תאי יונקים רבים מעדיפים לנדוד לעבר מטריצה או מצע נוקשה יותר באמצעות דורוטקסיס. מטרת פרוטוקול זה היא לספק מערכת חוץ גופית פשוטה שניתן להשתמש בה כדי לחקור ולתפעל התנהגויות דורוטקסיס של תאים על ידי שילוב מצעי פולידימתילסילוקסן (PDMS) בעלי קשיחות מוגדרת, המתממשקים עם כיסויי זכוכית.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מערכת פשוטה לסלולרי הערכת Mechanosensing וDurotaxis
במאמר זה
סיכום
תקציר
מאפייני הרכב ומכאני של מטריקס הם משתנה מאוד בין סוגי רקמות. גיוון זה חיבור סטרומה הרקמה מאוד תא השפעות התנהגות להסדיר תהליכים נורמלים ופתולוגיים כוללים התפשטות תאים, התמיינות, איתות הידבקות והגירה כיוונית. בהקשר זה, היכולת המולדת של סוגים מסוימים של תאים לנדוד לכיוון מצע מטריצה נוקשה, פחות או תואם נקרא durotaxis. תופעה זו ממלאת תפקיד חשוב בהתפתחות עוברית, תיקון פצע ופלישה של תאים סרטניים. כאן אנו מתארים assay פשוט ללמוד durotaxis, במבחנה, באמצעות polydimethylsiloxane מצעים (PDMS). הכנת תאר durotaxis תאים יוצרת ממשק בין נוקשות ג'ל PDMS הרך יחסית וcoverslip זכוכית נוקשה. בדוגמא בתנאי, השתמשנו תאי durotaxis אלה להפגין תפקיד לCdc42 הגנה של מחזור / Rac1 GTPase הפעלהב, cdGAP, בmechanosensing וdurotaxis רגולציה בתאי אוסטאוסרקומה U2OS אנושיים. assay זה הוא בקלות להתאמה לסוגי תאים אחרים ו / או מציאה של חלבונים אחרים של אינטרסים לחקור התפקידים שלהם בmechanosignaling וdurotaxis.
מבוא
מטריקס (ECM) מורכב ממערך מורכב של חלבונים מבניים וcrosslinking כולל קולגן, פיברונקטין וlaminin. למרות שזה מבוסס היטב כי ECM מספק תמיכה מבנית חשובה לרקמות סלולריות, יש ראיות גוברים למצביעות על כך שתאים באופן פעיל להגיב לשינויים פיזיים בסביבת ECM להסדיר תהליכים תאיים שונים כולל הישרדות תא, התמיינות ונדידת תאים. לדוגמא, הבדלים בקשיחות של ECM יכולים לנהוג בתאי גזע mesenchymal כלפי שושלות שונות, עם מצעים רכים (~ 1 kPa) קידום שושלות עצביות בעוד מצעים נוקשה (~ 25 kPa) לקדם בידול osteogenic 1. כמו כן, עלייה בקשיחות מטריצת סטרומה הוכחה לקדם tumorigenesis החלב אפיתל תאים ופלישה ל2,3 הרקמה הסובב.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הכנת לשכות Durotaxis
- כדי להכין צלחת תרבית רקמת 6-גם אחד, הטרה האיזון עם צינור חרוטי 50 מ"ל. לשקול את כ -10 גרם של פתרון PDMS הבסיס בצינור 50 מ"ל (הפתרון הוא די צמיג).
- ל90: מצע 1 (Compliance של ~ 1 kPa), לחלק את המשקל שנמדד של פתרון בסיס PDMS בצינור ב -90 כדי לקבוע את הסכום הנכון של פתרון crosslinker צורך. מוסיף את הכמות המחושבת של פתרון crosslinker PDMS לאותו צינור.
לדוגמא: 10 גר '/ 90 = 0.11 גרם. להוסיף 0.11 גרם של פתרון crosslinker PDMS לפתרון בסיס PDMS.
הערה: פתרונו....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
סכמטי של תא durotaxis מוצג באיור 1 א. מצע PDMS רך (90: תערובת 1 של בסיס PDMS לcrosslinker פתרונות) היא להפיץ בצלחת 6 היטב וcoverslip זכוכית מונח על גבי PDMS, אשר לאחר מכן באופן חלקי מכסה את פני השטח העליונים של coverslip, ובכך ליצור ממשק בין שני מצעים של ציות שונה. הקשיחות של מצע PDMS הרך היא ~ 1 kPa, אשר ניתן להשוות העמידה הטיפוסית של רקמת המוח, ואילו את הנוקשות של זכוכית היא סביב 1-2 1 GPA. תמונה בניגוד שלב של הממשק בין PDMS והזכוכית מוצגת על ידי ראשי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
במסמך זה אנו מתארים assay פשוט ללמוד durotaxis בתאים נודדים. כוח עיקרי של assay זה הוא הקלות של הכנת תאי durotaxis באמצעות PDMS. הנוקשות של מצעים ניתן להשפיע בקלות על ידי שינוי היחס של פתרון בסיס PDMS לcrosslinker כדי לאפשר המחקר של קשיחויות שונות בassay. עם זאת, הגבלת פוטנציאל אחד של המערכת היא שתאים נחשפים רק לשינוי יחיד בקשיחות מצע בניגוד לחווה שיפוע נוקשות המסופק על ידי מערכות מתוחכמות יותר 4. חשוב לציין, שלא כמו מצעי polyacrylamide, רכיבי ECM לא צריכים להיות כימי צ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין קונפליקטים לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכת על ידי NIH R01 GM47607, CA163296 וNSF 1,334,493 למטח. אנו מודים לחברי המעבדה טרנר לקריאה ביקורתית של כתב היד. כל הנתונים שמוצגים בדוח זה היו מיוצרים באישור וורמר et al. 2,014 11.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| פולידימתילסילוקסן (PDMS) | Dow Corning | 3097358-1004 | Sylgard 184 ערכת אלסטומר סיליקון |
| #1 כיסוי זכוכית 12 מ"מ | פישר סיינטיפיק | 12-545-82 | |
| צלחת 6 בארות | Celltreat | 229106 | |
| DMEM | Cellgro | 15-017-CM | |
| L-גלוטמין | Cellgro | 25-005-CI | |
| נתרן Pyruvate | Fisher Scientific | BP356-100 | |
| פניצילין/סטרפטומיצין | Cellgro | 30-002-CI | |
| פיברונקטין | BD Biosciences | 610077 | |
| PBS | Invitrogen | 21600-044 | |
| שפופרות בז | Celltreat | 229456 | |
| סרום בקר עוברי | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| סרום בקר אלבומין | סיגמא | A7906 | |
| תאי U2OS | ATCC | HTB-96 |
מקורות
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
- Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
- Levental, K. R., <....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
