משלוח חלבון ישיר לשימוש בתאי יונקי Cys Cell-חדיר<sub&gt; 2</sub&gt; כלי-<sub&gt; 2</sub&gt; Domains אבץ האצבע

Thomas Gaj; Jia Liu

doi:10.3791/52814

הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

משלוח חלבון ישיר לשימוש בתאי יונקי Cys Cell-חדיר

9.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/52814

⸱

25 במרץ 2015

Thomas Gaj^*¹ , Jia Liu^*¹^,²

¹Departments of Chemistry and Cell and Molecular Biology, The Scripps Research Institute, ²Shanghai Institute for Advanced Immunochemical Studies, ShanghaiTech University

^* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

תחומים אבץ אצבע הם מיסוד תא חדיר ומסוגל תיווך משלוח חלבון למגוון רחב של סוגי יונקים תא. כאן, פרוטוקול צעד-אחר-צעד מפורט ליישום טכנולוגית אבץ-אצבע למסירת חלבון תאית מוצג.

תקציר

בשל המודולריות שלהם ויכולתם להיות מתוכנתים מחדש לזהות מגוון רחב של רצפי DNA, תחומי קשירת ה-DNA של Cys_2-His _{2-His 2} התגלו ככלים שימושיים להנדסת גנום ממוקדת. כמו חלבונים רבים אחרים קושרי DNA, גם לאצבעות אבץ יש את היכולת המולדת לחצות את קרומי התאים. לאחרונה הוכחנו כי ניתן למנף את חדירות התאים הפנימית הזו לאספקת חלבון תוך תאי. היתוך גנטי של מוטיבים של אצבעות אבץ מוביל להובלה יעילה של מטען חלבון ואנזים למגוון רחב של סוגי תאי יונקים. בניגוד לטכנולוגיות אחרות של העברת חלבונים, אספקה דרך תחומי אצבע אבץ אינה מעכבת את פעילות האנזים ומובילה לרמות גבוהות של אספקה ציטוזולית. כאן מוצג פרוטוקול מפורט שלב אחר שלב ליישום טכנולוגיית אצבע אבץ להעברת חלבון לתאי יונקים. מודגשים צעדים מרכזיים להשגת רמות גבוהות של אספקה תוך-תאית בתיווך אצבע אבץ ונדונות אסטרטגיות למקסום הביצועים של מערכת זו.

מבוא

מאוד אסטרטגיות אספקת החלבון יעילה ותכליתיות הן קריטיות למחקר בסיסי ויישומים רבים טיפוליים. המשלוח הישיר של חלבונים מטוהרים לתאים מייצג את אחד מהשיטות הבטוחות ביותר והקלה ביותר להשגת מטרה זו. בניגוד ^ל1,2 אסטרטגיות המסתמכות על ביטוי גנים מחומצות גרעין, ^3-5 משלוח החלבון אינו מהווה סיכון של mutagenesis insertional, אינו תלוי ב שעתוק / מכונות תרגום וסלולרי מאפשר לתוקף באופן מיידי. עם זאת, חוסר שיטות פשוטות ולהכליל למעניקים פעילות חודרת תאים על חלבונים מבלבל באופן שגרתי הכניסה הישירה שלהם לתאים. שיטות קיימים להקלת משלוח חלבון תאית המבוססות על השימוש באופן טבעי ^6-8 או תוכנן פפטידים חודרים-תא, ^9-12....