הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

יישום הצמד תיקון והחי מיקרוסקופ פלואורסצנטי לפקח על מאפיינים פונקציונליים של מבודד טרי PKD האפיתל

9.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/53035

⸱

1 בספטמבר 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, Medical College of Wisconsin, 2Department of Integrative Biology & Pharmacology, University of Texas Health Science Center at Houston

במאמר זה

סיכום

תעלות יונים מתבטאות באפיתל צינורי הכליות לשחק תפקיד משמעותי בפתולוגיה של מחלת כליות פוליציסטיות. כאן אנו מתארים פרוטוקולי ניסוי המשמשים לביצוע מדידות וניתוח רמת סידן תוך תאי תיקון מהדק באפיתל פיברוזיס המבודדים טרי מכליות מכרסמים.

תקציר

ייזום ציסטה והתרחבות במחלת כליות פוליציסטיות הוא תהליך מורכב המתאפיין בהפרעות בשגשוג תאי צינורי, הצטברות נוזלים והיווצרות luminal מטריקס. פעילות של תעלות יונים ואיתות סידן תוך תאי פרמטרים פיסיולוגיים מפתח הקובעים פונקציות של האפיתל צינורי. אנחנו פיתחנו שיטה מתאימה לתצפית בזמן אמת של פעילות תעלות יונים עם טכניקת תיקון מהדק ורישום של Ca 2 + רמה תאית בmonolayers אפיתל המבודדים טרי מציסטות כליות. חולדות PCK, מודל גנטי של מחלה אוטוזומלית רצסיבית פוליציסטיות כליות (ARPKD), שמשו כאן לניתוח vivo לשעבר של תעלות יונים ושטף סידן. שתואר כאן הוא הליך צעד-אחר-צעד מפורט שנועד לבודד את monolayers פיברוזיס וצינוריות-מורחב שאינם מPCK או חולדות נורמליות ספראג Dawley (SD), ולעקוב אחר פעילות ערוץ אחד וCa 2 + דינמיקה תאית.שיטה זו אינה דורשת עיבוד האנזימטית ומאפשרת ניתוח בהגדרת יליד monolayer אפיתל מבודד טרי. יתר על כן, טכניקה זו היא רגישה מאוד לשינויי סידן תוך תאי ויוצרת תמונות ברזולוציה גבוהות למדידות מדויקות. לבסוף, האפיתל פיברוזיס המבודד יכול לשמש עוד לצביעה עם נוגדנים או צבעים, הכנת תרבויות עיקריות וטיהור למבחנים ביוכימיים שונים.

מבוא

תעלות יונים לשחק תפקיד משמעותי בהרבה פונקציות פיסיולוגיות, כוללים צמיחת תאים והתמיינות. מחלות אוטוזומלית דומיננטיות ורצסיבי פוליציסטיות כליות (ADPKD וARPKD, בהתאמה) הן הפרעות גנטיות המתאפיינות בפיתוח של שלפוחיות מלאות נוזל כליות של מקור תאי אפיתל צינורי. ADPKD נגרמים על ידי מוטציות של גני PKD1 או PKD2 קידוד polycystins 1 ו -2 חלבונים, קרום מעורב בוויסות של התפשטות תאים והתמיינות. PKD2 על ידי עצמו או כמורכב עם PKD1 גם לתפקד כערוץ קטיון -permeable Ca 2 + 1. מוטציות של fibrocystin PKHD1 גן המקודד (חלבון כמו קולט-הקשורים cilia המעורב בtubulogenesis ו / או התחזוקה של קוטביות של אפיתל) הן הדחף הגנטי של ARPKD 2. צמיחת ציסטה היא תופעה מורכבת בליווי התפשטות מופרעת 3,4, אנגיוגנזה 5, dedifferentiation ואובדן הקוטבity של תאי צינורי 6-8.

ספיגה פגומה והפרשה מוגברת באפיתל פיברוזיס לתרום להצטברות נוזלים בהרחבת הלום וציסטה 9,10. זרימה תלויה פגום [Ca 2 +] איתות אני כבר קשור גם לcystogenesis במהלך PKD 11-15.

כאן, אנו מתארים שיטה מתאימה למדידות תיקון מהדק של פעילות ערוץ אחד וCa 2 + רמות תאיות בmonolayers אפיתל פיברוזיס מבודד מחולדות PCK. שיטה זו יושמה בהצלחה על ידינו לאפיין פעילות של ערוץ אפיתל Na + (ENaC) 10 ו[ Ca 2 +] אני -dependent תהליכים הנגרמים על ידי Ca 2 + TRPV4 -permeable ומפל איתות purinergic 13.

במחקרים אלה השתמשנו חולדות PCK, מודל של ARPKD נגרמים על ידי מוטציה ספונטנית בגן PKHD1. זן PCK היה originally נובע מSprague-Dawley (SD) חולדות 16 חולדות ובכך SD משמשות כבקרה נאותה להשוואה עם מתח PCK. כתוצאה מכך, שני מגזרי SD עכברוש נפרון וצינורות איסוף מורחב שאינם מבודדים מאותו חולדות PCK יכולים לשמש כשתי קבוצות השוואה שונות לניסויים באפיתל פיברוזיס.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הפרוצדורות המתוארות להלן אושרו על ידי ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים בבית הספר לרפואה של ויסקונסין ואוניברסיטת מרכז מדע בריאות טקסס ביוסטון והיו בהתאם למכונים הלאומי לבריאות מדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה. איור 1 מדגים את שלבים עיקריים של בידוד הרקמות והליך עיבוד. בקצרה, כליות מחולדות PCK או SD משמשות לבידוד ידני של monolayers אפיתל של איסוף צינורות או מצינוריות-חייג אינן בריאה או ציסטות. כאן למדנו כליות 4-16 שבועות חולדות PCK ישנים 10,13.

1. צינוריות מגזרי בידוד של ציסטות בכליות וקשיות חיבור (CNT) / איסוף (CD)

  1. להרדים בעלי חיים ניסיוניים עם isoflurane (אינדוקציה 5%, 1.5 עד 2.5% אחזקה) / O כיתה רפואי 2 או שיטה שאושרה עוד. בעלי חיים חייבים להיות במעקב רציף על מנת להבטיח le ההולםvel של הרדמה. תגובת קמצוץ שיעור ובוהן נשימה יציבה משמשות כדי לאשר הרדמה מתאימה.
  2. בצע laparotomy ולשטוף את הכליות עם מי מלח פוספט (PBS) דרך אב העורקים בבטן 17.
    1. הכן קטטר צינורות פוליאתילן (PE50) ולחבר אותו למשאבת מזרק מלאה PBS. חותך את העור וקיר בטן לאורך Linea alba, ואז לעשות חתך רוחבי בבטן פני הבטן מצד לצד ולהעביר את אברי בטן עם צמר גפן כדי לקבל גישה לאב העורקים היורדים עם הסתעפות עורקי mesenteric וצליאק. להרטיב את האיברים הפנימיים עם מי מלח חם במהלך הליכים נוספים כדי למנוע היובש שלהם.
    2. הנח מייתר אחד (מס '1) סביב עורקי mesenteric וצליאק ומייתר אחר (מס' 2) סביב אב העורקים מתחת לסרעפת (לא לקשור). בעדינות להפריד. abdominalis ידי להקהות לנתח רקמות חיבור סביבו עם מלקחיים דקים ומניח את שני חיבורים אותיות ~ 3מ"מ מתחת לעורק הכליה השמאלי (# 3) ומעל הסתעפות עורקי הכסל (מס '4).
    3. לקשור # מייתר 4 ולצרף מהדק כלי סביב אב העורקים בין עורק הכליה השמאלי ומייתר # 3. עושה חתך בין המהדק ו# מייתר 4 לצנתר את אב העורקים, להשתמש מייתר # 3 כדי לתקן את הצנתר בתקיפות.
    4. שחרר את המהדק ולוודא כי דופק הדם גלוי בקטטר כדי להבטיח התקנה נכונה. התחל זלוף בשיעור של 6 מיליליטר / דקה, לקשור ליגטורה # 1 ומס '2, ולחתוך את וריד הכליה השמאלי. המשך שטיפה במשך 1-2 דקות, עד שהאיברים החווירו לחלוטין.
    5. חותכים כלי דם כליות, שופכה ורקמות חיבור ושומן סביב במספריים כדי לאסוף את הכליות. לאחר מכן לבצע דמעה קצרה בכמוסה בכליות ולקלף את הכליות לdecapsulate. מניחים את הכליות לPBS קר כקרח. המתת חסד הוא אושר על ידי פתיחת בית החזה.
  3. הכן 5 X 5 שבבי זכוכית כיסוי מ"מ מצופים בפולי-L ליזין. לחתוך בשטח בנוי כיסויss עם עיפרון יהלומים ומקום כ 20 μl של 0.01% פתרון פולי-L ליזין מסונן סטרילי על כל שבב זכוכית. הכן מלוח ושני זוגות מלקחיים שען לנתיחה.
  4. חותך את הכליות בסכין גילוח במישור הקדמי לפרוסות של ~ 1-2 מ"מ עובי. מניחים את הפרוסות אחת תחת סטראו. בידוד של רקמות צריך להיעשות במלוח קר כקרח.
  5. אתר ציסטות תחת סטראו כחללים עגולה צורה (איור 2 א); הקירות שלהם לעתים קרובות מכילים רשת בולטת של כלי דם התרבו. קצו מלקחיים העדין באמצעות לנתח את שכבת האפיתל הפנימית של ציסטה דקה ככל האפשר כדי להשיג שטח שכבה. לצרף אותו לשבב זכוכית מכוסה בפולי-L ליזין. משטח פולי-L ליזין דביק מאפשר לחוקר למקם את שכבת ציסטה הפנימית על זכוכית בחוזקה. לחשוף את ציסטה עם הצד עד הפסגה כדי לספק גישה לטפטפות (איור 2).
  6. השתמש בילד PCK או החולדה SDפרוסות מרכזיות ניי מכילות papilla לבידוד של CNT / CCDsegments אינו מורחב 18-21.
    הערה: רקמות papillary הן עמידות יותר מקליפה ועל ידי החזקת להקות צינורי פפילרי עם מלקחיים וקריעות רדיאלי ציר פרוסה ניתן ביקעו לדק מגזרים. tubules פרט גלוי ויכול להיות שלף להיות ממוקם על שבבי זכוכית כיסוי.
  7. זהה את מגזרי CNT / CCD ידי הסתעפויות, שקיפות גבוהה מצינוריות הפרוקסימלי ותאים גדולים בולטת לעין (איור 2 ג). מניחים את שבב מכסה זכוכית עם צינוריות המצורפות תחת מיקרוסקופ מצויד בmicromanipulators המתאימה לנהיגת micropipettes. שימוש micropipettes החד tubules מפוצל פתוח ולצרפם לקצות הזכוכית כדי להפוך את משטח הפסגה נגיש (איור 2 ד).

אלקטרופיזיולוגיה 2. ערוץ יחיד תיקון מהדק

  1. למלא את תא תיקון- clamp עם פתרון אמבטיה ולהעביר את שבב מכסה הזכוכיתעם רקמות מבודדות לתא. ודא שיש לי micropipettes תיקון מהדק התנגדות של 7-10 MΩ למדידות אמינות בתאים (מצורף תא).
  2. למדידות מצורפים תא, להגדיר את יחס רווח המגבר ל20x ונמוך לעבור הזרמים ב 300 הרץ על ידי מסנן שמונה-מוט בסל. לניטור ערוצי ENaC, להשתמש בפתרון אמבטיה, במ"מ: 150 NaCl, 1 CaCl 2, 2 MgCl 2, 10 HEPES (pH 7.4); פיפטה: 140 LiCl, 2 MgCl 2 ו -10 HEPES (pH 7.4).
  3. לנהל ניסוי תיקון- clamp קונבנציונלי במצב 10-מצורף תא. בחר תא בשכבת האפיתל ומתקרב לפיפטה קרום הפסגה. ליצור חותם גבוהה התנגדות בין פיפטה וקרום תא על ידי יישום שאיבה עדינה. ברגע שחותם gigaOhm עמיד גבוהה נוצר, פרוטוקול ללא פער בפוטנציאל החזקה יש להתחיל לפעילות ניטור של הערוץ של עניין.
  4. נתונים חנות פער ללא יחידים ערוץ הנוכחי מגיגהחותמות אוהם לניתוח שלאחר מכן. לנתח את אירועי הערוץ באמצעות חבילת תוכנה בדרך כלל מסופקת עם הגדרות תיקון מהדק 18. חישוב פעילות ערוץ כעמותה שבי N מתייחס למספר הערוצים הפעילים בo התיקון וP היא הסתברות פתוחה ממוצעת של הערוצים.
    הערה: השתמש בציסטות או צינוריות בודדות בניסויי תיקון מהדק לא יותר מ -30 דקות.

3. מדידות ratiometric epifluorescence של ריכוז סידן תוך תאים בתאי אפיתל

  1. השתמש 5 מ"מ פורע-2:00 מומסים DMSO. פתרון מניות Aliquot לתוך צינורות חרוטי 500 μl בודדים (כ -10 μl). להגן מפני אור ולאחסן במקפיא ב -20 מעלות עד שישה חודשים.
  2. דגירה ציסטות מבודדות וtubules המפוצל פתוחה במשך 30-40 דקות בPSS (מ"מ: 145 NaCl, 4.5 KCl, 2 MgCl 2, 2 CaCl 2 ו -10 HEPES ב- pH 7.35) המכיל 5 מיקרומטר צבע פורע-2 בבוקר ו0.05% חומצת pluronic כדי לעזור לפזר את אסטרים acetoxymethyl. לשם כך, רקמות מקום בצלחת 3.5 סנטימטר המכילות קוקטייל טעינה, להגן מפני אור ודגירה על שייקר איטי בטמפרטורת חדר.
  3. לשנות פורע-2:00 מכיל תקשורת לנקות PSS לאחר דגירה ולמקם את הרקמה תחת מיקרוסקופ כדי לבצע הדמיה epifluorescence נוסף.
  4. הפעל מצלמת CCD ומקור יציב אור (מערכת monochromator) מצויד בגלגל מסנן (כל עמדת מסנן יכולה להיות קשורה לרמה שלו הנחתה, שנבחרה בכל פעם שהמסנן נקרא).
  5. מצא את הרקמה בשדה בהיר. לעבור לזיהוי של אותות הקרינה ולהתאים את עוצמת מקור האור באמצעות מסנני צפיפות ניטראליים ומנורת כוח כדי למנוע הרוויה של האות.
  6. צג הפורע-2 הקרינה בבוקר בדגימת הרקמה עם עירור ratiometric בננומטר 340/380 בתדירות של 0.125 הרץ ומעלה. השתמש 40 × / עדשה אובייקטיבית NA 1.3 או דומה לresolu הנכוןתמונת tion.
  7. לעיבוד תמונה וחישובים לייבא תמונה ברצף. ודא לפצל את הערוצים ולהשתמש בגווני אפור מצב hyperstack. בחר כמה אזורים של עניין (תאי ציסטה בודדת או אזורים נבחרים של רקמת פיברוזיס) ולחשב ערכי עוצמה לכל ערוץ (340 ו -380 ננומטר) לתוך תוכנת ניתוח נתונים העדיפה; ערכי עוצמת רקע לחסר מכל נקודת נתונים.
  8. עבור כל נקודת זמן לחשב את היחס של עוצמות של 340-380 ערוצי הפורע-2 בבוקר. פיזור עלילה / קו שינויי נקודה-זמן של חולף Ca 2 + לכל איזור ולחשב ערכים / SE ממוצעים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

מעורבות ENaC פוטנציאלית בcystogenesis הודגמה על ידי מספר מחקרים שנצפו גורם גדילה באפידרמיס שיבש (EGF) איתות בהתקדמות PKD 22-25 וספיג החוזר של סודיום חריג בARPKD מודלים עכברי ותרביות רקמת 26-28. לדוגמא, Veizis et al. הראה כי קליטת amiloride רגישה Na + היא ירידה בתאי CD ממודל העכבר הלא-orthologous BPK של ARPKD 29. אנחנו הוכחנו לאחרונה כי נתרן לקוי וספיגת מים בציסטות הוא גורם חשוב בהחמרת cystogenesis 10. באופן ספציפי, אנ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

שתארנו כאן יישומים של טכניקת תיקון- clamp הקונבנציונלית וסידן הדמיה epifluorescence לmonolayers אפיתל פיברוזיס נגזר ממודל גנטי בעכברים של ARPKD. הפרוטוקול מורכב משלושה שלבים, שרוב תשומת הלב צריך להיות משולם על הבידוד של ציסטות (שלב 1.5 של סעיף הפרוטוקולים) ומחקרי אלקטרו. נהלי מפתח אלה דורשים אימון וסבלנות רבים, והקורא לא צריך להיות מתוסכל ובעונה אחת.

קודם כל, את עיקר תשומת הלב צריך להיות משולם על התהליך של בידוד ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

המחברים מבקשים להודות לגלן סלוקום (ספר לרפואה של ויסקונסין) וקולין א לאבין (מכשירי Nikon Inc) לקבלת סיוע טכני מעולה עם ניסויים במיקרוסקופ. מחקר זה נתמך על ידי המכון הלאומי לבריאות מעניקים R01 HL108880 (לAS), R01 DK095029 (לOPO) וK99 HL116603 (לכפית), קרן הלאומית לכליות IG1724 (לכפית), איגוד לב האמריקאי 13GRNT16220002 (לOPO) ו בן ג 'יפס מחקר המלגה מהאגודה האמריקנית לנפרולוגיה (ל- DVI).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Fura-2 AMLife TechnologiesF-14185
Fluo-8AAT Bioquest21091
פולי-L-ליזיןסיגמא-אולדריץ'P4707
חומצה פלורוניתסיגמא-אולדריץ'F-68 תמיסה
ShakerBoekel Scientific260350
מקור אורSutter Instrument CoLambda XLעם נהג גלגל תריס/פילטר משולב
מסנני צפיפות ניטרליתNikonND4, ND8
ObjectiveNikonSFluo 40/1.3 DIC WD 0.22   
מצלמתשמן Andor TechnologiesZyla sCMOS
Nikon  מיקרוסקופ (הפוך)Nikon Nikon Eclipse TE2000-S
כיסוי זכוכיתThermo Scientific6661B52
עיפרון יהלוםFisher Scientific22268912
תוכנת רכישת תמונותNikon NikonNIS-Elements 
תוכנת ניתוח תמונותImageJhttp://imagej.nih.gov/ND Utility plugin מאפשר לייבא תמונות בפורמט המקורי של Nikon Instruments .nd2
תא הקלטה/זלוףמגבר Warner InstrumentsRC-26
Patch ClampDevices Molecular DevicesMultiClamp 700B
Data Acquisition Systemהתקנים מולקולרייםDigidata 1440AAxon Digidata® מערכת
מסנן מעבר נמוךוורנר אינסטרומנטסLPF-88 מוט בסל
בורוסיליקט נימי זכוכיתדיוק עולמיים1B150F-4
חולץ מיקרופיפטהSutter Instrument CoP-97חולץ מיקרופיפטה מסוג בוער / חום
MicroforgeNarishigeMF-830יפן
מיקרומניפולטורממונעSutter Instrument CoMP-225
מיקרוסקופ הפוךNikonEclipse Ti
שולחן בידוד מיקרו-רטטTMCמצויד בכלוב פאראדיי
מערכת זלוף שסתומים רב-ערוציתAutoMake ScientificValve Bank II
תא הקלטה/זלוףתוכנת Warner InstrumentsRC-26
מכשירים מולקולרייםpClamp 10 . 2
שולחן כירורגי מבוקר טמפרטורה ליבתלמכרסמים
סטריאומיקרוסקופ דו-עיניNikonSMZ745
מערכת זלוף מבוססת משאבת מזרקמכשירי
צינורות פוליאתילןSigma-AldrichPE50
הרדמה איזופלואורןhttp://www.vetequip.com/911103
ריאגנטים בסיסיים אחריםסיגמא-אולדריץ'
מכשירי MCW הרווארד

מקורות

  1. Torres, V. E., Harris, P. C., Pirson, Y. Autosomal dominant polycystic kidney disease. Lancet. 369 (9569), 1287-1301 (2007).
  2. Zhang, M. Z., et al. PKHD1 protein encoded by the gene for autosomal recessive polycystic kidney disease associates with basal bodies and primary cilia in renal epithelial cells. Proc. Nat. Acad. Sci U.S.A. 101 (8), 2311-2316 (2004).
  3. Chang, M. Y., et al. Haploinsufficiency of Pkd2 is associated with increased tubular cell proliferation and interstitial fibrosis in two murine Pkd2 models. Nephrol. Dial. Transpl. 21 (8), 2078-2084 (2006).
  4. Park, F., Sweeney, W. E., Jia, G., Roman, R. J., Avner, E. D. 20-HETE mediates proliferation of renal epithelial cells in polycystic kidney disease. J. Am. Soc. Nephrol. 19 (10), 1929-1939 (2008).
  5. Huang, J., Woolf, A., Long, D. Angiogenesis and autosomal dominant polycystic kidney disease. Ped. Nephrol. 28 (9), 1749-1755 (2013).
  6. Wilson, P. D. Apico-basal polarity in polycystic kidney disease epithelia. Bioch Biophys Acta. 1812 (10), 1239-1248 (2011).
  7. Wilson, P. D. Epithelial cell polarity and disease. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 272 (4 Pt 2), F434-F442 (1997).
  8. Wilson, P. D., et al. Reversed polarity of Na(+) -K(+) -ATPase: mislocation to apical plasma membranes in polycystic kidney disease epithelia. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 260 (3 pt 2), F420-F430 (1991).
  9. Murcia, N. S., Sweeney, W. E., Avner, E. D. New insights into the molecular pathophysiology of polycystic kidney disease. Kidn. Intern. 55 (4), 1187-1197 (1999).
  10. Pavlov, T. S., Levchenko, V., Ilatovskaya, D. V., Palygin, O., Staruschenko, A. Impaired epithelial Na+ channel activity contributes to cystogenesis and development of autosomal recessive polycystic kidney disease in PCK rats. Ped. Res. 77 (1), 64-69 (2014).
  11. Siroky, B. J., et al. Loss of primary cilia results in deregulated and unabated apical calcium entry in ARPKD collecting duct cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 290 (6), F1320-F1328 (2006).
  12. Hovater, M. B., et al. Loss of apical monocilia on collecting duct principal cells impairs ATP secretion across the apical cell surface and ATP-dependent and flow-induced calcium signals. Purin. Signal. 4 (2), 155-170 (2008).
  13. Zaika, O., et al. TRPV4 Dysfunction Promotes Renal Cystogenesis in Autosomal Recessive Polycystic Kidney Disease. J. Am. Soc. Nephrol. 24 (4), 604-616 (2013).
  14. Rohatgi, R., et al. Mechanoregulation of intracellular Ca2+ in human autosomal recessive polycystic kidney disease cyst-lining renal epithelial cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 294 (4), F890-F899 (2008).
  15. Xu, C., et al. Attenuated, flow-induced ATP release contributes to absence of flow-sensitive, purinergic Cai2+ signaling in human ADPKD cyst epithelial cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 296 (6), F1464-F1476 (2009).
  16. Katsuyama, M., Masuyama, T., Komura, I., Hibino, T., Takahashi, H. Characterization of a novel polycystic kidney rat model with accompanying polycystic liver. Exp. Animals. 49 (1), 51-55 (2000).
  17. Ilatovskaya, D., Staruschenko, A. Single-channel analysis of TRPC channels in the podocytes of freshly isolated glomeruli. Methods Mol. Biol. 998, 355-369 (2013).
  18. Pavlov, T. S., et al. Deficiency of renal cortical EGF increases ENaC activity and contributes to salt-sensitive hypertension. J. Am. Soc. Nephrol. 24, 1053-1062 (2013).
  19. Mironova, E., Bugay, V., Pochynyuk, O., Staruschenko, A., Stockand, J. Recording ion channels in isolated, split-opened tubules. Methods Mol. Biol. 998, 341-353 (2013).
  20. Pavlov, T. S., et al. Endothelin-1 inhibits the epithelial Na+ channel through betaPix/14-3-3/Nedd4-2. J. Am. Soc. Nephrol. 21 (5), 833-843 (2010).
  21. Sun, P., et al. High Potassium Intake Enhances the Inhibitory Effect of 11,12-EET on ENaC. J. Am. Soc. Nephrol. 21 (10), 1667-1677 (2010).
  22. Zheleznova, N. N., Wilson, P. D., Staruschenko, A. Epidermal growth factor-mediated proliferation and sodium transport in normal and PKD epithelial cells. Biochim. Biophys. Acta. 1812 (10), 1301-1313 (2011).
  23. Sweeney, W. E., von Vigier, R. O., Frost, P., Avner, E. D. Src inhibition ameliorates polycystic kidney disease. J. Am. Soc. Nephrol. 19 (7), 1331-1341 (2008).
  24. Sweeney, W. E., Avner, E. D. Functional activity of epidermal growth factor receptors in autosomal recessive polycystic kidney disease. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 275 (3 Pt 2), F387-F394 (1998).
  25. Orellana, S. A., Sweeney, W. E., Neff, C. D., Avner, E. D. Epidermal growth factor receptor expression is abnormal in murine polycystic kidney. Kidn. Intern. 47 (2), 490-499 (1995).
  26. Rohatgi, R., et al. Cyst fluid composition in human autosomal recessive polycystic kidney disease. Ped. Nephrol. 20 (4), 552-553 (2005).
  27. Rohatgi, R., Greenberg, A., Burrow, C. R., Wilson, P. D., Satlin, L. M. Na transport in autosomal recessive polycystic kidney disease (ARPKD) cyst lining epithelial cells. J. Am. Soc. Nephrol. 14 (4), 827-836 (2003).
  28. Olteanu, D., et al. Heightened epithelial Na+ channel-mediated Na+ absorption in a murine polycystic kidney disease model epithelium lacking apical monocilia. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 290 (4), C952-C963 (2006).
  29. Veizis, I. E., Cotton, C. U. Abnormal EGF-dependent regulation of sodium absorption in ARPKD collecting duct cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 288 (3), F474-F482 (2005).
  30. Wilson, P. D. Polycystic kidney disease. NEJM. 350 (2), 151-164 (2004).
  31. Hillman, K. A., et al. P2X(7) receptors are expressed during mouse nephrogenesis and in collecting duct cysts of the cpk/cpk mouse. Exp. Nephrol. 10 (1), 34-42 (2002).
  32. Turner, C. M., Ramesh, B., Srai, S. K., Burnstock, G., Unwin, R. J. Altered ATP-sensitive P2 receptor subtype expression in the Han:SPRD cy/+ rat, a model of autosomal dominant polycystic kidney disease. Cells Tissues Organs. 178 (3), 168-179 (2004).
  33. Hillman, K. A., et al. The P2X7 ATP receptor modulates renal cyst development in vitro. Biochem. Biophys. Res. Commun. 322 (2), 434-439 (2004).
  34. Wilson, P. D., Hovater, J. S., Casey, C. C., Fortenberry, J. A., Schwiebert, E. M. ATP release mechanisms in primary cultures of epithelia derived from the cysts of polycystic kidneys. J. Am. Soc. Nephrol. 10 (2), 218-229 (1999).
  35. Schwiebert, E. M., et al. Autocrine extracellular purinergic signaling in epithelial cells derived from polycystic kidneys. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 282 (4), F763-F775 (1152).
  36. Stockand, J. D., et al. Purinergic inhibition of ENaC produces aldosterone escape. J. Am. Soc. Nephrol. 21 (11), 1903-1911 (2010).
  37. Pochynyuk, O., et al. Paracrine Regulation of the Epithelial Na+ Channel in the Mammalian Collecting Duct by Purinergic P2Y2 Receptor Tone. J. Biol. Chem. 283 (52), 36599-36607 (2008).
  38. Zaika, O., Mamenko, M., Boukelmoune, N., Pochynyuk, O. IGF-1 and insulin exert opposite actions on ClC-K2 activity in the cortical collecting ducts. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 308 (1), F39-F48 (2015).
  39. Lalo, U., Pankratov, Y., Kirchhoff, F., North, R. A., Verkhratsky, A. NMDA receptors mediate neuron-to-glia signaling in mouse cortical astrocytes. J. Neurosci. 26 (10), 2673-2683 (2006).
  40. Lalo, U., Andrew, J., Palygin, O., Pankratov, Y. Ca2+-dependent modulation of GABAA and NMDA receptors by extracellular ATP: implication for function of tripartite synapse. Biochem. Soc. Trans. 37 (Pt 6), 1407-1411 (2009).
  41. Li, D., et al. Inhibition of MAPK stimulates the Ca2+ -dependent big-conductance K channels in cortical collecting duct). Proc. Nat. Acad. Sci U.S.A. 103 (51), 19569-19574 (2006).
  42. Bugaj, V., Mironova, E., Kohan, D. E., Stockand, J. D. Collecting duct-specific endothelin B receptor knockout increases ENaC activity. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 302 (1), C188-C194 (2012).
  43. Pavlov, T. S., et al. Regulation of ENaC in mice lacking renal insulin receptors in the collecting duct. FASEB J. 27 (7), 2723-2732 (2013).
  44. Gleason, C. E., et al. mTORC2 regulates renal tubule sodium uptake by promoting ENaC activity. J. Clin. Invest. 125 (1), 117-128 (2015).
  45. Frindt, G., Palmer, L. G. Acute effects of aldosterone on the epithelial Na channel in rat kidney. Am. J. Physiol. Renal Physiol. , (2015).
  46. Ilatovskaya, D. V., et al. Angiotensin II has acute effects on TRPC6 channels in podocytes of freshly isolated glomeruli. Kidn. Int. 86 (3), 506-514 (2014).
  47. Ilatovskaya, D. V., Palygin, O., Levchenko, V., Staruschenko, A. Pharmacological characterization of the P2 receptors profile in the podocytes of the freshly isolated rat glomeruli. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 305 (10), C1050-C1059 (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

יישום הצמד תיקון והחי מיקרוסקופ פלואורסצנטי לפקח על מאפיינים פונקציונליים של מבודד טרי PKD האפיתל
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.