מאמר שיטה

בימוי שיטת אבולוציה שמר האפייה: יצירת ספריית Mutant והקרנה

DOI:

10.3791/53761

⸱

1 באפריל 2016

 ,  , 
1Department of Biocatalysis, Institute of Catalysis, CSIC

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מציגים פרוטוקול מפורט לבנייה וסינון של ספריות מוטנטיות עבור מסעות אבולוציה מכוונים ב-Saccharomyces cerevisiae.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אבולוציה מכוונת ב שמר אפייה מציעה יתרונות רבים אטרקטיביים בעת תכנון אנזימים עבור יישומים ביוטכנולוגיים, תהליך כרוך בבנייה, שיבוט וביטוי של ספריות מוטציה, מצמיד את רקומבינציה DNA בתדר גבוה ההומולוגית in vivo. כאן, אנו מציגים פרוטוקול ליצור ספריות מוטציה מסך בשמרים המבוססת על הדוגמא של מונואמין aryl-אלכוהול פטרייתי (AAO) כדי לשפר את הפעילות הכוללת שלה. שני מקטעי חלבון היו נתונים האבולוציה ממוקד בבימויו של mutagenesis אקראי וב רקומבינציה DNA vivo. מסוכך של ~ 50 נ"ב איגוף בכל מגזר אפשר וההרכבה הנכונה של גן AAO-פיוז'ן וקטור לינארית והוליד פלסמיד משכפלים מלא באופן אוטונומי. ספריות Mutant מועשרות גרסות פונקציונליות AAO הוקרנו ס supernatants cerevisiae עם assay תפוקה גבוהה רגיש המבוססת על התגובה פנטון. התהליך הכללי שלבניית ספרייה ב ס cerevisiae המתואר כאן יכול בקלות להיות מיושם להתפתח גני האיקריוטים רבים אחרים, הימנעות PCR תגובות נוספות, ב- DNA במבחנת צעדי רקומבינציה קשירה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אבולוציה מולקולרית בימוי היא שיטה חזקה, מהירה ואמינה לעצב אנזימים 1, 2. דרך סיבובים איטרטיבי של מוטציות אקראיות, רקומבינציה הקרנה, הגירסות משופרות של אנזימים יכולות להיוצר שפועלים על מצעים חדשים, בתגובות רומן, ב שאינו טבעי סביבות, או אפילו כדי לסייע התא כדי להשיג את המטרות מטבוליות חדשות 3-5. בין המארחים המשמשים אבולוציה מכוונת, את cerevisiae Saccharomyces שמרי בירה מציע רפרטואר של פתרונות עבור הביטוי הפונקציונלי של חלבונים איקריוטיים מורכבים שאינם זמינים אחרת עמיתיהם פרוקריוטים 6,7.

משומשים ממצה מחקרים בביולוגיה של התא, מודל אוקריוטים הקטן הזה יש יתרונות רבים מבחינת שלאחר translational שינויים, קלות ויעילות מניפולציה וטרנספורמציה, שכולן הן התכונות החשובות להנדס אנזימים על ידי אבולוציה מכוונת 8. יתר על כן, תדירות גבוההשל רקומבינציה DNA ההומולוגית ס cerevisiae מצמיד את מנגנון הוכחת הקריאה היעיל בה פותח מגוון רחב של אפשרויות ליצירת ספרייה והרכבת גני in vivo, טיפוח האבולוציה של מערכות שונות אנזימים יחידים מסלולים מלאכותיים מורכבים 9-12. המעבדה שלנו בילתה את העשור האחרון בעיצוב כלים ואסטראטגי עבור האבולוציה המולקולרית של ligninases השונה בשמרים (oxidoreductases מעורב השפלה של ליגנין במהלך דעיכת עץ טבעית) 13-14. בתקשורת זו, אנו מציגים פרוטוקול מפורט להכין וספריות מוטצית מסך ס cerevisiae עבור מודל flavooxidase, מונואמין -aryl-אלכוהול (AAO 15) -, כי יכול להיות מתורגם בקלות אנזימים רבים אחרים. הפרוטוקול כרוך שיטת אבולוציה ממוקדת מכוון (Morphing: תהליך רקומבינציה מוטגנים מאורגן על ידי הומולוגי in vivo קיבוץ) נעזרה במנגנון שמרים תא 16, גידולassay ההקרנה מאוד רגיש דה המבוססת על התגובה פנטון על מנת לזהות פעילות AAO מופרש לתוך המרק תרבות 17.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. בניית ספריית Mutant

  1. בחרו את האזורים להיות חשופים Morphing בעזרת אלגוריתמים חישוביים המבוססים על מודלי הומולוגית מבנה או קריסטל הזמין 18.
    1. כאן, למקד שני אזורים של AAO מ Pleurotus eryngii עבור mutagenesis ו רקומבינציה אקראית (Met [α1] -Val109, Phe392-Gln566), תוך הגברה והשאר של הגן (844 נ"ב) על ידי באיכות גבוהה PCR (איור 1).
      הערה: מקטעים אחדים ניתן ללמוד על ידי Morphing באופן עצמאי או בשילוב 16.
  2. הגבר את האזורים שהותקפו על ידי מוטגנים PCR. צור חפיפה בין אזורים ובין מגזרים (~ 50 נ"ב כל אחד) על ידי superimposing PCR תגובות של האזורים המוגדרים.
    1. כן PCR מוטגנים של מגזרים ממוקדים נפח סופי של 50 μl המכילים תבנית ה- DNA (0.92 ng / μl), 90 תחושת אוליגו ננומטר (RMLN עבור המגזר אמ"ן AAO-BP עבור המגזר M-II), 90 ננומטרפריימר ntisense (AAO-92C עבור מגזר אמ"ן RMLC עבור מגזר M-II), 0.3 מ"מ dNTPs (0.075 מ"מ כל אחד), 3% (v / v) dimethylsulfoxide (DMSO), 1.5 מ"מ 2 MgCl, 0.05 מ"מ MnCl 2 ו 0.05 U / μl פולימראז תקי DNA. רצפי Primers מפורטים באיור 1.
    2. השתמש תוכנית ה- PCR הבאה: 95 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות (1 מחזור); 95 מעלות צלזיוס למשך 45 שניות, 50 מעלות צלזיוס למשך 45 שניות, 74 מעלות צלזיוס למשך 45 שניות (28 מחזורים); ו -74 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות (1 מחזור).
  3. הגבר את האזורים שאינם מוטגנים עם פולימראז נאמנות הגבוהה במיוחד וכולל אזורים המקבילים חופפי המגזרים מוטגנים / או סככות וקטור הוא לינארית.
    1. הכן תערובת התגובה בנפח סופי של 50 μl המכיל: תבנית ה- DNA (0.2 ng / μl), 250 ננומטר תחושה אוליגו HFF, 250 HFR antisense אוליגו ננומטר, 0.8 מ"מ dNTPs (0.2 מ"מ כל אחד), 3% (v / v) dimethylsulfoxide (DMSO) ו 0.02 U / μl iproof DNA פולימרז. רצפי Primers מפורטים איור 1.
    2. השתמש תוכנית ה- PCR הבאה: 98 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות (1 מחזור); 98 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות, 55 מעלות צלזיוס למשך 25 שניות, 72 מעלות צלזיוס למשך 45 שניות (28 מחזורים); ו -72 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות (1 מחזור).
      הערה: עם התנאים המתוארים 1.2 ו -1.3 חפיפות של 43 נ"ב (אזור פלסמיד-M1); 46 נ"ב (אזור לאזור HF M1); 47 נ"ב (אזור-M2 HF באזור) ו -61 נ"ב (פלסמיד אזור- M2) נועדו (איור 1) להעדיף ב שחבור vivo בשמרים.
    3. לטהר את כל שברי PCR (מוטגנים הלא מוטגנים) עם ערכת חילוץ ג'ל מסחרית על פי הפרוטוקול של היצרן.
  4. Linearize וקטור כך איגוף אזורים של כ -50 נ"ב נוצרים כי הם הומולוגיים אל 5'- ו 3'-הקצוות של גן המטרה.
    1. הכינו תערובת התגובה לינאריזציה המכיל 2 מיקרוגרם DNA, 7.5 U בם HI, 7.5 U Xho לי, 20 מיקרוגרם BSA ו -2 μl של הצפת Baמ HI 10x בנפח סופי של 20 μl.
    2. דגירת תערובת התגובה על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות ו -40 דקות. לאחר מכן, להמשיך עם איון על 80 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
  5. לטהר את הווקטור לינארית על ידי מיצוי ג'ל agarose כדי למנוע זיהום עם הפלסמיד העגול שיורית (איור 2).
    1. טען את תערובת התגובה העיכול אל-היטב מגה של ג'ל agarose נקודת התכה נמוכה חצי preparative (0.75%, w: נ) וכן aliquot (5 μl) של תערובת התגובה ב הסמוך גם ככתב.
    2. הפעלה אלקטרופורזה DNA (5 V / ס"מ בין האלקטרודות, 4 ᵒC) ולהפריד את הג'ל agarose המתאים היטב מגה ולאחסן אותו ב 4 ᵒC ב 1x טה.
    3. כתם השביל עם סולם המשקל המולקולרי ואת הכתב. דמיינו את הלהקות תחת אור UV. ניק במצב שבו מקומות הווקטור לינארית.
      הערה: ככל איכות הווקטור לינארית המטוהר היא critiגורם cal עבור רקומבינציה והרכבה מוצלחת בשמרים, להימנע מכתים ג'ל אלקטרופורזה DNA חצי preparative. השימוש של צבעים וחשיפת UV להפקת ג'ל עשוי להשפיע על היציבות של וקטור DNA, להתפשר על יעילות רקומבינציה vivo. כפי אלטרנטיבת צבעי EtBr רעילים, ג'ל אדום וצבעי SYBR משמשים עבור מכתים ג'ל.
    4. בהיעדר אור UV, לזהות את הווקטור לינארית ב שהבר מגה-גם באמצעות הדרכתו של ניקס בנתיב הכתב המוכתם כך שהוא יכול להיות מבודד.
    5. חלץ את הווקטור לינארית מ agarose ולטהר אותו עם ערכת חילוץ ג'ל מסחרית על פי הפרוטוקול של היצרן.
      הערה: וקטורים הסעות episomal גבוהה עותק השתמש בטושים אנטיביוטיקה auxotrophy: בדוגמה זו שיישמנו אורציל עצמאית אמפיצילין התנגדות וקטור pJRoC30, תחת שליטה של האמרגן שמרים GAL1.
  6. הכן מיל equimolarxture של שברי PCR ומערבב אותו עם הווקטור לינארית ב יחס של 2: 1, עם לא פחות מ -100 ננוגרם של פלסמיד לינארית (יחסים שונים במבחן וקטור equimolar ספרייה / פתוח להשיג תשואות טרנספורמציה טובות).
    1. מדוד את הספיגה של שברי PCR ו הווקטור לינארית ב 260 ננומטר ו -280 ננומטר כדי לקבוע הריכוז והטוהר שלהם.
  7. Transform בתאי שמרים מוסמך בתערובת DNA באמצעות ערכת טרנספורמציה שמרים מסחרית (ראה טבלה עבור אספקה) על פי הוראות היצרן.
    1. הנה, להשתמש פרוטאז לקוי URA3 - תלוי ס זן cerevisiae, BJ5465. להפוך את התאים עם וקטור circularized הורית כסטנדרט פנימי במהלך ההקרנה (ראה להלן). בנוסף, לבדוק את הרקע על ידי הפיכת הווקטור לינארית בהעדר שבר PCR.
      הערה: במקרה של התגלה רמות הפרשה נמוכות ראשוניות, השתמש סcerevisiae פרוטאז זנים לקוי כמו BJ5465 לטפח הצטברות של חלבון פעיל supernatants תרבות. אם אנזים היעד עובר hyperglycosylation, שימוש זני glycosylation מחסר (למשל, Δ kre2 כי הוא מסוגל רק הצמדת oligomers מנוז הקטן) יכול להיות אופציה מתאימה.
  8. פלייט תאי טרנספורמציה על צלחות נשירת SC הדגירה אותם ב 30 מעלות צלזיוס למשך שלושה ימים. פלייט (על צלחות הנשירה SC בתוספת אורציל) URA3 - ס תאי cerevisiae חסרי פלסמיד כביקורת שלילית להקרנה (ראה להלן).

2. תפוקה גבוהה הקרנת Assay (איור 3)

  1. מלאו מספר מתאים של 96-גם צלחות סטרילי (23 צלחות לנתח ספרייה של 2,000 שיבוטים) עם 50 μl בינוניים מינימאלי לכל טוב בעזרת רובוט pipetting.
  2. פיק מושבות בודדות מתוך SC-נושרים צלחות ולהעבירם צלחות 96-היטב.
    1. בכל צלחת, לחסן מספר העמודה 6 עם סוג הורית כסטנדרט פנימי היטב H1 עם URA3 - ס תאים cerevisiae (במדיום SC בתוספת אורציל) ללא פלסמיד כביקורת שלילית.
      הערה: ובכן H1 מלא במיוחד עם התקשורת הנשירה בתוספת אורציל. מדיה ריק היטב המכיל ללא תאים ניתן להכין גם כפקד עקרות נוספים.
  3. מכסים את הצלחות עם העפעפיים שלהם ועוטפים אותם Parafilm. דגירת צלחות עבור 48 שעות ב 30 מעלות צלזיוס, 225 סל"ד ולחות יחסית 80% שייקרו ולח.
  4. הסר את Parafilm, להוסיף 160 μl של מדיום ביטוי היטב כל בעזרת רובוט pipetting, לאטום את צלחות דגירה אותם במשך שעות 24 נוספות.
    הערה: בינוני מינימל ובינוני ביטוי ערוך כפי שדווחו במקומות אחרים 19. רמות ההפרשה עשויות להשתנות תלויים הגן נחקר ובהתאם, tהוא הדגירה פעמים חייבות להיות מותאמות בכל מקרה לסנכרן את צמיחת תאים בכל הבארות.
  5. צנטריפוגה צלחות (צלחות אב) ב 2,800 x ז במשך 10 דקות ב 4 ° C.
  6. העברת 20 μl של supernatant מבארות בצלחת המאסטר לצלחת העתק באמצעות נוזל טיפול multistation רובוטית.
    הערה: כדי להעדיף הפרשת אנזים רצוי להחליף את הפפטיד אות יליד חלבון המטרה על ידי פפטידים אות נפוצים ביטוי Heterologous בשמרים (למשל, גורם α prepro-המנהיג, המנהיג של הרעלן Killer 1 K מ ס cerevisiae, או גרסאות כימרי אפילו של שני פפטידים 13). לחלופין, הפפטיד אות היליד ניתן התפתח באופן בלעדי עבור הפרשה בשמרים.
  7. הוסף 20 μl של 2 מ"מ p -methoxybenzylalcohol ב- pH חיץ פוספט נתרן 100 מ"מ 6.0 בעזרת הרובוט pipetting. מערבבים את צלחות בקצרה עם 96-אנחנוll מערבל צלחת דגירה אותם במשך 30 דקות ב RT.
  8. עם רובוט pipetting, להוסיף 160 μl של מגיב FOX על כל צלחת העתק ומערבבים בקצרה עם מערבל (הריכוז הסופי של תערובת FOX בבאר: 100 מיקרומטר xylenol כתום, 250 מיקרומטר Fe (NH 4) 2 (SO 4) 2 ו 25 מ"מ H 2 SO 4).
    1. הוסף מספר ותוספות מגיבים כדי לשפר את הרגישות, כגון ממסי שיתוף אורגניים (DMSO, אתנול, מתנול) או סורביטול 17. הנה, להגביר את התגובה על ידי הוספת סורביטול לריכוז סופי של 100 מ"מ (איור 4).
  9. קראו את הצלחות (מצב נקודת סיום, t0) ב 560 ננומטר על קורא צלחת.
  10. דגירת הצלחות ב RT עד שצבע מפתחת מדידת הבליעה שוב (t 1).
    1. חשבתי את הפעילות היחסית מהפער בין שווי Abs לאחר דגירה וכי המדידה הראשונית מנורמל פאךקסוג פתיחות opening סגירות closures עבור כל צלחת (Δt 1 - t0).
  11. נושא להיטי המוטציה הטובים ביותר לשני מחדש הקרנות רצופות כדי לשלול תוצאות חיוביות שגויות.
    הערה: בדרך כלל, מחדש הקרנות כוללות בידוד פלסמיד מן השמרים, הגברה וטיהור Escherichia coli, ואחריו טרנספורמציה של תאי שמרים טריים עם הפלסמיד 19. כל כפיל שנבחר מחדש הוקרן pentaplicate.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

AAO מ פ eryngii הוא flavooxidase תאי המספק peroxidases פטרייתי עם H 2 O 2 כדי להתחיל לתקוף ליגנין. שני קטעים של AAO היו נתוני אבולוציה ממוקדת בבימויו של Morphing כדי לשפר את פעילותה וביטויו ס cerevisiae 19. בלא קשר עם אנזימים חוץ שטיפחו ס cerevisiae, הנושא הקריטי ביותר בעת בניית ספריות מוטציה בשמרים נוגעת ההנדסה של אזורים חופפים ספציפיים להעדיף את השחבור בין שברי השיבוט שלהם לתוך הווקטור ל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במאמר זה, יש לנו סכמתי רוב הטיפים והטריקים המועסקים במעבדה שלנו להנדס אנזימים על ידי אבולוציה מכוונת ס cerevisiae (באמצעות AAO כדוגמא), כך שהם יכולים להיות מותאמים לשימוש עם מערכות אנזימים האיקריוטים רבות אחרות על ידי ביצוע הגישה הנפוצה פשוט המתואר כאן.

במונחים של יצירת ספרייה, Morphing היא שיטה בסיר אחד מהר כדי להציג ולשלב מחדש מוטציות אקראיות בתוך רצועות חלבון קטנות תוך השארת האזורים הנותרים של החלבון ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

החוקרים אין לי מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי פרויקט Indox-FP7-KBBE-2013-7-613549 של הנציבות האירופית; ביוקטליזה של Cost-Action CM1303-Systems; והפרויקטים הלאומיים Dewry [BIO201343407-R] ו-Cambios [RTC-2014-1777-3].

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>1. אמצעי תרבית
אמפיצילין מלח נתרןסיגמא-אולדריץ'A0166CAS Nº 69-52-3 M.W. 371.39
Bacto AgarDifco214010
CloramphenicolSigma-AldrichC0378CAS Nº 56-75-7 M.W. 323.13
D-(+)-GalactoseSigma-AldrichG0750CAS Nº 59-23-4 M.W. 180.16
D-(+)-גלוקוזסיגמא-אולדריץ'G5767CAS Nº 50-99-7 M.W. 180.16
D-(+)-Raffinose pentahydrateSigma-Aldrich83400CAS Nº 17629-30-0 M.W. 594.51
פפטוןדיפקו211677
אשלגן פוספט מונו-בסיסיSigma-AldrichP0662CAS Nº 7778-77-0 M.W. 136.09
UracilSigma AldrichU1128
תמצית שמריםDifco212750
בסיס חנקן שמרים ללא חומצות אמינוDifco291940
שמרים סינתטיים נשירה בינונית תוספי תזונה ללא uracilSigma-AldrichY1501
שםחברהמספר קטלוגיComments
2. PCR Reactions
dNTP MixAgilent genomics200415-5125 mM כל אחד
iProof High-Fidelity DNA פולימראזBio-rad172-5301
מנגן (II) כלוריד טטרהידראטSigma-AldrichM8054CAS Nº 13446-34-9 M.W. 197.91
Taq DNA פולימראזסיגמא-אולדריץ'D4545לשגיאה נוטה PCR
<חזק>שם<חזק>חברה<חזק>מספר קטלוגי<חזק>הערות
<חזק>3. ליניאריזציה של פלסמיד
BamHI אנזים הגבלתניו אינגלנד BiolabsR0136S
סרום בקר אלבומיןניו אינגלנד BiolabsB9001S
אנזים הגבלת XhoIניו אינגלנד BiolabsR0146S
לא I אנזים הגבלהניו אינגלנד BiolabsR0189S
ג'ל אדוםביוטיום41003לצביעה של DNA
NameCompanyCatalog NumberComments
4. בדיקות FOX
אמוניום ברזל (II) סולפט הקסהידראטסיגמא-אולדריץ'F3754CAS Nº 7783-85-9 M.W. 392.14
Anysil אלכוהולסיגמא אולדריץ'W209902CAS Nº 105-13-5 M.W. 138.16
D-סורביטולסיגמא-אולדריץ'S1876CAS Nº 50-70-4 M.W. 182.17
מי חמצן 30%Merck Millipore1072090250FOX עקומה סטנדרטית
קסילנול כתום מלח דיסודיוםסיגמא-אולדריץ'52097CAS Nº 1611-35-4 M.W. 716.62
שםחברהCatalog NumberComments
5. חומר ג'ל אגרוז
AgaroseNorgen28035CAS Nº 9012-36-6
ג'לאדום ביוטיום41003צבע ניתוח DNA
GeneRuler 1kb סולםThermo ScientificSM0311DNA M.W.
צבע טעינה סטנדרטי 6xThermo ScientificR0611
טמפרטורת התכה נמוכה אגרוזBio-rad161-3112CAS Nº 39346-81-1
NameCompanyCatalog NumberComments
6. ערכות ותאים
S. cerevisiae זן BJ5465LGC PromochemATTC 208289זן חסר פרוטאז עם גנוטיפ: MATα ura3-52 trp1 leu2-delta1 his3-delta200 pep4::HIS3 prb1-delta1.6R can1 GAL
E. coli XL2-Blue תאים מוכשריםAgilent גנומיקה200150לטיהור והגברה של פלסמיד
NucleoSpin ג'ל וערכתניקוי PCRMacherey-Nagel740,609,250מיצוי ג'ל DNA
ערכת פלסמיד NucleoSpinMacherey-Nagel740,588,250ערכת מיני-הכנה לעמודות
ערכת טרנספורמציה של שמריםSigma-AldrichYEAST1-1KTכלול נשא DNA (אשכי סלמון)
Zymoprep שמרים פלסמיד miniprep Iמחקר ZymoD2001מיצוי פלסמיד משמרים
<חזקים>שםCompanyCatalog NumberComments
7. צלחות
צלחות 96 בארותגריינר ביו-וואן655101פוליסטירן שקוף, לא סטרילי, (למדידות פעילות)
צלחות 96 בארותגריינר ביו-וואן655161שקוף, סטרילי, פוליסטירן (למיקרו-תסיסות)
מכסה צלחת 96 בארותגריינר ביו-וואן656171שקוף, סטרילי, פוליסטירן (למיקרו-תסיסות)

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jäckel, C., Hilvert, D. Biocatalysts by evolution. Curr. Opin. Biotechnol. 21 (6), 753-759 (2010).
  2. Bornscheuer, U. T. Engineering the third wave of biocatalysis. Nature. 485 (7397), 185-194 (2012).
  3. Renata, H., Wang, Z. W., Arnold, F. H. Expanding the enzyme universe: accessing non-natural reactions by mechanism-guided directed evolution. Angew. Chem. Int. Ed. 54 (11), 3351-3367 (2015).
  4. Cobb, R. E., Chao, R., Zhao, H. Directed evolution: past, present and future. AIChE J. 59 (5), 1432-1440 (2013).
  5. Abatemarco, J., Hill, A., Alper, H. S. Expanding the metabolic engineering toolbox with directed evolution. Biotechnol. J. 8 (12), 1397-1410 (2013).
  6. Pourmir, A., Johannes, T. W. Directed evolution: selection of the host organism. Comput Struct Biotechnol J. 2 (3), e201209012(2012).
  7. Krivoruchko, A., Siewers, V., Nielsen, J. Opportunities for yeast metabolic engineering: lessons from synthetic biology. Biotechnol J. 6 (3), 262-276 (2011).
  8. Gonzalez-Perez, D., Garcia-Ruiz, E., Alcalde, M. Saccharomyces cerevisiae in directed evolution: an efficient tool to improve enzymes. Bioeng Bugs. 3, 172-177 (2012).
  9. Alcalde, M. Mutagenesis protocols in Saccharomyces cerevisiae by In Vivo Overlap Extension. Methods Mol. Biol. 634, 3-14 (2010).
  10. Bulter, T., Alcalde, M. Preparing libraries in Saccharomyces cerevisiae. Methods. Mol. Biol. 231, 17-22 (2003).
  11. Ostrov, N., Wingler, L. M., Cornish, W. Gene assembly and combinatorial libraries in S. cerevisiae via reiterative recombination. Methods. Mol. Biol. 978, 187-203 (2013).
  12. Shao, Z., Zhao, H., Zhao, H. DNA assembler, an in vivo genetic method for rapid construction of biochemical pathways. Nucleic Acids Res. 37 (2), e16(2009).
  13. Alcalde, M. Engineering the ligninolytic enzyme consortium. Trends Biotechnol. 33 (3), 155-162 (2015).
  14. Garcia-Ruiz, E. Directed evolution of ligninolytic oxidoreductases: from functional expression to stabilization and beyond. Cascade Biocatalysis: integrating stereoselective and environmentally friendly reactions. , Wiley-VCH. 1-22 (2014).
  15. Hernandez-Ortega, A., Ferreira, P., Martinez, A. T. Fungal aryl-alcohol oxidase: a peroxide-producing flavoenzyme involved in lignin degradation. Appl. Microbiol. Biotechnol. 93 (4), 1395-1410 (2012).
  16. Gonzalez-Perez, D., Molina-Espeja, P., Garcia-Ruiz, E., Alcalde, M. Mutagenic organized recombination process by homologous in vivo grouping (MORPHING) for directed enzyme evolution. PLoS One. 9, e90919(2014).
  17. Rhee, S. G., Chang, T., Jeong, W., Kang, D. Methods for Detection and Measurement of Hydrogen Peroxide Inside and Outside of Cells. Mol. Cells. 29 (6), 539-549 (2010).
  18. Sebestova, E., Bendl, J., Brezovsky, J., Damborsky, J. Computational tools for designing smart libraries. Methods. Mol. Biol. 1179, 291-314 (2014).
  19. Viña-Gonzalez, J., Gonzalez-Perez, D., Ferreira, P., Martinez, A. T., Alcalde, M. Focused directed evolution of aryl-alcohol oxidase in yeast using chimeric signal peptides. Appl. Environ. Microbiol. , (2015).
  20. Gay, C., Collins, J., Gebicki, J. M. Hydroperoxide Assay with the Ferric-Xylenol orange Complex. Anal. Biochem. 273 (2), 149-155 (1999).
  21. Reetz, M. T. Biocatalysis in organic chemistry and biotechnology: Past, present, and future. J. Am. Chem. Soc. 135 (34), 12480-12496 (2013).
  22. Mate, D. M., Gonzalez-Perez, D., Mateljak, I., Gomez de Santos, P., Vicente, A. I., Alcalde, M. The pocket manual of directed evolution: Tips and tricks. Biotechnology of Microbial Enzymes: Production, Biocatalysis and Industrial Applications. , Elsevier. Forthcoming Forthcoming.
  23. Chao, R., Yuan, Y., Zhao, H. Recent advances in DNA assembly technologies. FEMS Yeast Res. 15, 1-9 (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

DNA in vivo

מאמרים קשורים