לתוך צינור 1.5 מיליליטר אוסף חדש.
  4. להוסיף 350 μl של TE חיץ לצינור המכיל את השלב האורגני הנמוך. לנער במרץ במשך 15 שניות. צנטריפוגה ב 13,000 XG במשך 5 דקות על RT. העבר את 350 μl של שלב מימי העליון לאותו צינור איסוף 1.5 מיליליטר.
  5. להוסיף 70 μl של 3 נתרן אצטט M (pH 5.2) ומערבבים היטב. להוסיף 700 μl של isopropanol 100%. מערבבים היטב דגירה 10 דקות ב RT. צנטריפוגה ב 13,000 XG במשך 10 מינת 4 מעלות צלזיוס. הסר את supernatant.
  6. הוסף 500 μl של 75% אתנול לגלולה. דגימות מערבולת לערבב וצנטריפוגות ב XG 5000 במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס. הסר את supernatant. ה- DNA הוא בגלולה.
  7. פתח את הכובע של הצינור ואוויר יבש גלולה ב RT עבור 5 - 10 דקות. גלולה צריכה להיות שקופה. הוסף 500 μl של TE חיץ לresuspend גלולה DNA. חום ב50 - 60 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי לפזר את גלולה DNA.
  8. מדוד את הספיגה ב 260 ננומטר (A260) ו -280 ננומטר (A280) עם ספקטרומטר. חשב את הריכוז של ה- DNA על ידי הכפלת ערך A260 ב -50 ng / μl. להעריך את האיכות של ה- DNA על ידי calculatinז יחס A260 / A280. ה- DNA באיכות גבוהה צריך לתת יחס A260 / A280 של 1.8-2.0.

2. culturing תא וזריעה

  1. תאי RAW264.7 תרבות DMEM בתוספת 9% בסרום עוברי עגל (FCS / 9% DMEM) ב37 ° C, חממה 5% CO 2. במהלך כל קטע, לנתק את התאים מהצלחת ידי pipetting הרציף בעזרת פיפטה פסטר. מעבר התאים כל 2 ימים, וזרע 1.5-2,000,000 תאים על צלחת טופלה תרבית רקמת 10 סנטימטרים כמניות. להפשיר מלאי חדש של תאים בכל 5-6 שבועות.
  2. ביום transfection, זרע 200,000 תאים לכל גם בצלחת 24 גם בנפח של 500 μl של FCS / 9% DMEM. דגירה התאים במשך 4 שעות בחממת 37 ° C.
  3. תאי Transfect גם עם מגיב שומנים מבוססי (שלב 3.1) או מגיב מבוסס polyamine חלבון / (שלב 3.2).

3. Transfection

  1. transfection שומנים מבוסס:
    1. לחמם את reagen transfectionלא לRT בחושך. לחמם את מדיום סרום ללא וDMEM / 9% FCS 37 ° C.
    2. הוסף 0.5 מיקרוגרם של ה- DNA פלסמיד 50 μl של מדיום סרום ללא בצינור 1.5 מיליליטר. הוסף 2 μl של מגיב transfection עם קצה פיפטה מתחת לפני השטח של הנוזל. מערבולת 6 שניות.
    3. השאר את התערובת מגיב / DNA בחושך ב RT למשך 30 דקות.
    4. במהלך הדגירה 30 דקות, להסיר את המדיה מהבאר ולהוסיף 250 μl של FCS DMEM / 9% הטריים היטב כל אחד.
    5. לאחר 30 דקות, להוסיף 250 μl של DMEM / 9% FCS לתערובת מגיב / DNA. מערבבים היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה.
    6. להוסיף 300 μl של התערובת מדוללת היטב כל אחד. דגירה של 2-4 שעות ב37 ° C, חממה 5% CO 2.
    7. הסר פתרון transfection ולהוסיף 500 μl של FCS / 9% DMEM. דגירה של 24-48 שעות ב37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור לפני גירוי תא.
  2. חלבון / transfection מבוסס polyamine:
    1. לחמם את הסרום ללאבינוני וFCS / 9% DMEM 37 ° C.
    2. להוסיף 0.75 μl של מגיב transfection ל18.75 μl של מדיום סרום ללא. בקצרה מערבולת לערבב. לדגור על RT במשך 5 דקות. הוסף 0.5 μl של 1 מיקרוגרם / μl DNA לדילול מגיב transfected. לדגור על RT במשך 10 דקות.
    3. במהלך הדגירה 10 דקות, להסיר את התקשורת מכל טוב של הצלחת 24 גם ולהוסיף 250 μl FCS / 9% DMEM הטרי היטב כל אחד.
    4. לאחר 10 דקות, להוסיף 250 μl של FCS / 9% DMEM לתוך התערובת מגיב / DNA.
    5. להוסיף 270 μl של התערובת מדוללת לטוב. דגירה 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור 2 - 4 שעות.
    6. הסר פתרון transfection ולהוסיף 500 μl של FCS / 9% DMEM. דגירה של 24-48 שעות ב37 ° C, חממה 5% CO 2.

4. גירוי תא וAssay בלוציפראז

  1. החלף תקשורת בהיטב עם 250 μl של FCS / 9% DMEM הטרי.
  2. הוסף 50 μl של LPS או LPS + IL-10 בריכוזים הרצויים לטוב. להחזיר את הצלחת לC ° 37, חממת 5% CO 2. לעורר ל2-6 שעות.
  3. הסר פתרון גירוי על ידי שאיפה, לשטוף עם קרח הקר PBS, ולהוסיף 200 μl של 1x פסיבי תמוגה הצפת. רוק בRT למשך 30 דקות. לגרד ולהעביר את lysate לצינורות 1.5 מיליליטר ולהסיר פסולת תא על ידי צנטריפוגה ב -20,000 XG במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
  4. העברה 40 μl של lysate פינה (supernatant) לצלחת לבנה, ברורה תחתונה 96-גם לקביעת אותות לוציפראז על פי הפרוטוקול של היצרן.
  5. קראו את האות בלוציפראז עם luminometer פני כל ספקטרום האור הנראה.

ניתוח נתונים 5.

  1. לחשב את הגחלילית: יחס Renilla ידי חלוקת ערכים אישיים של לוציפראז גחלילית על ידי הערכים של לוציפראז Renilla מכל טוב.
  2. לחשב את שינוי הקיפול על ידי חלוקת גחלילית: יחס Renilla של מטופלים היטב על ידיכי הבאר שלא טופלה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

איור 1 משווה את יעילות transfection של שני ריאגנטים transfection בRAW264.7. מגיב השומנים מבוססי בדרך כלל נתן שיעור transfection כ -25% ואילו transfection מבוסס polyamine חלבון / הביא כ -5% יעילות (איור 1 א). ההבדל ביעילות transfection נצפה גם באותות בלוציפראז בתאי RAW264.7 transfected עם כתב אמרגן pGL3-IκBζ (איור 1). תוספת של LPS לתאי transfected אלה הגדילה את אות גחלילית בלוציפראז, אינדיקציה ישירה של פעילות שעתוק המוגברת של כתב א...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הפרוטוקול מתואר כאן אינו אך ורק להתמקד ביעילות transfection, אבל מטרתו לאזן בין היעילות ושימור של המדינות הפיזיולוגיות של התאים. באופן ספציפי, ההליך שלנו מצליח למזער את הרעילות של מגיב transfection ולמקסם את האות בלוציפראז.

שלב קריטי אחד בפרוטוקול הוא הבריאות של התאים. תרבויות פרא אינן מתאימות לtransfection שינוייהם הפיסיולוגיה, וculturing הרציף של תאי RAW264.7 לתקופה ארוכה של זמן יכול גם לשנות את הפנוטיפ ותפקוד ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

יש המחברים אין לחשוף.

תודות

מחקר זה מומן על ידי מענק של המכונים הקנדיים לחקר הבריאות (CIHR). STC מחזיקה בפרס מחקר לדוקטורט מה-CIHR וקרן מייקל סמית'. EYS מחזיקה במלגת CIHR. תוכנית ההכשרה להשתלות CIHR סיפקה גם מלגות לתארים מתקדמים ל-STC, EYS ו-SS.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
PureLink HiPure Plasmid Maxiprep KitLife TechnologiesK210007כל ערכת maxiprep תעבוד
פנול: כלורופורם: אלכוהול איזואמילLife Technologies15593-049כיתה ביולוגיה מולקולרית. פנול רעיל אז עבדו במכסה האדים, אם אפשר. השתמש בשכבה האורגנית השקופה התחתונה אם נוצרות שתי שכבות של נוזל במיכל.
DMEMThermo ScientificSH30243.01חם ב-37 מעלות; C אמבט מים לפני השימוש.
סרום בקר עובריThermo ScientificSH30396.03מושבת ב-56 מעלות; C אמבט מים למשך 45 דקות לפני השימוש.
Opti-MEMLife Technologies31985-070יש לחמם לטמפרטורת החדר לפחות לפני השימוש.
מגיב טרנספקציה XtremeGene HP DBARoche6366236001יש לחמם לטמפרטורת החדר לפני השימוש.
GeneJuiceEMD Millipore70967יש לחמם לטמפרטורת החדר לפני השימוש.
5x מאגר ליזה פסיביPromegaE194130 מ"ל כלול במערכת הבדיקה Dual Luciferase Reporter
הבדיקה Dual Luciferase ReporterPromegaE1910
מערכת

מקורות

  1. Maurisse, R., et al. Comparative transfection of DNA into primary and transformed mammalian cells from different lineages. BMC Biotechnol. 10 (1), 9-18 (2010).
  2. Thompson, C. D., Frazier-Jessen, M. R., Rawat, R., Nordan, R. P., Brown, R. T. Evaluation of methods for transient transfection of a murine macrophage cell line RAW 264.7. Biotechniques. 27 (4), 824-835 (1999).
  3. Kim, T., Eberwine, J. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).
  4. Stacey, K. J., Sweet, M. J., Hume, D. A. Macrophages ingest and are activated by bacterial DNA. Journal of immunology. 157 (5), 2116-2122 (1996).
  5. Jiang, W., Reich, I. C., Pisetsky, D. S. Mechanisms of activation of the RAW264.7 macrophage cell line by transfected mammalian DNA. Cell Immunol. 229 (1), 31-42 (2004).
  6. Jiang, W., Pisetsky, D. S. The induction of HMGB1 release from RAW 264.7 cells by transfected DNA. Mol Immunol. 45 (7), 2038-2046 (2008).
  7. Hargreaves, D. C., Horng, T., Medzhitov, R. Control of inducible gene expression by signal-dependent transcriptional elongation. Cell. 138 (1), 129-147 (2009).
  8. Cheung, S. T., So, E. Y., Chang, D., Ming-Lum, A., Mui, A. L. Interleukin-10 inhibits lipopolysaccharide induced miR-155 precursor stability and maturation. PLoS One. 8 (8), e71336(2013).
  9. Weber, M., Moller, K., Welzeck, M., Schorr, J. Short technical reports. Effects of lipopolysaccharide on transfection efficiency in eukaryotic cells. Biotechniques. 19 (6), 930-940 (1995).
  10. Berghaus, L. J., et al. Innate immune responses of primary murine macrophage-lineage cells and RAW 264.7 cells to ligands of Toll-like receptors. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 33 (5), 443-456 (2000).
  11. Fiszer-Kierzkowska, A., et al. Liposome-based DNA carriers may induce cellular stress response and change gene expression pattern in transfected cells. BMC Mol Biol. 12 (1), 27-36 (2011).
  12. Jacobsen, L., Calvin, S., Lobenhofer, E. Transcriptional effects of transfection: the potential for misinterpretation of gene expression data generated from transiently transfected cells. Biotechniques. 47 (7), 617-626 (2009).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

הליך טרנספקציהריאגנט מבוסס ליפידיםריאגנט מבוסס פוליאמיןלוציפראז של גחליליותלוציפראז של רנילהליזיס של תאיםבדיקת לומינומטרציטומטריית זרימה
Transfecting תאי RAW264.7 עם לוציפראז כתב ג'ין
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.