הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

שיטות כדי לחקור את תפקיד הרגולציה של RNA הקטן וריבוזומלי תפוסה של

8.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/53214

⸱

4 בדצמבר 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Genetics and Microbiology, Duke University School of Medicine, 2Center for Genomic and Computational Biology, Duke University School of Medicine, 3Department of Cell Biology, Duke University School of Medicine

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

מיקרו-רנ"א אנושי עובר מאריתרוציטים מאריח לטפילי פלסמודיום פלציפרום. כאן מתוארות הטכניקות המשמשות להעברת מיקרו-רנ"א סינתטיים לאריתרוציטים מארחים ולבידוד כל ה-RNA מ-P. falciparum. בנוסף, מאמר זה יפרט שיטה לבידוד פוליזומים ב-P. falciparum כדי לקבוע את התפוסה הריבוזומלית ואת פוטנציאל התרגום של תעתיקי טפילים.

תקציר

הווריאציה הגנטית אחראית לאלל חרמשית (HBS) מאפשרת אריתרוציטים להתנגד זיהום על ידי טפיל המלריה, פ falciparum. הבסיס המולקולרי של התנגדות זו, אשר ידועה להיות גורמים מרובים, נשאר הבין באופן חלקי. מחקרים שנעשה לאחרונה מצאו כי ביטוי ההפרש של מיקרו RNA כדורית אדומה, translocated פעם לטפילי מלריה, להשפיע הן ויסות הגנים וצמיחת טפיל. miRNAs אלה מאוחר יותר הוצג לעכב תרגום mRNA על ידי יצירת תעתיקי הרנ"א chimeric באמצעות 5 היתוך 'RNA עם תת דיסקרטי של mRNAs טפיל. כאן, בטכניקות ששמשו כדי ללמוד את התפקיד הפונקציונלי ומייקרו-רנ"א כדורית אדומה המשוער מנגנון הבסיסי על ויסות הגנים ופוטנציאל translational של פ falciparum, כולל transfection של מיקרו RNA הסינתטי שונה לאריתרוציטים מארח, שיפורט. לבסוף, שיטת שיפוע polysome משמשת כדי לקבוע את מידת translation של תמלילים אלה. יחד, טכניקות אלה אפשרו לנו להוכיח כי רמות dysregulated של מיקרו RNA כדורית אדומה תורמות להתנגדות מלריה תא הפנימי של אריתרוציטים מגל.

מבוא

מלריה, הנגרמת על ידי טפילי apicomplexan של הסוג Plasmodium, היא המחלה טפילית האנושית הנפוצה ביותר, בעולם מדביק כ -200 מיליון אנשים בכל שנה וגורם למותם סביב 600,000 1. של חמישה מיני Plasmodium שלהדביק בני אדם, הרלוונטי ביותר למחלות של בני אדם הוא פ falciparum ופ vivax, בשל ההפצות שלהם נרחבות ופוטנציאל לסיבוכי מלריה חמורים. מחזור החיים של טפיל המלריה דורש זיהום של שני יתושים ובני אדם. כאשר יתוש נגוע נושך אדם, הטפילים לנסוע דרך מחזור הדם אל הכבד, שבו עגול של שכפול ראשוני מתרחש. לאחר merozoites קרע מhepatocyte המארח, הם להדביק תאי דם אדומים סמוכים, ייזום שכפול או מיני או מיני. השלב מיני של שכפול, שנמשך 48 שעות בפ falciparum, הוא המוקד של מחקר זה מאחר שהוא גם המקור של רוב malסימפטומים ואריה הוא סכמו בקלות במבחנה.

בעוד מספר יוזמות בריאות ציבור, לרבות טיפולים נגד מלריה השתפרו, יש מעט הפחית את הנטל של המלריה בעולם, את הופעתה המתמשכת של טפילים עמידים סמים מהווה בעיה עבור מאמצי שליטת מלריה. תחום אחד שיכול להציע גישות טיפוליות חדשות הוא המחקר על איך שונים וריאנטים גנטיים להקנות עמידות למלריה. באזורים נגועים מלריה, מגוון רחב של פולימורפיזם האריתרוציטים הם די נפוץ 2,3. מוטציות אלה, עם חרמשית להיות אולי הבולטים ביותר, הקשורים לעתים קרובות עם התנגדות משמעותית להתפרצות של זיהום המלריה סימפטומטי 4. המנגנונים שבאמצעותם הם גורמים אריתרוציטים להתנגד זיהום מלריה הם הבינו באופן חלקי. אריתרוציטים parasitized עם מוטציות המוגלובין כפופים להרס עצמי משופר באמצעות קשיחות משופרת סלולרית והתייבשות, שמזוהה עם פלישת ירד ב פ falciparum 5. אלל HBC משפיע גם על ביטוי חלבון על פני השטח כדורית אדומה ועם שיפוץ של שלד התא, עיכוב התפתחות טפילה 6,7 נוסף. לבסוף, פ falciparum גדל היטב במגל הומוזיגוטים (HBSS) אריתרוציטים 8,9 במבחנה, המצביעים על גורמי האריתרוציטים פנימיים של התנגדות מלריה. עם זאת, בעוד שכל מנגנונים אלה מופיעים לתפקיד, הם לא מסבירים באופן מלא את המנגנונים מאחורי התנגדות חרמשית למלריה.

סט פוטנציאלי אחד גורמי האריתרוציטים שיישארו הבין היטב הוא המאגר הגדול של הווה מירנה בתוך אריתרוציטים בוגרים. מיקרו RNA הוא RNA קטן קידוד-עישון, 19-25 NT בגודל, אשר מתווך תרגום ו / או יציבות של mRNAs היעד על ידי זיווג בסיס ב'UTR 3. הם היו מעורבים בשליטה של ​​תגובות חיסוניים של יונקים, כוללים הדיכוי oו וירוס שכפול 10, והוצגו להקנות עמידות לוירוסים בצמחים הם גם הוכחו להסדיר כמה תהליכי האריתרוציטים, כוללים כדוריות דם אדום 11,12 וחילוף חומרי ברזל 13. מחקרים קודמים זיהו אוכלוסייה עשירה ומגוונת של miRNAs האריתרוציטים, ביטוי שהיה שינה באופן דרמטי בHBSS אריתרוציטים 14,15. מאז אריתרוציטים בוגרים חסרי שעתוק ותרגום פעילים, התפקיד הפונקציונלי של miRNAs כדורית אדומה אלה עדיין לא ברור. כתמורה חומרית משמעותית מתרחשת בין התא המארח ופ falciparum במהלך המחזור ההתפתחותי intraerythrocytic (IDC) 16, שהעריך כי פרופיל מירנה שינה בתוך אריתרוציטים HBS עשוי תורם ישירות להתנגדות מלריה תא פנימי.

מחקרים אלה הובילו בסופו לפיתוח של צינור לבודד, לזהות ותפקודי ללמוד את התפקיד של מירנה אדם בתוך מ 'טפיל alaria, פ falciparum, אשר ציין כי miRNAs אדם המארח / אלה סופו של דבר קוולנטית נתיך ולאחר מכן translationally להדחיק תעתיקי mRNA טפיל 17. זה סיפק דוגמא של התמלילים הראשונים בין מיני chimeric נוצרו על ידי טרנס שחבור ומפליל שהיתוך מירנה-mRNA זה יכול להיות מתרחש במינים אחרים, כוללים טפילים אחרים. כל mRNAs trypanosome הם עם אחוי-מנהיג (SL)-שחבור טרנס להסדיר את ההפרדה של תמלילי polycistronic 18. מאז פ falciparum חסר orthologs לדייסר / לפני 19,20, זה אפשרי, כי miRNAs כדורית אדומה לחטוף מכונות SL דומות בפ falciparum להשתלב גני המטרה. מחקרים שנעשה לאחרונה בפ falciparum יש למעשה הצביע על הנוכחות של 5 רצפים 'מנהיג אחוי 21. מחקר זה מפרט את השיטות שהובילו לגילוי של תמלילי היתוך אנושי-טפיל מירנה-mRNA, כולל שני transcriptomic ותרגומיםטכניקות רגולציה tional. המטרות הכללית של שיטות אלה הן לחקור את ההשפעות של RNA הקטן בפוטנציאל ויסות הגנים, פנוטיפים ותרגום של פ תמלילי falciparum.

זיהוי הראשוני של תמלילי chimeric אדם טפיל לסמוך על שימוש בטכניקות ניתוח RNA, כמו בזמן אמת PCR, רצף transcriptome ולכידת ספריית EST, שכלל שני RNAs כולל וקטן, ולא תוך שימוש בטכניקות שרק מבודדת RNA קטן. בידוד כל RNA יחד בבריכה אחת גדולה, ולא בנפרד, אפשר זיהוי של שני RNA הקטן אדם translocated בטפיל, כמו גם נוכחות של רצפי RNA הקטנים אלה כחלק מרצף גדול יותר. אז זה נדרש ניתוח של מצב התרגום של mRNAs ההיתוך אלה כדי לקבוע את ההשלכות התפקודיות של שילובים אלה.

בעוד מאמצים רבים באפיון הגנום של הטפילtranscriptome ד הוסיפה להבנת הביולוגיה של הטפיל 22-25, הרבה פחות ידוע על תקנת translational של transcriptome mRNA על פני מחזור החיים של פ falciparum 26. הבנה מוגבלת זו של proteome של הטפיל הפריעה שתי הבנה של הביולוגיה של הטפיל ואת היכולת לזהות מטרות חדשות עבור הדור הבא של תרופות נגד מלריה. פער בהבנה של הביולוגיה התאית של הטפיל זה נמשך במידה רבה בשל חוסר טכניקות נאותות לחקור רגולציה translational בפ falciparum. נייר האחרון אחד תאר את השימוש בfootprinting ריבוזומלי של פ falciparum כדי לקבוע את מצב התרגום העולמי 21. אחת מדידה מבוססת היטב של פוטנציאל translational של תמלילים היא מספר הריבוזומים קשורים נקבעים על ידי polysome פרופיל. עם זאת, כאשר טכניקה זו מיושמת לפ falciparum </ Em>, זה לא יכול לשחזר את רוב polysomes ולוכד בעיקר monosomes. לאחרונה, מספר קבוצות 27,28 אופטימיזציה פ טכניקות polysome falciparum ידי lysing כדורית אדומה וטפיל בו זמנית לשמור על polysomes ולאפיין את תפוסת ריבוזומלי ופוטנציאל translational של טפילי מלריה אלה במהלך ההתפתחות מינית שלהם בתאים אדומים מארח 28.

באופן קולקטיבי, שיטות אלה להוכיח כי ההיתוך הנצפה של mRNAs מירנה והטפיל האנושי מודולציה תרגום חלבון טפיל של mRNAs ההיתוך אלה, שהודגם בשיטות שדווחו בעבר 27, והוא הקובע עיקרי של התנגדות מלריה בHBAs וHBSS אריתרוציטים 17. שיטות אלה יהיו שימושיות בכל מערכת מחפשת לזהות ופונקציונלי לחקור אירועי שחבור רנ"א, אם RNAs ההיתוך אלה נמצאים בפ falciparum או מערכות אחרות אוקריוטים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1: בידוד של RNAs הקטן בגודל מפ falciparum במהלך IDC

  1. להשיג טפילי מלריה בתרבות מינית 29.
    הערה: גודל התרבות הנדרשת ישתנה מבוסס על היישום הרצוי; עם זאת, תרבות 10 מיליליטר בהמטוקריט 3-5 parasitemia% ו -5% מספקת RNA בשפע בזמן אמת PCR (RT-PCR). הטכניקה תחילה מותאמת לתרבויות אסינכרוני, אך כאשר נקודות זמן מסוימות במהלך מחזור הזיהום הן רצויים, ניתן לסנכרן טפילי טבעת שלב-ידי סנכרון סורביטול לא יאוחרו מהפוסט-10-12 שעות פלישה. סנכרון יש לחזור אחרי מחזור אחד (כ 48 שעות) 29.
  2. תאים נגועים בריכה יחד (~ 5 x 10 9 RBCs ב3-5% parasitemia) ולמלא את PBS הקר לחלק העליון של הצינור צנטריפוגות ב 800 XG במשך 5 דקות ללא בלם לגלולת התאים האדומים.
  3. לאחר צנטריפוגה, להסיר את supernatant באמצעות פיפטה aspirating בזהירות, מצורףלואקום, מאז גלולה האריתרוציטים קל לעקור. שטוף את הכדור פעם נוספת עם 1x הקר PBS.
  4. גלולה גלולה תא בsaponin 0.15% הקרים (ב1x PBS) ומניחים על קרח למשך 30 דקות.
  5. תאי צנטריפוגה ב 1500 XG דקות 12 ב 4 ° C, להסיר supernatant (אשר יהיה אדום כהה בצבע) וגלול גלול בPBS הקר. חזור על פעולה זו פעם נוספת.
    הערה: על מנת להבטיח שמייקרו RNA נכח רעיוני של מיקרו RNA בתוך טפילים, ולא זיהום האריתרוציטים, מספר תנאי בידוד הטפיל נבדק: 1) תמוגה saponin, 2) בשילוב עם טיפול תמוגה saponin RNaseA של miRNAs תא המארח ו -3 ) מתיל-ביתא-cyclodextrin טיפול כדי להסיר את הטפיל מכדורי האדום המארח. כל הטיפולים נתנו תוצאות דומות.
  6. Lyse גלולה הטפיל המבודד באמצעות 600 μl המומלץ של מאגר תמוגה. נפח זה של מאגר תמוגה מספיק לתרבויות עד ~ 30 מיליליטר בהמטוקריט 2% וparasitemia 5%.
    הערה: לתרבויות טפיל גדולות יותר, ניתן להגדיל נפח זה. חשוב להבטיח תמוגה של גלולה הטפיל מלאה על ידי vortexing היסודי דקות לפחות 1. כמו כן, על מנת להקל על חילוץ, ניתן להעביר דגימות lysed לצינור 1.7 מיליליטר microcentrifuge.
  7. הוסף 60 μl, או 1/10 נפח של מאגר תמוגה משמש בשלב 6, של תוסף homogenate (אצטט 2 M נתרן, pH 4).
  8. השאר על דגימות קרח למשך 10 דקות.
  9. להוסיף 600 μl, או נפח שווה לסכום של חיץ תמוגה הוסיף בשלב 6, של choloroform פנול חומצה לכל דגימה ומערבולת דקות 1.
  10. הפרד את השלבים מימיים ואורגניים על ידי צנטריפוגה הדגימות ב10,000 XG במשך 5 דקות. הספין הזה הוא יותר מזה שהוצע על ידי הערכה כדי להבטיח שכל המוגלובין / hemozoin הוא בשלב האורגני.
  11. אסוף את השכבה העליונה (המימית) ולהעביר אותו לצינור טרי. חזור על שלבים 9 ו -10, אם את השלב המימי הוא לבן או חום (סביר יותר) בצבע, אשר טוען פרוזיהום חלבון.
  12. לקבוע את עוצמת הקול של supernatant וכתוצאה מכך על ידי פיפטה ולאחר מכן להוסיף 1.25 כרכים של 100% אתנול (~ 800 μl) ומערבבים על ידי היפוך צינור microcentrifuge 1.7 מיליליטר 5 פעמים.
  13. להעביר בכל מדגם באמצעות מחסנית מסנן מחייב RNA סיפקה (כמה שונה מהם זמינים באופן מסחרי) או על ידי צנטריפוגה ב14,000 XG דקות 1 או באמצעות סעפת ואקום.
  14. לשטוף את מחסנית המסנן עם 700 μl של מירנה לשטוף חיץ 1 באמצעות microcentrifuge, מסתובב ב14,000 XG דקות 1.
  15. לשטוף את מחסנית המסנן עם חיץ לשטוף 500 μl 2/3 פעמיים על ידי צנטריפוגה ב14,000 XG דקות 1 כל אחד.
  16. Elute RNA עם 100 DEPC מים μl, שחומם מראש ל -95 מעלות צלזיוס, בשתי שטיפות של 50 μl, צנטריפוגה ב14,000 XG דקות 1 כל אחד. למדוד את הריכוז של RNA באמצעות ספיגת UV ב 260nm.
    הערה: ג'ל RNA (או acrylamide TBE-אוריאה או ג'ל agarose פורמלדהיד denaturing) יכול בהדואר משמש כדי להעריך את התפלגות הגודל של RNAs המבודד.
    הערה: RNA זה מתאים לניתוח על ידי microarray, RNA-רצף, כתם צפוני וassay הגנת ribonuclease.

2: Quantitation של RNAs הקטן בגודל מפ falciparum במהלך IDC

  1. קבע את הריכוז של דגימות בודדות מבודדות בשלב 1 באמצעות ספקטרופוטומטריה UV ב 260 ננומטר.
  2. צור פריימרים PCR בזמן אמת למיני RNA הרצויים. למירנה לבד, השתמשנו מבחני מירנה qPCR premade, ואילו עבור mRNAs או היתוך מירנה-mRNA עיצבנו פריימרים לSYBR ירוק. לRNAs ההיתוך, פריימר קדימה היה רצף מירנה עצמו (miR-451: AAACCGTTACCATTACTGAGTT), בעוד שההפך היה פריימר ~ 100 נ"ב גן ספציפי במורד זרם של מירנה ברצף ה- mRNA (PKA-R: ATCGAACATGCTGTGAACAT).
  3. הפוך cDNA מדגימות RNA או באמצעות סיכת ראש פריימר לmiRNAs (להשתמש 20-40 ng של RNA) לבד או hexamers האקראית לmRNA ו / או מירנהמיני היתוך -mRNA (באמצעות 1 מיקרוגרם של רנ"א). מערבבים RNA ופריימרים במשך 5 דקות על 65 מעלות צלזיוס, אז להתקרר לטמפרטורת חדר. לאחר מכן, להוסיף תערובת טרנסקריפטאז (0.5 μl הפוך transcriptase, 0.5 מעכב RNase μl, dNTPs 1 μl (2.5 מ"מ כל אחד), 4 μl 5x חיץ, 0.1M DTT 2 μl, 1 μl H 2 O).
    1. דגימות לרוץ על thermocycler מסוגל לאתר או בדיקות ירוקות או TaqMan SYBR. SYBR הירוק כמותי 30 PCR לגנים ספציפיים לרוץ כמו 3 שלבים PCR, 95 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, חישול בטמפרטורה הנמוכה ביותר פריימר מינוס 5 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, ו -68 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 40 מחזורים, באמצעות SYBR המסחרי תערובת הורים ירוקה. מירנה PCR בזמן אמת היה לרוץ כמו PCR שני שלבים, 95 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות ו 60 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות, במשך 40 מחזורים.
    2. לכמת מבחני בשיטת ΔΔCt ולנרמל אותם נגד שני ראב GTPase (PF08_0110) או 18S rRNA 31.

3: מבואשל RNA הקטן לטפילי מלריה

  1. גלולה 300 μl של תאי דם אדומים לכל transfection (250 μl של תאי דם אדום, כ 1.5 x 10 9 תאים, סופו של דבר לשמש) בתקשורת מלריה מלאה על ידי צנטריפוגה ב 800 XG במשך 5 דקות בבלם 1.
  2. שטוף את אריתרוציטים פעמיים עם RPMI וגלול בcytomix המלא (120 מ"מ KCl; 0.15 מ"מ CaCl 2; 10 מ"מ K 2 HPO 4 / KH 2 PO 4, pH 7.6; 25 מ"מ HEPES, pH 7.6; 2 מ"מ EGTA, pH 7.6; 5 מ"מ MgCl 2; pH מותאם עם KOH) בהמטוקריט של 50% לאחר צנטריפוגה ב 800 XG במשך 5 דקות בבלם 1.
  3. להעביר את תאי קובט electroporation 0.2 סנטימטר.
  4. להוסיף 10 מיקרוגרם, או מתאים סכום, של oligonucleotides הסינתטי מותאם אישית לcuvettes וresuspend התרבויות.
  5. התאם את electroporator 310 V / 950 μF ולספק דופק לכל קובט.
  6. Resuspend 300 μl של תאי דם אדומים בתוך קובט בטרום חימם mal המלאותקשורת אריה צלחת אותם ב 24 צלחות גם ולדגור על 37 מעלות צלזיוס בכלי אטום עם תערובת גז דם מלריה (3% O 2, 5% CO 2).
  7. לאחר 4 שעות, להדביק RBCs transfected עם trophozoites מאוחר המסונכרן לparasitemia הסופי משוער של 1%.
  8. להוסיף RBCs הטרי transfected כל 4-6 ימים לתרבויות נגועות ולקבוע את parasitemia% על ידי FACS באמצעות מכתים YoYo-1, כפי שצוין בסעיף 4.

קביעת כדורית אדומה מיקרו RNA ההשפעה על שיעור זיהום טפיל: 4

  1. קח תרבות המושעית 100 μl ידי micropipettor ומקום בצינור 1.7 מיליליטר microcentrifuge. לשטוף פעמיים עם 1 מיליליטר של 1x PBS ו צנטריפוגות בmicrocentrifuge שולחן על ידי צנטריפוגה ב 800 XG במשך 5 דקות.
  2. Resuspend גלולה ב 1 מיליליטר של glutaraldehyde 0.025%. דגירה דגימות עבור 20 דקות ב RT.
    ניתן לאחסן דגימות כאן במשך כמה שבועות ב 4 ° C: הערה. לאחר מכן, גלולה R הנגועBCS ידי צנטריפוגה ב 800 XG במשך 5 דקות. לשטוף פעמיים עם 1 מיליליטר של 1x PBS.
  3. Resuspend גלולה ב 1 מיליליטר של saponin 0.015%. דגירה על 4 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. גלולה נגועה RBCs ידי צנטריפוגה ב 800 XG במשך 5 דקות. לשטוף פעמיים עם 1 מיליליטר של 1x PBS. Repeat.4.3. תאי Resuspend ב 1 מיליליטר של 1x PBS המכיל 1 μl כתם DNA (1,000X).
  4. לקבוע את מעלות של parasitemia על cytometer זרימה, ב 488 ננומטר עירור ו~ 530 ננומטר פליטה (FL-1).
  5. ראשית, שער cytometer הזרימה המבוסס על FSC וSSC להתמקד בתאי דם אדומים. אז למדוד את מעלות של parasitemia (RBCs הנגוע) בRBC המגודר על ידי הקרינה בערוץ FL-1.
    הערה: טפילי שלב מאוחר יותר הם 10X יותר מאשר ניאון טפילי שלב מוקדם יותר, ו~ 100X מעל RBCs נגוע. כמו כן, איסוף במהירות נמוכה נוטה להפחית את הרעש. לבסוף, גישה זו כבר לעומת 3 התאגדות H-hypoxanthine וצביעת Giemsa, שניהם כפי שדווחו בעבר 13, וכל גב הטכניקותדואר תוצאות דומות.

5: ביוטין התיוג וElution של mRNA-מירנה מוצרי היתוך

  1. ישירות להזמין oligonucleotides הסינתטי מותאם אישית RNA עם desthiobiotin (Db-) קוולנטית צמודה עד סוף '5.
  2. Transfect RBCs נגוע עם מצומדות-Desthiobiotin (Db-) מירנה ומירנה ללא שינוי (שליטה שלילית), כפי שצוין בשלב 3.
  3. להדביק RBCs transfected עם פ falciparum הטפיל לparasitemia מתחיל של 0.5% (שלב 1.1).
  4. לחלץ RNA טפיל 4 ימים (96 שעות) מאוחר יותר, כמתואר לעיל בשלב 1.
  5. דגירה 10 מיקרוגרם של רנ"א טפיל עם 50 μl ארוז חרוזים streptavidin, הוסיף באמצעות micropipette, ולסובב על הכתף צינור microcentrifuge במשך שעה 1 ב 4 מעלות צלזיוס.
  6. גלולה חרוזים ב 800 XG במשך 30 שניות ולשטוף עם 20 מ"מ KCl ו 1/1000 RNase מונעי.
  7. Elute RNAs מהחרוזים על ידי תחרות עם ביוטין 2 מ"מ ועם 200 מאגר elution לכידת RNA μl (20 מ"מ KCl, 1/1, ביוטין 000 RNase מונעי ו -2 מ"מ) בשעת 4 מעלות צלזיוס לילה עם רוטציה.
  8. לקבוע את מידת ההעשרה של פ הצביע תמלילי falciparum באמצעות SYBR qRT-PCR ירוק, והעשרת microRNA (ביקורת חיובית) על ידי TaqMan qPCR כפי שצוין בשלב 2.

6: הפרדת Polysome לקביעת תפוסה ריבוזומלי של פ falciparum

  1. מקום 5 מיליליטר של 15% תמיסת סוכרוז (400 מ"מ אצטט אשלגן, HEPES אשלגן 25 מ"מ, pH 7.2, אצטט מגנזיום 15 מ"מ, 200 מיקרומטר cycloheximide, 1 מ"מ DTT, 1 מ"מ PMSF, 40 U / ml RNase מונעי, וסוכרוז 15% ) לתוך צינור SW41 ultracentrifuge (14 x 89 מ"מ).
  2. באמצעות מזרק 5 מיליליטר, להוסיף 5 מיליליטר של 50% תמיסת סוכרוז (400 מ"מ אצטט אשלגן, HEPES אשלגן 25 מ"מ, pH 7.2, אצטט מגנזיום 15 מ"מ, 200 מיקרומטר cycloheximide, 1 מ"מ DTT, 1 מ"מ PMSF, 40 U / RNase מיליליטר מעכב, ו -50% סוכרוז) מתחת לסוכרוז 15% באמצעות מחט פלדה ארוכה, ולאחר מכן להסיר את המחט.
  3. חותם את החלק העליון של צינור השיפוע עם Parafilm, להטות את הצינור לאט על צדו, בעמדה יציבה כדי למנוע את ההידרדרות, ולכן הוא שוכב במאוזן על השולחן. שמור את הצינור בצד שלה לפחות 2 שעות. בזמן ההמתנה, להתחיל עם צעד 6.5.
  4. לאחר 2 שעות, להטות לאט הצינור בחזרה זקופה ולהעביר את הצינור לקרח, המאפשר לה להתקרר במשך לפחות 15 דקות לפני לטעום טעינה (שלב 14).
  5. לאסוף מספיק תרבות שלב דם -infected Plasmodium לייצר 100-500 מיקרוגרם של רנ"א הכל, או בערך תרבות אסינכרוני 100 מיליליטר בparasitemia 3-5%. להוסיף 1/10 ה נפח של מדיום התרבות המכיל 10x (2 מ"מ) cycloheximide (chx) ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
    1. תרבויות גלולה על ידי צנטריפוגה XG ב 500 דקות 7 עם צנטריפוגות (בלם 1), ולאחר מכן לשטוף פעמיים עם טמפרטורת חדר 1x PBS המכיל 200 chx מיקרומטר. Resuspend תרבויות הטפיל ב1x PBS המכילות 200 chx מיקרומטר ולאחסן על קרח.
  6. להעריך את הנפח של גלולה RBC. הוסף חוצץ תמוגה (400 אצטט אשלגן מ"מ, 25 מ"מ HEPES אשלגן, pH 7.2, אצטט מגנזיום 15 מ"מ, 200 chx מיקרומטר, 1 מ"מ DTT, 1 מ"מ PMSF, 40 U / RNase מונעי מיליליטר, 1% (V / V) IGEPAL CA -630, ו -0.5% (w / v) DOC) לגלולת RBC לנפח סופי של 4.25 מיליליטר. דגירה lysate ב 4 ° C במשך 10 דקות תוך סיבוב.
  7. העבר את lysate לצינורות microcentrifuge, ואז צנטריפוגות הדגימות בmicrocentrifuge ב16,000 XG ו -4 ° C במשך 10 דקות.
  8. הכן כריות סוכרוז על ידי pipetting 1.25 מיליליטר של תמיסת סוכרוז כרית הקרה 0.5 M (400 מ"מ אצטט אשלגן, HEPES אשלגן 25 מ"מ, pH 7.2, אצטט מגנזיום 15 מ"מ, 200 מיקרומטר cycloheximide, 1 מ"מ DTT, 1 מ"מ PMSF, 40 U / RNase מיליליטר מעכב, ו 0.5 M סוכרוז) לתוך צינור SW55 ultracentrifuge (13 x 51 מ"מ).
  9. שכבה בזהירות 3.75 מיליליטר של supernatant lysate (מצעד 7) על גבי כרית סוכרוז באמצעות מזרק וקטן (~ 27) מחט מד. Storדואר lysate הנותר (~ 500 μl) ב -80 ° C כדי לחלץ רמות RNA מוחלטת, כפי שצוין בסעיף 1.
  10. טען את הדגימות לתוך הרוטור ultracentrifuge, טרום צונן עד 4 מעלות צלזיוס, אשר יכול להכיל 13.2 מיליליטר צינורות. צנטריפוגה דגימות ב366,000 XG ו -4 מעלות צלזיוס במשך 146 דקות.
  11. בעזרת פיפטה, להעביר את supernatant לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל. אחסן את supernatant ב -80 ° C לבידוד RNA של חופשי RNAs (מאוגד על ידי הריבוזומים).
  12. Resuspend גלולה הריבוזום ב500 μl של חיץ resuspension הריבוזום (400 מ"מ אצטט אשלגן, HEPES אשלגן 25 מ"מ, pH 7.2, אצטט מגנזיום 15 מ"מ, 200 מיקרומטר cycloheximide, 1 מ"מ DTT, 1 מ"מ PMSF, ו -40 U / RNase מונעי מיליליטר) על ידי pipetting במשך 5 דקות.
  13. צנטריפוגה הדגימות בmicrocentrifuge ב16,000 XG ו -4   ° C במשך 10 דקות.
  14. תוך שמירה על שיפוע צעד המס '4 על קרח, להסיר את Parafilm, אז שכבה בזהירות ההשעיה הריבוזום על גבי USI השיפועng מזרק וקטן (~ 27) מחט מד.
  15. טען את הצינור לתוך הרוטור ultracentrifuge טרום צונן צנטריפוגות הדרגתיים העמוס ב 200,000 XG ו -4 מעלות צלזיוס במשך 180 דקות. כאשר הספין הושלם, חנות centrifuged הדרגתיים על 4 מעלות צלזיוס עד מוכן לטעון על fractionator.
  16. לטעון צינור ultracentrifuge ריק לfractionator השיפוע (זה יכול להיות צינור המשמש בריצה קודמת), ולאחר מכן לשטוף עם מים RNase חינם למשך 5 דקות ב 100 x 10 מהירות.
  17. במהלך השטיפה בשלב 6.16, לקבוע את רמת הרגישות של הגלאי ספיגה UV. רגישות התחלה טובה היא 0.2, אבל זה עשוי להיות מותאם בהמשך נגמר בהתאם לאות 254 (שמשתנית בהתאם למספר טפיל, וכו ').
  18. ברגע שרגישות הגלאי מוגדרת, להגדיר את אות הבסיס לאפס ואילו מים זורמים דרך הגלאים.
  19. לאחר שטיפת אספן החלק, להפוך את זרימת הנוזל עד הקווים ריקים ולאחר מכן remאובה צינור ultracentrifuge הריק.
  20. הפעל 60% תמיסת סוכרוז דרך fractionator עד יציאתו ממנגנון המחט.
  21. הכנס את הצינור המכיל את השיפוע הראשון בחלק העליון של תא הטעינה ולהדק את החותם, נזהר שלא להדק יותר. לאחר מכן, לנקב את החלק התחתון של הצינור עם המחט.
  22. איפוס מהירות זרימת נוזל ל12.5 x 10 (הנשלטים על ידי כפתור בקרת מהירות זרימה בחלק הקדמי של המשאבה), לאחר מכן קבע את אספן החלק האוטומטי לאיסוף שברים 18 שניות (~ 330 μl / חלק) בצינורות microcentrifuge.
  23. התחל קדימה זרימה של תמיסת סוכרוז 60%.
  24. כאשר הירידה הראשונה של פתרון השיפוע יורדת לתוך צינור microcentrifuge, להתחיל מייד שניהם אוסף חלק והקלטת חיה של אות 254.
  25. ברגע שירידה חדה נצפתה באות 254, מתאימה לממשק בין פתרונות סוכרוז 50% ו -60%, לעצור שתי זרימת הנוזל ו254 הקלטת UB.
  26. אחסן את השברים השיפוע ב -80   ° C לשימוש מאוחר יותר.
  27. הפוך את זרימת הנוזל ב100 x 10 מהירות עד פתרון סוכרוז 60% מתרוקן של צינור ultracentrifuge.
  28. אם יש מילויים נוספים לfractionate, להסיר את צינור ultracentrifuge הריק מתא הטעינה ולהפעיל מחדש מצעד 6.21. אם כל הדגימות הושלמו, לשטוף את המנגנון כפי שבוצע בשלבים 6.16 ו6.19.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

פרופיל עולמי של microRNA האנושי בפ falciparum

הטכניקות שהוצגו כאן שמשו כדי לחלץ מיקרו-רנ"א מטפילים במגוון רחב של מצבים. דבר אחד שיש לציין הוא כי עקירות RNA לRBCs נגוע בוצעו כפי שצוינה ב -32, אשר לעתים קרובות שימשו כנקודת התייחסות לנתונים שהוצגו בשני microRNA מאמר זה והמחקר המקורי 29. אלה מחקרים הקודמים הראו גם כי אריתרוציטים HBSS דיבוק רמות הרבה יותר של miRNAs מסוים, miR-451 בפ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

HBS הוא אחד גרסאות המוגלובין הנפוצות ביותר באזורים אנדמיים למלריה, במידה רבה משום שהוא מספק הגנה מפני מלריה חמורה שנגרמה על ידי פ ' falciparum. הטכניקות דרושות כדי לאפיין את התפקיד של microRNA האנושי בויסות הגנים של פ falciparum מפורטים בכל כתב היד הזה. על ידי מיצוי RNA הכולל באופן שיכלול את כל RNA הקטן כזה, ועל ידי ביצוע הליך תמוגה הטפיל פשוט יחסית, RNAs ההיתוך אלה היו יכולים להיות מזוהים באמצעות מגוון רחב של טכניקות עצמאיות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין אינטרסים כלכליים מתחרים להצהיר עליהם.

תודות

מחקר זה מומן על ידי קרן הצדקה דוריס דיוק, קרן בורוז וולקאם, R21DK080994 ה-NIH, קרן פרויקט הפיילוט של דיוק צ'נסלור, קרן רוש לחקר אנמיה וקרן ביל ומלינדה גייטס. G.L. נתמך על ידי UPGG של דיוק וה-NIH (מענק # 5R01AI090141-03) ו-K.A.W. על ידי תוכנית מלגות המחקר לתארים מתקדמים של NSF.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>ריאגנטים-כל הריאגנטים חייבים להיות נטולי RNAse.
Diethyl פירוקרבונטSigmaD5758DEPC
DEPC מים מטופלים (ראה הגדרת ריאגנטים)
Yoyo-1 DNA צבע פלואורסצנטיThermo Fisher
Gene Pulser II אלקטרופורטורBio-Rad
0.2 ס"מ קובטות
4 מ' אשלגן אצטטמלינקרודט6700
2 מ' אשלגן HEPESסיגמאH0527pH 7.2
1 מ' מגנזיום אצטטסיגמאM-2545
1 מ' דיתיותרייטולמוצרי מחקר בינלאומייםD11000DTT
100 מ"מ פניל מתיל-סולפונאט פלואורידסיגמאP7626PMSF, מומס באיזופרופנול
10% (v/v) Igepal CA-630Sigma-AldrichI3021
10% (w/v) נתרן דאוקסיכולאטSigmaD-6750DOC
CycloheximideSigmaC-7698CHX
SucroseMallinckrodt8360-04
RNAseOUT (Invitrogen, מס' קט' 100000840)Invitrogen
RPMI-1640 עם L-גלוטמיןCellgro10-040-CV
10% AlbuMAX IInvitrogen11020-039w/v במים סטריליים
GentamicinGibco15750-060
תוסף HT (100x) (Invitrogen, מס' קט' 11067030)
45% (w/v) סוכרוז (סיגמא, מס' קט' G8769)
1 M מאגר HEPES (Gibco, מס' קט' 15630-080)
1x מי מלח חוצץ פוספט (PBS; Cellgro, חתול. מס' 2109310CV)
בקבוק מסנן ואקום קורנינג 500 מ"ל (VWR, מס' קט' 430769)
שקופיות זכוכית (VWR, מס' קט' 48311-702)
כתם גימסה (50X) (VWR, מס' קט' m708-01)
ערכת בידוד mirVana miRNA (אמביון, ThermoFisher Scientific).
miRNA בוגר מצומד ביוטין 5' (הרצף משתנה לפי miRNA מעניין) (דהרמקון)
אבקת ביוטין (סיגמא-אולדריץ')
1 מ' אשלגן כלורי
סטרפטווידין ספרוז חרוזים בעלי ביצועים גבוהים (GE Healthcare)
מאגר השעיה מחדש של ריבוזום (ראה הגדרת ריאגנט)
מאגר ליזה (ראה הגדרת ריאגנטים)
15% (w/v) תמיסת שיפוע סוכרוז (ראה הגדרת ריאגנטים)
50% (w/v) תמיסת שיפוע סוכרוז (ראה הגדרת ריאגנטים)
כרית סוכרוז 0.5 מ' (ראה הגדרת ריאגנט)
60% (w/v) תמיסת מרדף סוכרוז (ראה הגדרת ריאגנטים)
מדיה של תרבית תאי פלסמודיום (ראה הגדרת ריאגנט)
מאגר שטיפה של לכידת RNA (ראה הגדרת ריאגנט)מאגר
סילוק RNA (ראה הגדרת ריאגנט)
<חזק>הגדרת ריאגנט
<חזק>פתרונות
<חזק>מדיה לתרבית תאי פלסמודיום
500 מ"ל RPMI-1640 עם L-גלוטמין
0.5 מ"ל גנטמיצין
5 מ"ל תוסף
2.5 מ"ל 45% גלוקוז
25 מ"ל 10% AlbuMAX I
12.5 מ"ל 1 M HEPES
פילטר סטרילי עם בקבוק מסנן ואקום 0.2 מ"מ.
<חזק>אמצעי תרבית תאי פלסמודיום המכיל 10x CHXאותו
מתכון כמו אמצעי תרבית תאי פלסמודיום לעיל, בתוספת של:
2 מ"מ ציקלוהקסימיד
מדיה מוכנה כרגיל, ואז להוסיף CHX לריכוז סופי של 2 מ"מ ולסנן. 
<חזק>1x PBS המכיל ציקלוהקסימיד
ציקלוהקסימיד מתווסף טרי ל-1x PBS לריכוז סופי של 200 מ"מ, ונשמר ב-4 OC עד לשימוש.
<חזק>מאגר השעיה ריבוזום
400 מ"מ אשלגן אצטט
25 מ"מ אשלגן HEPES, pH 7.2
15 מ"מ מגנזיום אצטט
200 מ"מ ציקלוהקסימיד (הוסף טרי)
1 מ"מ DTT (הוסף טרי)
1 מ"מ PMSF (הוסף טרי)
40 U/ml RNaseOUT (הוסף טרי)
<חזק>מאגר ליזה
זהה למאגר השעיית ריבוזום למעלה, בתוספת של:
1% (v/v) Igepal CA-630
0.5% (w/v)
Sucrose
זהה למאגר השעיית ריבוזום לעיל, בתוספת כמויות משתנות של סוכרוז:
15% (w/v) סוכרוז ליצירת תמיסת
שיפוע סוכרוז של 15%50% (w/v) סוכרוז להכנת תמיסת
0.5 M סוכרוז להכנת כרית
כאמור לעיל, יש להוסיף טרי ציקלוהקסימיד, DTT, PMSF ו-RNaseOUT.
תמיסת המרדף של 60% סוכרוז דורשת רק סוכרוז ומים, ללא רכיבים
60% (w/v) סוכרוז במים שטופלו ב-DEPC כדי ליצור תמיסת
<חזק>RNA לכידת מאגר כביסה
20 mM  KCl
5 יחידה/מ"ל Rnase Out (Invitrogen)
RNA Capture Elution Buffer
אותו מתכון כמו RNA Capture Wash Buffer, בתוספת של:
2 מ"מ ביוטין
רוטור אולטרה-צנטריפוגה <חזק>ציוד
SW55 Ti (בקמן, מס' קט' 342194)
רוטור אולטרה-צנטריפוגה SW41 Ti (בקמן, מס' קט' 331362)
Ultra-ClearTM ½ צינורות אולטרה-צנטריפוגה בגודל 13 x 51 מ"מ (13 x 51 מ"מ) עבור SW55 (בקמן, מס' קט' 344057)
פוליאלומר 9/16 x 3 ו-frac12; בצינורות אולטרה-צנטריפוגה (14 x 89 מ"מ) עבור SW41 (בקמן, מס' קט' 331372)
L8-80M אולטרה-צנטריפוגה (בקמן)
מחט מזרק קהה מפלדה, 4 אינץ', 16 גרם (אולדריץ', מס' קט' Z261378)
מזרק 1 מ"ל עם 27 G½ מחט (בקטון דיקינסון, מס' קט' 309623)
מזרק 5 מ"ל (בקטון דיקינסון, מס' קט' 309646)
מסובב צינור
מערכת פיצול שיפוע צפיפות
TracerDAQ (מחשוב מדידה)
רוטור Eppendorf A-4-81 (Eppendorf, מס' קט' 022638807)
אלקטרופורציה100000840HT תמיסות DOCשיפוע סוכרוז 50%סוכרוז 0.5 Mאחרים מרדף סוכרוז 60% Parafilm, מיקרוצנטריפוגה מקצה לקצה, בקירור (Teledyne Isco, מס' קט' 69-3873-179)צנטריפוגה Eppendorf 5810R

מקורות

  1. World Health Organization. World Malaria Report. , (2014).
  2. Livincstone, F. B. Malaria and human polymorphisms. Annu Rev Genet. 5, 33-64 (1971).
  3. Nagel, R. L., Roth, E. F. Malaria and red cell genetic defects. Blood. 74, 1213-1221 (1989).
  4. Aidoo, M., et al. Protective effects of the sickle cell gene against malaria morbidity and mortality. Lancet. 359, 1311-1312 (2002).
  5. Tiffert, T., et al. The hydration state of human red blood cells and their susceptibility to invasion by Plasmodium falciparum. Blood. 105, 4853-4860 (2005).
  6. Fairhurst, R. M., et al. Abnormal display of PfEMP-1 on erythrocytes carrying haemoglobin C may protect against malaria. Nature. 435, 1117-1121 (2005).
  7. Cyrklaff, M., et al. Hemoglobins S and C interfere with actin remodeling in Plasmodium falciparum-infected erythrocytes. Science. 334, 1283-1286 (2011).
  8. Friedman, M. J. Erythrocytic mechanism of sickle cell resistance to malaria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75, 1994-1997 (1978).
  9. Pasvol, G., Weatherall, D. J., Wilson, R. J. Cellular mechanism for the protective effect of haemoglobin S against P. falciparum malaria. Nature. 274, 701-703 (1978).
  10. Lecellier, C. H., et al. A cellular microRNA mediates antiviral defense in human cells. Science. 308, 557-560 (2005).
  11. Niu, Q. W., et al. Expression of artificial miroRNAs in transgenic Arabidopsis thaliana confers virus resistance. Nature biotechnology. 24, 1420-1428 (2006).
  12. Zhao, G., Yu, D., Weiss, M. J. MicroRNAs in erythropoiesis. Curr Opin Hematol. 17, 155-162 (2010).
  13. Lee, Y. T., et al. LIN28B-mediated expression of fetal hemoglobin and production of fetal-like erythrocytes from adult human erythroblasts ex vivo. Blood. 122, 1034-1041 (2013).
  14. Sangokoya, C., Doss, J. F., Chi, J. T. Iron-responsive miR-485-3p regulates cellular iron homeostasis by targeting ferroportin. PLoS genetics. 9, e1003408(2013).
  15. Chen, S. Y., Wang, Y., Telen, M. J., Chi, J. T. The genomic analysis of erythrocyte microRNA expression in sickle cell diseases. PLoS ONE. 3, e2360(2008).
  16. Sangokoya, C., Telen, M. J., Chi, J. T. microRNA miR-144 modulates oxidative stress tolerance and associates with anemia severity in sickle cell disease. Blood. 116, 4338-4348 (2010).
  17. Deitsch, K., Driskill, C., Wellems, T. Transformation of malaria parasites by the spontaneous uptake and expression of DNA from human erythrocytes. Nucleic acids research. 29, 850-853 (2001).
  18. Liang, X. H., Haritan, A., Uliel, S., Michaeli, S. trans and cis splicing in trypanosomatids: mechanism, factors, and regulation. Eukaryotic cell. 2, 830-840 (2003).
  19. Baum, J., et al. Molecular genetics and comparative genomics reveal RNAi is not functional in malaria parasites. Nucleic acids research. 37, 3788-3798 (2009).
  20. Hall, N., et al. A comprehensive survey of the Plasmodium life cycle by genomic, transcriptomic, and proteomic analyses. Science. 307, 82-86 (2005).
  21. Caro, F., Ahyong, V., Betegon, M., DeRisi, J. L. Genome-wide regulatory dynamics of translation in the asexual blood stages. eLife. 3, (2014).
  22. Oehring, S. C., et al. Organellar proteomics reveals hundreds of novel nuclear proteins in the malaria parasite Plasmodium falciparum. Genome biology. 13, R108(2012).
  23. Lasonder, E., et al. Analysis of the Plasmodium falciparum proteome by high-accuracy mass spectrometry. Nature. 419, 537-542 (2002).
  24. Bozdech, Z., et al. The transcriptome of the intraerythrocytic developmental cycle of Plasmodium falciparum. PLoS biology. 1, E5(2003).
  25. Gardner, M. J., et al. Genome sequence of the human malaria parasite Plasmodium falciparum. Nature. 419, 498-511 (2002).
  26. Zhang, M., Joyce, B. R., Sullivan, W. J. Jr., Nussenzweig, V. Translational control in Plasmodium and toxoplasma parasites. Eukaryotic cell. 12, 161-167 (2013).
  27. Lacsina, J. R., LaMonte, G., Nicchitta, C. V., Chi, J. T. Polysome profiling of the malaria parasite Plasmodium falciparum. Molecular and biochemical parasitology. 179, 42-62 (2011).
  28. Bunnik, E. M., et al. Polysome profiling reveals translational control of gene expression in the human malaria parasite Plasmodium falciparum. Genome biology. 14, R128(2013).
  29. LaMonte, G., et al. Translocation of sickle cell erythrocyte microRNAs into Plasmodium falciparum inhibits parasite translation and contributes to malaria resistance. Cell host & microbe. 12, 187-199 (2012).
  30. Lambros, C., Vanderberg, J. P. Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture. The Journal of parasitology. 65, 418-420 (1979).
  31. Bourgeois, N., et al. Comparison of three real-time PCR methods with blood smears and rapid diagnostic test in Plasmodium sp. infection. Clinical microbiology and infection : the official publication of the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 16, 1305-1311 (2010).
  32. Abruzzo, L. V., et al. Validation of oligonucleotide microarray data using microfluidic low-density arrays: a new statistical method to normalize real-time RT-PCR data. Biotechniques. 38, 785-792 (2005).
  33. Sangokoya, C., LaMonte, G., Chi, J. T. Isolation and characterization of microRNAs of human mature erythrocytes. Methods in molecular biology. 667, 193-203 (2010).
  34. Rathjen, T., Nicol, C., McConkey, G., Dalmay, T. Analysis of short RNAs in the malaria parasite and its red blood cell host. FEBS Lett. 580, 5185-5188 (2006).
  35. Xue, X., Zhang, Q., Huang, Y., Feng, L., Pan, W. No miRNA were found in Plasmodium and the ones identified in erythrocytes could not be correlated with infection. Malar J. 7, 47(2008).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

מיקרו-RNA של תאי דם אדומיםפרופילינג פוליזומיםטרנספקציית RNAאנליזת RNA קטןזיהוי תמלילי איחודמחקר רגולציה גנטיתמנגנון עמידות למלריהשיטת העשרה של RNA
שיטות כדי לחקור את תפקיד הרגולציה של RNA הקטן וריבוזומלי תפוסה של
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.