משטח הפצת וImmunostaining של כרומוזומים שמרים

סיכום

מוצגת שיטה לכרומוזומים המתפשטים על פני השטח משמרים ניצנים. שיטה זו נגזרת משיטה שתוארה בעבר על ידי לוידל וקליין. בנוסף, אנו מדגימים הליך לצביעה חיסונית של כרומוזומים מפוזרים.

תקציר

הגודל הקטן של גרעיני השמרים הניצנים Saccharomyces cerevisiae מגביל את התועלת של מיקרוסקופ אור לניתוח ההתפלגות התת-גרעינית של חלבונים הקשורים לכרומטין. התפשטות פני השטח של גרעיני שמרים מביאה להתרחבות הכרומטין ללא אובדן חלבונים קשורים. שיטה להתפשטות פני השטח מאזנת קיבוע של חלבונים הקשורים ל-DNA עם טיפול בחומרי ניקוי. השיטה שהודגמה שונה מעט מזו שתוארה על ידי יוזף לוידל ופרנץ קליין^1,2. השיטה שימשה לאפיון לוקליזציה של חלבונים רבים הקשורים לכרומטין בשלבים שונים של מחזור התא המיטוטי, אך היא שימושית במיוחד לחקר מבני כרומוזומים מיוטיים כגון רקומבינוזומים מיוטיים והקומפלקס הסינפטונמלי. אנו מתארים גם שינוי שאינו דורש שימוש בליפסול, חומר ניקוי קנייני, שנדרש בהליך המקורי, אך אינו זמין עוד מסחרית. מתואר גם פרוטוקול צביעה חיסונית התואם לשיטת התפשטות הכרומוזומים.

מבוא

שמרי ניצני Saccharomyces cerevisiae מציעים יתרונות רבים ללימודים של מנגנונים מולקולריים של תהליכים ביולוגיים, כוללים המחקר של חלבונים השולטים פונקצית כרומוזום. למרות שיש יתרונות ידועים של שמרי ניצנים למחקרים גנטיים, מולקולריים, וביוכימיים, מחקרי ציטולוגית של ההפצה של חלבונים בגרעין התא מסובך על ידי גודלו הקטן. יש שמרי הגרעין הטיפוסי בקוטר של פחות ממיקרון אחד, וזה רק על 5 פעמים גבול הרזולוציה של אור הנראה. לפיכך, כמות המידע על ההפצה של חלבונים גרעיניים שניתן להשיג מimmunostaining הקונבנציונלי או באמצעות תגי חלבון פלואורסצנטי, כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), מוגבלת. גישה שימושית לאפיון הפצת subnuclear של חלבונים היא משטח כרומוזום הפצה. גישה זו כרוכה בהסרת קיר התא, שיבוש תא וקרום גרעין, וllowing תוכן בלתי מסיס של הגרעין להתיישב על פני השטח של שקופיות מיקרוסקופ. רכיבים מסיסים אלה כוללים את המטריצה ​​הגרעינית וכרומוזומים. בנוסף מאפשר הסרת תוכן גרעיני מסיס, אשר משפרת את היכולת לזהות חלבונים מחויבים הכרומטין, כרומוזום הפצת תוצאות שיטה בלחץ משמעותי של כרומוזומים כך שיש לי גרעיני התפשטות קטרים ​​של 3 עד הסביבות 5 מיקרומטר (לגרעיני meiotic דיפלואידי) ו 2 עד 3 מיקרומטר לגרעיני mitotic דיפלואידי. לחץ זה מאפשר זיהוי של מסד גרעיני שקשה יחסית או בלתי אפשרי לפתרון בגרעינים שלמים.

חסרון ברור לכרומוזום הפצה הוא האפשרות שהליך הפצה עשוי באופן חלקי או לחלוטין לשבש את המבנה של עניין. מדאיג במיוחד הוא שחלבון כרומוזום מחויב מסוים עלול ללכת לאיבוד כתוצאה מההליך מתפשט. שו סיבוך פוטנציאלי זהLD לזכור כאשר לפרש נתונים. דוגמא אחת של חלבון שהוא רגיש להליך הפצה היא בטא טובולין. בתנאים מסוימים, הציר, המורכב בעיקר מטובולין, נשמר במהלך הפצת ^3. ויזואליזציה של הציר היא לעתים קרובות שימושית לשלב גרעינים של עניין. עם זאת, הדמיה טובולין דורשת טיפול עם מקבע ריכוז גבוה; צירים הולכים לאיבוד בתנאים הסטנדרטי המתוארים להלן. דוגמא זו ממחישה כי, בעת ניתוח ההפצה של חלבון uncharacterized בעבר, חשוב לגוון את הריכוז של מקבע כדי לקבוע כיצד רגיש החלבון הוא וריאציה כזו. למרות הדאגה לגבי ההשפעה של תנאי הפצה במבנה הכרומוזומים, השירות וכוחה של שיטת הפצה הודגם בהקשרים רבים ויש לו שירות רחב באפיון של mitotic ו, במיוחד תאי meiotic ^4-7.

Two שיטות הפצה נעשתה שימוש נרחב. הראשון של שיטות אלה, שפותחו על ידי השידה וג'ירו ^8, ימנע את השימוש בחומרי הניקוי ויכול להניב הכנות התפשטות שנראה שיש לי מורפולוגיה כרומוזום יחסית השתמרה היטב כאשר מוכתם עבור DAPI צבע DNA הספציפי. עם זאת, שיטה זו היא קשה יחסית למושלם והאיכות של גרעיני ההתפשטות משתנה באופן דרמטי, כאשר אזור אחד של שקופית בהשוואה לאזורים אחרים. בעיה זו יכולה לסבך גישות כמותיות שכרוכות הדמיה רבות גרעינים שלא נבחרו משקופית אחת, כדי למנוע הטיה רכישת נתונים. כרומוזום השני הפצת שיטה, שפותח על ידי Loidl ^ו1 קליין, כרוך איזון קיבעון על ידי paraformaldehyde, עם תמוגה ולחץ הכרומטין מקודם על ידי תמיסת ניקוי. כאשר מבוצעים כהלכה, שיטה זו נותנת תוצאות מאוד לשחזור עם פחות וריאציה אזור לאזור בהשוואה לשיטת השידה וג'ירו. מצגת זו מתמקדת בmodifieגרסת ד של השיטה של ​​Loidl וקליין, בגלל האמינות והפשטות שלה.

כרומוזום הפצה היא לא מסובכת או זמן רב; ניתן להכין עד 100 שקופיות עבור immunostaining ביום אחד. יתר על כן, הכנות ההתפשטות ניתן לאחסן במקפיא במשך שנים לפני immunostaining, ובכך מעבדות יכולות לפתח מאגר של ממרחי כרומוזום קפוא, שניתן להשתמש בי שאלות ביולוגיות חדשות להתעורר או חומרים כימיים צביעה חדשות הופכים לזמינים.

שיטת כרומוזום הפצה היא נפוצה ביותר בשילוב עם immunostaining ומיקרוסקופ פלואורסצנטי widefield, אבל אפשר גם להכין שקופיות לשיטות אור ברזולוציה סופר מיקרוסקופיות כגון דלדול פליטה המאולץ מיקרוסקופיה (STED).

פרוטוקול

הערה: חלק מהצעדים להלן דורשים הפרוטוקול עובדים במנדף נקי. בנוסף, השיטה דורשת מיקרוסקופ לנתיחה שמרי הטטרדה מצויד מטרת מרחק 10X עבודה ארוכה כדי לפקח spheroplasting. מיקרוסקופ יש להגדיר בשכונה לפני הזמן. הסר את זרוע micromanipulator ובעל צלחת מההיקף ולמקם את הפריטים האלה במקום בטוח הרחק מאזור העבודה.

1. הכנת Spheroplasts

1. לגדול בתנאי שמרים רצויים. השתמש על 2 x 10 ⁸ תאים עבור כל דגימה, למשל 4 מיליליטר של תרבות בOD600 1.4 = 5 x 10 ⁷ תאים / מיליליטר. למרות עיבוד מיידי של דגימות עשוי להיות עדיף במקרים מסוימים, עבור מרבית היישומים, ניתן לאחסן aliquots הסלולרי בקרח לעד 8 שעות לפני העיבוד.
2. העבר את ההשעיה תא צינור 15 מיליליטר צנטריפוגות וספין בצנטריפוגה קלינית בהגדרת 5 (2,345 סל"ד / 857.5 XG) במשך 3 דקות עד גלולה התאים.
3. למזוג טיפול לקיחה הבינוני לא לאבד את התאים מגלולים. בעדינות resuspend התאים במאגר ZK מיליליטר 1 ולאחר מכן להוסיף 40 dithiothreitol μl M 1 (DTT). דגירה 2 דקות עם ערבוב עדין. תאים גלולה כמו קודם (ראו שלב 1.2).
4. כדורים גלולים במאגר ZK 1 מיליליטר. הוסף 5 μl של פתרון מוכן טרי של 100T zymolyase שכבר מעורב באופן יסודי. דגירה במשך 20-30 דקות על 30 מעלות צלזיוס להסיר את דופן התא ולייצר spheroplasts.
5. Assay אגל 10 μl של השעיה תא בשקופית מיקרוסקופ כדי לקבוע אם spheroplasting הוא מלא. תאים שנצפו תחת מיקרוסקופ לנתיחה ללא coverslip. תאים אמורים להופיע נפוחים ועגולים ולא מעט מוארכים וצריכים lyse הבא תוספת של 20 μl של מים. אם תאים לא מצליחים lyse, להחזיר את המדגם ל -30 מעלות צלזיוס ומחדש assay כל 10 דקות עד תמוגה מים מושרה הוא ציין בקלות. תאים גלולה כמו קודם (ראו שלב 1.2).
6. בעדינות resuspend ולשטוף אני תא גלולהn 2.5 מיליליטר MES / חיץ סורביטול קר. תאים גלולה כמו קודם (ראו שלב 1.2). בעדינות resuspend תא גלולה ב300-400 MES / חיץ סורביטול קר μl. יכולים להיות כל הזמן בתאים על קרח בשלב זה לכמה שעות.

2. כרומוזום הפצת

הערה: משטחי הזכוכית שעליו כרומוזומים ייפרסו-או שקופיות או coverslips-צריך להיות מוכנים מבעוד מועד. כל שקופית או coverslip צריכה להיות שקוע במים, ואז EtOH, אז להתייבש, ומלוטש עם נייר עדשה. אם הכרומוזומים יתפרסו על coverslips, coverslip צריך להיות מודבקים לשקופית עם סקוטש או מלט גומי. אלא אם נאמר אחרת, שאר הפרוטוקול יתארו מתפשטים משני שקופיות או coverslip

1. באמצעות pipettor P20, pipet 20 μl של השעיה תא על פני השטח של שקופית נקייה.
2. שימוש pipettor P200, להוסיף 40 μl של 3% פתרון PFA / סוכרוז ולערבב בעדינות solution על ידי "מתערבל" השקופיות עם היד עד קווי Schlieren ייעלמו. מניחים שקופיות תחת מיקרוסקופ ולאשר כי תאים הם בפוקוס. את פתרון PFA צריך להיות מוכן טרי-במנדף ביום שימוש.
   הערה: אם החלבון של עניין לא נבדק על ידי השיטה בעבר, מומלץ להכין שקופיות נוספות באמצעות פתרונות המכילים 2 ו -4% PFA כדי לקבוע אם השמירה של החלבון רגישה לתנאי קיבעון. פתרון / סוכרוז 4% PFA משמש במקרים שבם רצוי לדמיין microtubules טובולין קשור. החסרון של הריכוז גבוה יותר הוא שמקבע את הכרומוזומים יהיו "underspread," 2% PFA גם נוטה להניב כרומוזומים "underspread".
3. שימוש pipettor P200, להוסיף 80 μl של 1% Lipsol, מערבולת כמו קודם לערבב פתרונות שלמים ככל האפשר, להתחיל טיימר. במידת Lipsol לא זמין, 80 μl 1% NP40 או 80 μl DH ₂ O יכולים להיותהוחלף (ראה נציגי תוצאות, איור 2).
4. צפה בתאים בזהירות ובעדינות מערבולת השקופית כל 15 שניות. כאשר כ -80% מהתאים lysed (נעלם) לעצור את שעון העצר, להסיר באופן מיידי את השקופית ממיקרוסקופ, להוסיף 80 μl של פתרון PFA / סוכרוז, ומערבולת לערבב. תמוגה צריכה להתרחש מבין 30 ל 90 שניות לאחר תחילת שעון העצר.
   הערה: אם כמה שקופיות להראות תמוגה בערך באותו הזמן, אחד יכול סופו של דבר להשמיט ניטור מיקרוסקופי לשארית השקופיות ופשוט זמן תקופה שבין תוספת של lipsol ותוספת של aliquot הסופי של מקבע בזהירות. עם זאת, קיצור זה רק אמין בעת ​​הכנת שקופיות מרובות מאותה הדגימה. עדיף לפקח תמוגה של כל דגימה מיקרוסקופית כאשר שקופיות שונות מוכנות מדגימות שנלקחו בזמנים שונים או מתרבויות שונות.
5. מניחים את השקף על משטח נקי ושטוח ולהפיץ את הנוזל על פני surfac unfrosted כלדואר של השקופית באמצעות הצד של pipet נקי, חד פעמי מרעה שנערך מתחת להמניסקוס של "השלולית" אבל מעל פני השטח של השקופית עצמה, כלומר. לא "לגרוף" את פני השטח של השקופיות עם pipet. אל תעשה שימוש חוזר pipet בשקופיות שונות, כדי למנוע זיהום של דגימות.
6. השאר את השקופיות לייבוש למשך הלילה במנדף. רכיבים גרעיניים מסיסים יישבו על פני השטח השקופיות ולהיקשר אליו. לניסויים גדולים, מתכנן את השימוש בחלל לצעד הייבוש חשוב.
7. ברגע שהתייבש, תוצאות אופטימליות מתקבלות על ידי התקדמות לשלב immunostaining באותו היום. עם זאת, פתרון סוכרוז המיובש מטביע כרומוזומים התפשטות ב" דבש "המאפשר הקפאה של דוגמאות: ניתן להעביר שקופיות לתיבת שקופיות פלסטיק ומאוחסנות ב -20 ° C במשך שנים.

3. Immunostaining

1. טובלים שקופיות בתמונה 0.2%-פלו למשך 30 שניות. כדי להסיר דבש. שקופיות להישען עלקצה, עם הקצה מונח על מגבת נייר, כדי להסיר תמונה-פלו שייר.
2. טובלים שקופיות ב1x TBS במשך 5 דקות לשטוף. הסר נוזל עודף על ידי נשען שקופיות על קצה, אבל לא נותן להם להתייבש.
3. הנח שקופיות חלבית צד עד, pipet 300 μl TBS / BSA לשקופית מעבר לחלק unfrosted של השקופית.
4. דגירה בתא לח על RT במשך 15 דקות. (מיכל פלסטיק גדול מרופד במגבות נייר מים רוויים בתיבת שקופיות לוחית מתכת או פלסטיק מחוררת עם מגבות נייר רוויות).
5. מסננים שקופיות על ידי מנוחה קצה קצר של השקופית על מגבת נייר ונשען השקופית נגד תמיכה מתאימה (כגון מדף מבחנה). אל תאפשר משטח לייבוש.
6. מייד להחיל 80 μl של חיץ TBS / BSA המכיל את הדילול המתאים של נוגדן ראשוני. אם נוגדן הגבלה, להשתמש 40 μl וcoverslip 22 מ"מ x 22. לסרום ארנבת גולמי, זה בדרך כלל בין דילול 1/50 ו1/500.
   הערה:בצע titrations להכנות נוגדן חדשים. ההכנה לדלל ביותר שתשואות גבוהות אות מעל הרקע נבחרה. כדי לשלוט על הרמה של מכתים רקע, צריכים להיות מוכנים מזן המוטציה המחיקה המתאים ו / או שקופיות כפולות גרעינים צריכים להיות מוכתם בדם לפני חיסון.
7. מניחים coverslip 22 x 50 מ"מ מלוטש בשקופית הימנעות בועות. לעשות זאת על ידי החזקת coverslip בין האגודל והאצבע לאורך הקצה הארוך בעמדות ליד קצה אחד קצר. מחזיק coverslip בביחס זווית של 30 מעלות כדי להחליק, הרחוק ביותר מקצה קצר האצבעות הוא הוריד עד שהיא נחה בשקופית רק בתוך קצה "השלולית" הקרוב ביותר לאזור החלבית של השקופית. אז לאט לאט להוריד את coverslip בתנועה חלקה עד האצבעות מחזיקות את מגע שקופיות הספסל, ולאחר מכן שחרר. אל תנסה להתאים את המיקום של coverslip רגע שנוחת.
   הערה: אם מרווחי כרומוזום הוכנו עלcoverslips המודבק (ולא ישירות על פני השטח של שקופיות), coverslip מדגם זה יישאר מודבקים לשקופית בכל שלבי הצביעה וכביסה. Coverslip נוסף יוצב על גבי coverslip המדגם להפיץ את פתרון הנוגדנים באופן שווה במהלך מכתים ולאחר מכן הושלך.
8. מגלשות מקום בתא לח אטום ודגירת הלילה בשעה 4 מעלות צלזיוס.
9. מחזיק העברת הקצה החלבית השקופיות למדף צביעת שקופיות זכוכית ולצלול בצנצנת מכתים המכילה TBS.
10. בעדינות לטבול את השקופית למעלה ולמטה כדי להסיר את coverslip. נסה לא להשתמש בכוח רב מדי כדי לעשות את זה. שטוף את שקופיות 2x 10 דקות על ידי השריית בTBS. הסר שקופיות ממדף וניקוז נוזל עודף על ידי הנגיעה קצה למגבת נייר. אל תתנו יבש פני השטח.
11. עבודה תחת אור עמום, מייד להוסיף 80 μl TBS / BSA המכיל דילול פי 1/1000 של נוגדן fluorochrome מצומדות המשני (או 40 μl עם coverslip 22 x 22 מ"מ). מודעהcoverslip ד כמו קודם ודגירה על 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 2 בתא הלח בחושך.
12. הסר coverslips כמו קודם, לנקז שקופיות, ולאפשר משטח לייבוש באוויר ל1-2 שעות בחושך. שקופיות להישען על מגבות נייר כמו קודם.
    הערה: אם הפצה בוצע על coverslip רכוב, לנתק את coverslip מהשקופית לפני הייבוש. אז coverslips מיובש כפי שתואר עבור שקופיות בשלב הקודם.
13. עבודה תחת אור מאופק, להוסיף כ -30 μl של הרכבה בינונית מכיל DAPI (שלוש 10 טיפות μl) ולאחר מכן להוריד את coverslip בזהירות. אם המרווחים הם על coverslips, למקם את הטיפות של מדיום הרכבה בשקופית נקייה ולהפחית את coverslip, צד כרומוזום למטה, לשקופית.
14. עדיין באור עמום, לחכות 2 דקות לcoverslip להתיישב ולאטום קצוות של coverslip עם לק ברור. מניחים שקופיות בתיבת שקופיות שטוחות.
    הערה: למיקרוסקופיה STED, הר עם להאריך זהב. השתמש 30 μl של להאריך זהבללא DAPI ולאפשר לרפא לילה. איטום עם לק הוא מיותר.
15. צפה בשקופיות על ידי מיקרוסקופ epifluorescence widefield עם 40 או אובייקטיבי 100X באמצעות מסנן להגדיר מתאים לDAPI להתמקד. לחלופין לאחסן את השקופית בחושך על 4 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות. לא להקפיא.

תוצאות

המראה של גרעיני התפשטות ביקורתי תלוי באיזון בין קיבעון כרומוזום ודה-דחיסה. גם כאשר ריאגנטים מאוזנת כראוי, וריאציה במידת כרומוזום דה-דחיסה יכולה להתרחש באזורים שונים של אותה השקופית ו / או בין שקופיות שונות. לפיכך, את האיכות של מרווחים באזור נתון של שקופית יש לבחון לפני תמונות מתפרשות.

ההשפעות של "פורש" ו- "underspreading" ניתן להדגים באמצעות נוגדנים נגד חלבוני רקומבינציה meiotic. באיור...

דיון

הופעתם של גרעינים מפוזרים תלויה באופן קריטי באיזון בין קיבוע לטיפול בליזיס/דטרגנטים. כפי שנדון לעיל, שימור מבנים תאיים משתנים מחייב שימוש בריכוזי PFA שונים. עבור רוב החלבונים, 3% PFA הוא אופטימלי. עם זאת, שימור צירים דורש שימוש ב-4% PFA. אפילו עם קבוצה אחת של ריאגנטים, תזמון הליזיס ביחס לקיבוע יכול להשפיע גם על איכות הגרעינים המתפשטים. לקבלת התוצאות העקביות ביותר, יש לנרמל את זמן הליזיס עבור כל דגימת ספרופלסט על ידי תצפית ישירה על ליזה במיקרוסקופ אור. לעין המאומנת, ספרופלסטים עגולים מתכהים כשהם מתנפחים לפני הליזיס; ל...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
זימוליאז	ארה"ב ביולוגית	Z1004	הכן תמיסה של 20 מ"ג/מ"ל ב-50 מ"מ Tris pH 7.5 בתוספת 2% גלוקוז. מכינים טרי כל ניסוי ומאחסנים בטמפרטורה של 4 מעלות; C עד שמוכן לשימוש.
ליפסול	ל.י.פ. בע"מ	כבר לא זמין מסחרית	הכן תמיסה של 1% (v/v) במים. יש לאחסן על קרח.
NP-40	USB	19628	הכן תמיסה של 1% (v/v) במים. יש לאחסן על קרח.
Tween 20	Sigma	P2287
Slides	Corning	2948-75x25
Coverslip סטנדרטי	Fisher	12-544-E או 12-540-B
Coverslips ברזולוציה גבוהה	Fisher	12-542-B
Photo-Flo 200 Solution	Kodak	P-7417	הכן תמיסה של 0.2% (v/v) במים.
TBS			137 מ"מ NaCl, 2.7 מ"מ KCl, 24.7 מ"מ Tris, pH 8
BSA	Sigma	A2153	הכן תמיסה של 1% (w/v) ב-TBS. אחסן ב-4° C עד חודש.
נוגדן
ראשי Alexa Fluor 488 חמור נגד ארנב	Invitrogen	A-21206
IgG (H+L) נוגדן
Vectashield הרכבה מדיה עם DAPI	וקטור מעבדות	H-1200
ProLong זהב	Invitrogen	P36930
פלסטיק שקופיות תיבת	פישר	03-448-1	אחסן שקופיות המכילות ממרחים מיובשים בחריצים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס. כמו כן, השתמש כתא רטוב.
קופסת שקופיות קרטון	פישר	12-587-10	השתמש להובלה נוחה של שקופיות מוכתמות/אטומות או לאחסן ב-4°C.
צנצנת קופלין	פישר	08-816	לשימוש ככיור למגלשות.