מיקרו-רנ"א אנושי עובר מאריתרוציטים מאריח לטפילי פלסמודיום פלציפרום. כאן מתוארות הטכניקות המשמשות להעברת מיקרו-רנ"א סינתטיים לאריתרוציטים מארחים ולבידוד כל ה-RNA מ-P. falciparum. בנוסף, מאמר זה יפרט שיטה לבידוד פוליזומים ב-P. falciparum כדי לקבוע את התפוסה הריבוזומלית ואת פוטנציאל התרגום של תעתיקי טפילים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
שיטות כדי לחקור את תפקיד הרגולציה של RNA הקטן וריבוזומלי תפוסה של
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
הווריאציה הגנטית אחראית לאלל חרמשית (HBS) מאפשרת אריתרוציטים להתנגד זיהום על ידי טפיל המלריה, פ falciparum. הבסיס המולקולרי של התנגדות זו, אשר ידועה להיות גורמים מרובים, נשאר הבין באופן חלקי. מחקרים שנעשה לאחרונה מצאו כי ביטוי ההפרש של מיקרו RNA כדורית אדומה, translocated פעם לטפילי מלריה, להשפיע הן ויסות הגנים וצמיחת טפיל. miRNAs אלה מאוחר יותר הוצג לעכב תרגום mRNA על ידי יצירת תעתיקי הרנ"א chimeric באמצעות 5 היתוך 'RNA עם תת דיסקרטי של mRNAs טפיל. כאן, בטכניקות ששמשו כדי ללמוד את התפקיד הפונקציונלי ומייקרו-רנ"א כדורית אדומה המשוער מנגנון הבסיסי על ויסות הגנים ופוטנציאל translational של פ falciparum, כולל transfection של מיקרו RNA הסינתטי שונה לאריתרוציטים מארח, שיפורט. לבסוף, שיטת שיפוע polysome משמשת כדי לקבוע את מידת translation של תמלילים אלה. יחד, טכניקות אלה אפשרו לנו להוכיח כי רמות dysregulated של מיקרו RNA כדורית אדומה תורמות להתנגדות מלריה תא הפנימי של אריתרוציטים מגל.
מבוא
מלריה, הנגרמת על ידי טפילי apicomplexan של הסוג Plasmodium, היא המחלה טפילית האנושית הנפוצה ביותר, בעולם מדביק כ -200 מיליון אנשים בכל שנה וגורם למותם סביב 600,000 1. של חמישה מיני Plasmodium שלהדביק בני אדם, הרלוונטי ביותר למחלות של בני אדם הוא פ falciparum ופ vivax, בשל ההפצות שלהם נרחבות ופוטנציאל לסיבוכי מלריה חמורים. מחזור החיים של טפיל המלריה דורש זיהום של שני יתושים ובני אדם. כאשר יתוש נגוע נושך אדם, הטפילים לנסוע דרך מחזור הדם אל הכבד, שבו עגול של שכפול ראשוני מתרחש. לאחר merozoites קרע מhepatocyte המארח, הם להדביק תאי דם אדומים סמוכים, ייזום שכפול או מיני או מיני. השלב מיני של שכפו....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1: בידוד של RNAs הקטן בגודל מפ falciparum במהלך IDC
- להשיג טפילי מלריה בתרבות מינית 29.
הערה: גודל התרבות הנדרשת ישתנה מבוסס על היישום הרצוי; עם זאת, תרבות 10 מיליליטר בהמטוקריט 3-5 parasitemia% ו -5% מספקת RNA בשפע בזמן אמת PCR (RT-PCR). הטכניקה תחילה מותאמת לתרבויות אסינכרוני, אך כאשר נקודות זמן מסוימות במהלך מחזור הזיהום הן רצויים, ניתן לסנכרן טפילי טבעת שלב-ידי סנכרון סורביטול לא יאוחרו מהפוסט-10-12 שעות פלישה. סנכרון יש לחזור אחרי מחזור אחד (כ 48 שעות) 29.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
פרופיל עולמי של microRNA האנושי בפ falciparum
הטכניקות שהוצגו כאן שמשו כדי לחלץ מיקרו-רנ"א מטפילים במגוון רחב של מצבים. דבר אחד שיש לציין הוא כי עקירות RNA לRBCs נגוע בוצעו כפי שצוינה ב -32, אשר לעתים קרובות שימשו כנקודת התייחסות לנתונים שהוצגו בשני microRNA מאמר זה והמחקר המקורי 29. אלה מחקרים הקודמים הראו גם כי אריתרוציטים HBSS דיבוק רמות הרבה יותר של miRNAs מסוים, miR-451 בפ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
HBS הוא אחד גרסאות המוגלובין הנפוצות ביותר באזורים אנדמיים למלריה, במידה רבה משום שהוא מספק הגנה מפני מלריה חמורה שנגרמה על ידי פ ' falciparum. הטכניקות דרושות כדי לאפיין את התפקיד של microRNA האנושי בויסות הגנים של פ falciparum מפורטים בכל כתב היד הזה. על ידי מיצוי RNA הכולל באופן שיכלול את כל RNA הקטן כזה, ועל ידי ביצוע הליך תמוגה הטפיל פשוט יחסית, RNAs ההיתוך אלה היו יכולים להיות מזוהים באמצעות מגוון רחב של טכניקות עצמאיות.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין אינטרסים כלכליים מתחרים להצהיר עליהם.
תודות
מחקר זה מומן על ידי קרן הצדקה דוריס דיוק, קרן בורוז וולקאם, R21DK080994 ה-NIH, קרן פרויקט הפיילוט של דיוק צ'נסלור, קרן רוש לחקר אנמיה וקרן ביל ומלינדה גייטס. G.L. נתמך על ידי UPGG של דיוק וה-NIH (מענק # 5R01AI090141-03) ו-K.A.W. על ידי תוכנית מלגות המחקר לתארים מתקדמים של NSF.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| <חזק>ריאגנטים-כל הריאגנטים חייבים להיות נטולי RNAse. | |||
| Diethyl פירוקרבונט | Sigma | D5758 | DEPC |
| DEPC מים מטופלים (ראה הגדרת ריאגנטים) | |||
| Yoyo-1 DNA צבע פלואורסצנטי | Thermo Fisher | ||
| Gene Pulser II אלקטרופורטור | Bio-Rad | ||
| 0.2 ס"מ קובטות | |||
| 4 מ' אשלגן אצטט | מלינקרודט | 6700 | |
| 2 מ' אשלגן HEPES | סיגמא | H0527 | pH 7.2 |
| 1 מ' מגנזיום אצטט | סיגמא | M-2545 | |
| 1 מ' דיתיותרייטול | מוצרי מחקר בינלאומיים | D11000 | DTT |
| 100 מ"מ פניל מתיל-סולפונאט פלואוריד | סיגמא | P7626 | PMSF, מומס באיזופרופנול |
| 10% (v/v) Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich | I3021 | |
| 10% (w/v) נתרן דאוקסיכולאט | Sigma | D-6750 | DOC |
| Cycloheximide | Sigma | C-7698 | CHX |
| Sucrose | Mallinckrodt | 8360-04 | |
| RNAseOUT (Invitrogen, מס' קט' 100000840) | Invitrogen | ||
| RPMI-1640 עם L-גלוטמין | Cellgro | 10-040-CV | |
| 10% AlbuMAX I | Invitrogen | 11020-039 | w/v במים סטריליים |
| Gentamicin | Gibco | 15750-060 | |
| תוסף HT (100x) (Invitrogen, מס' קט' 11067030) | |||
| 45% (w/v) סוכרוז (סיגמא, מס' קט' G8769) | |||
| 1 M מאגר HEPES (Gibco, מס' קט' 15630-080) | |||
| 1x מי מלח חוצץ פוספט (PBS; Cellgro, חתול. מס' 2109310CV) | |||
| בקבוק מסנן ואקום קורנינג 500 מ"ל (VWR, מס' קט' 430769) | |||
| שקופיות זכוכית (VWR, מס' קט' 48311-702) | |||
| כתם גימסה (50X) (VWR, מס' קט' m708-01) | |||
| ערכת בידוד mirVana miRNA (אמביון, ThermoFisher Scientific). | |||
| miRNA בוגר מצומד ביוטין 5' (הרצף משתנה לפי miRNA מעניין) (דהרמקון) | |||
| אבקת ביוטין (סיגמא-אולדריץ') | |||
| 1 מ' אשלגן כלורי | |||
| סטרפטווידין ספרוז חרוזים בעלי ביצועים גבוהים (GE Healthcare) | |||
| מאגר השעיה מחדש של ריבוזום (ראה הגדרת ריאגנט) | |||
| מאגר ליזה (ראה הגדרת ריאגנטים) | |||
| 15% (w/v) תמיסת שיפוע סוכרוז (ראה הגדרת ריאגנטים) | |||
| 50% (w/v) תמיסת שיפוע סוכרוז (ראה הגדרת ריאגנטים) | |||
| כרית סוכרוז 0.5 מ' (ראה הגדרת ריאגנט) | |||
| 60% (w/v) תמיסת מרדף סוכרוז (ראה הגדרת ריאגנטים) | |||
| מדיה של תרבית תאי פלסמודיום (ראה הגדרת ריאגנט) | |||
| מאגר שטיפה של לכידת RNA (ראה הגדרת ריאגנט)מאגר | |||
| סילוק RNA (ראה הגדרת ריאגנט) | |||
| <חזק>הגדרת ריאגנט | |||
| <חזק>פתרונות | |||
| <חזק>מדיה לתרבית תאי פלסמודיום | |||
| 500 מ"ל RPMI-1640 עם L-גלוטמין | |||
| 0.5 מ"ל גנטמיצין | |||
| 5 מ"ל תוסף | |||
| 2.5 מ"ל 45% גלוקוז | |||
| 25 מ"ל 10% AlbuMAX I | |||
| 12.5 מ"ל 1 M HEPES | |||
| פילטר סטרילי עם בקבוק מסנן ואקום 0.2 מ"מ. | |||
| <חזק>אמצעי תרבית תאי פלסמודיום המכיל 10x CHXאותו | |||
| מתכון כמו אמצעי תרבית תאי פלסמודיום לעיל, בתוספת של: | |||
| 2 מ"מ ציקלוהקסימיד | |||
| מדיה מוכנה כרגיל, ואז להוסיף CHX לריכוז סופי של 2 מ"מ ולסנן. | |||
| <חזק>1x PBS המכיל ציקלוהקסימיד | |||
| ציקלוהקסימיד מתווסף טרי ל-1x PBS לריכוז סופי של 200 מ"מ, ונשמר ב-4 OC עד לשימוש. | |||
| <חזק>מאגר השעיה ריבוזום | |||
| 400 מ"מ אשלגן אצטט | |||
| 25 מ"מ אשלגן HEPES, pH 7.2 | |||
| 15 מ"מ מגנזיום אצטט | |||
| 200 מ"מ ציקלוהקסימיד (הוסף טרי) | |||
| 1 מ"מ DTT (הוסף טרי) | |||
| 1 מ"מ PMSF (הוסף טרי) | |||
| 40 U/ml RNaseOUT (הוסף טרי) | |||
| <חזק>מאגר ליזה | |||
| זהה למאגר השעיית ריבוזום למעלה, בתוספת של: | |||
| 1% (v/v) Igepal CA-630 | |||
| 0.5% (w/v) | |||
| Sucrose | |||
| זהה למאגר השעיית ריבוזום לעיל, בתוספת כמויות משתנות של סוכרוז: | |||
| 15% (w/v) סוכרוז ליצירת תמיסת | |||
| שיפוע סוכרוז של 15%50% (w/v) סוכרוז להכנת תמיסת | |||
| 0.5 M סוכרוז להכנת כרית | |||
| כאמור לעיל, יש להוסיף טרי ציקלוהקסימיד, DTT, PMSF ו-RNaseOUT. | |||
| תמיסת המרדף של 60% סוכרוז דורשת רק סוכרוז ומים, ללא רכיבים | |||
| 60% (w/v) סוכרוז במים שטופלו ב-DEPC כדי ליצור תמיסת | |||
| <חזק>RNA לכידת מאגר כביסה | |||
| 20 mM KCl | |||
| 5 יחידה/מ"ל Rnase Out (Invitrogen) | |||
| RNA Capture Elution Buffer | |||
| אותו מתכון כמו RNA Capture Wash Buffer, בתוספת של: | |||
| 2 מ"מ ביוטין | |||
| רוטור אולטרה-צנטריפוגה <חזק>ציוד | |||
| SW55 Ti (בקמן, מס' קט' 342194) | |||
| רוטור אולטרה-צנטריפוגה SW41 Ti (בקמן, מס' קט' 331362) | |||
| Ultra-ClearTM ½ צינורות אולטרה-צנטריפוגה בגודל 13 x 51 מ"מ (13 x 51 מ"מ) עבור SW55 (בקמן, מס' קט' 344057) | |||
| פוליאלומר 9/16 x 3 ו-frac12; בצינורות אולטרה-צנטריפוגה (14 x 89 מ"מ) עבור SW41 (בקמן, מס' קט' 331372) | |||
| L8-80M אולטרה-צנטריפוגה (בקמן) | |||
| מחט מזרק קהה מפלדה, 4 אינץ', 16 גרם (אולדריץ', מס' קט' Z261378) | |||
| מזרק 1 מ"ל עם 27 G½ מחט (בקטון דיקינסון, מס' קט' 309623) | |||
| מזרק 5 מ"ל (בקטון דיקינסון, מס' קט' 309646) | |||
| מסובב צינור | |||
| מערכת פיצול שיפוע צפיפות | |||
| TracerDAQ (מחשוב מדידה) | |||
| רוטור Eppendorf A-4-81 (Eppendorf, מס' קט' 022638807) |
מקורות
- World Health Organization. World Malaria Report. , (2014).
- Livincstone, F. B. Malaria and human polymorphisms. Annu Rev Genet. 5, 33-64 (1971).
- Nagel, R. L., Roth, E. F. Malaria and red cell genetic defects. Blood. <....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
