הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

שיטות לגלות אלטרנטיבי שימוש יזם ותקנת תעתיק של Murine Bcrp1

7.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/53827

⸱

27 במאי 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Greenebaum Cancer Center, University of Maryland School of Medicine, 2Pharmaceutical Sciences, University of Maryland School of Pharmacy, 3Baltimore VA Medical Center, 4Membrane Transport and Biopharmaceutics, School of Pharmaceutical Sciences, Kanazawa University, 5Obstetrics, Gynecology and Reproductive Science, University of Pittsburgh, 6Magee Women's Research Institute, 7Obstetrics, Gynecology, Perinatal Research Branch (NICHD), Wayne State University School of Medicine, 8Medicine, University of Maryland School of Medicine, 9Pathology, University of Maryland School of Medicine, 10Pharmacology, University of Maryland School of Medicine, 11Experimental Therapeutics, University of Maryland School of Medicine

במאמר זה

סיכום

עם טרנספורטר murine ABC Bcrp1 (Abcg2) כדוגמא, ב-סיליקון פרוטוקולים מוצגים מזהים שימוש אמרגן חלופי גנים מתבטאים רקמות עכבר, כדי להעריך את התפקוד של היזמים החלופיים שזוהו באמצעות מבחני כתב.

תקציר

התבטאות גנים ברקמות שונות נשלטת לעתים קרובות על ידי יזמים חלופיים, לגרום תיצור mRNA עם ייחודי - אקסונים ראשון - בדרך כלל לא מתורגם. Bcrp1 (Abcg2), את orthologue בעכברים של חלבון סרטן התנגדות טרנספורטר שד ABC (BCRP, ABCG2), יש לפחות ארבעה מקדמים חלופיים, מיועדים על ידי אקסונים הראשון ארבעה החלופי המתאים פיק: E1U, e1a, E1B, ו E1C. בזאת, ב-סיליקון פרוטוקולים מוצגים לחזות שימוש אמרגן חלופי Bcrp1. יתר על כן, שיטות assay הכתב מתוארים לייצר מבני כתב יזמים חלופיים ולקבוע את הפונקציונליות של יזמים משוערים במעלה זרם של אקסונים הראשון החלופי מזוהים.

מבוא

יותר ממחצית גנים אנושיים מוסדרת יזמים חלופיים 1. אמרגן כל חלופה יכול להכיל אלמנטים רגולטוריים שעשויה להיות שונים מאלה הנהוגים יזמי אלטרנטיבה אחרים. האמרגן (הים) מנוצל ברקמה אחת עשוי להיות שונה מאלה המשמשים רקמה אחרת. לדוגמא, ייתכן כי הפעלת מסלול איתות נתונה עלולה לעורר את האמרגן החלופי גן מנוצל ברקמה אחת, עדיין אין כל השפעה על או להדחיק אמרגן חלופה נפרד אותו הגן כי הוא מנוצל ברקמה אחרת.

ביטוי של גן Bcrp1 נשלט על ידי יזמים חלופיים. Bcrp1 הוא orthologue בעכברים של חלבון סרטן שד התנגדות האנושי הגן (BCRP). BCRP הוא קלטת מחייב ATP (ABC) טרנספורטר, המיועד באופן רשמי ABCG2 2, 3. בתור חלבון הממברנה פסגה, BCRP / פונקציות Bcrp1 כדי בזרימת מגוון רחב של מצעים טבעיים xenobiotic 3, 4. אצל בני אדם ועכברים, BCRP / Bcrp1 מבוטא בכמות גבוהה באיברים רלוונטיים פרמקולוגית כגון כבד (אפיקים, נקבות מרות), מעי, כליות, כמו גם איברים עם מחיצות דם ברקמות כגון שליה, מוח testis 2, 5 - 12. הביטוי של BCRP / Bcrp1 ב hematopoietic בתאי גזע אחרים, כולל תאי גזע סרטניים, עשוי להקנות עמידות של תאים אלה xenobiotics ותרופות כימותרפיות סרטן 3.

בעבודה מוקדם להבין את בקרת ביטוי BCRP בתאים נורמלים ממאירים, 5 'הגברה מהירה של קצות cDNA (5'-RACE) ניתוח של mRNA BCRP בוצעה על מנת לקבוע אתר תחילת התעתיק המדויק שלה 13. לא רק היו אתרי תעתיק התחלה מרובים מצאו; גם נתקלו היו שלוש צורות חלופיות של אקסון הראשון, אשר BCRP הוא לא מתורגם. אקסונים הראשונים החלופיים אלה - המיועדים e1a, E1b, E1c - באו לידי ביטוי באופן שונה במגוון רקמות אנושיות. שתי גרסות אקסון ראשונות נוספות התגלו חיפוש יפציץ של מסד נתוני EST אדם באמצעות אקסון השני של BCRP 13. ארבעה גפרורים חשפו אקסון ראשון> 70 kb במעלה זרם אקסון 2 אשר יועדו E1u; ארבעה משחקים אחרים גילה BCRP mRNA כי חסרים אקסון ראשון כולו, אשר יועדו E1- 13. הנוכחות של אקסונים מנהיג חלופיים נחשבת ביטוי של שימוש אמרגן חלופי 14.

בעכברים, ארבעה אקסונים ראשונים חלופיים Bcrp1 מתוארים שעשויות מתאימות יזמים חלופיים השולטים שעתוק 1 BCRP ברקמות עכבר שונים; אלה אקסונים / היזמים מיועדים E1U, e1a, E1B ו E1C, והם ממוקמים כ 70, 58, 15, ו -5 קילו במעלה הזרם אקסון Bcrp1 2 5, 15. איזופורם mRNA e1a נמצא שולט Murinדואר בתאי גזע hematopoietic, לב, ריאות, טחול, ומוח, ואילו איזופורם E1B התבטא מעי עכבר, תאים בכבד עובר, ותאי מבשר erythroid ב מח עצם 5, 15. האמרגן במעלה זרם E1B הוצג להיות האמרגן החלופי החשוב מסדירי שעתוק Bcrp1 במעי עכבר, מוסדר לפחות בחלקה, על ידי חלבון מחייב אלמנט בתגובת phospho-מחזורי-AMP (p-CREB) ואלמנט בתגובת CREB ייחודי חלופי אמרגן Bcrp1 16. איזופורם mRNA E1C מתבטאת בעיקר בכבד בעכברים בוגרים כליה 5. איזופורם E1U ניתן לגילוי ברוב הרקמות שנבדקו למעט testis בעכברים, שבו הוא איזופורם השולט הביע 5. Bcrp1 לידי ביטוי האשכים חולדה נמצא בשני סומטי (צמתים הדוקים אנדותל, תאי myoid peritubular, ותאי Sertoli) ותאי נבט (ב האנדותל seminiferous, שבו הוא עשוי להגן spermatids בשלב מאוחר 4). רגיון במעלה זרם E1U מכיל מרכיב בתגובה פונקציונלי-1 גורם steroidogenic (SF-1) 5. Bcrp1 mRNA וחלבונים מופחתים באופן ניכר באשכים של עכברים בנוקאאוט SF-1 תא ספציפי Sertoli, דבר המצביע על כך הביטוי Bcrp1 בתאים Sertoli murine נשלטת על ידי SF-1 5.

הפרוטוקולים שהוצגו שיטות פרט לזהות אקסונים ראשונים חלופיים Bcrp1 ב-סיליקון, ולבסס מבחני כתב מבוסס בלוציפראז עבור יזמים משוערים במעלה זרם מן אקסונים הראשונים האלטרנטיבה המזוהית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. חיזוי Silico של ראשית אלטרנטיבי אקסונים של Bcrp1 באמצעות ניתוח תפציץ של מסד נתונים עכבר EST

הערה: פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע חיפוש תג רצף העכבר הביע (EST) מסד ליערות עם דמיון רצף אקסון 2 של Bcrp1 (המכיל באתר ההתחלה translational) ולאחר מכן כיצד ליישר את רצפי EST התאמת רצפים גנומיים כדי לוודא שלהם המיקום היחסי הגן העכברי Bcrp1 עד הסוף '5 של Bcrp1 אקסון 2.

  1. השג את רצף עבור אקסון העכבר Bcrp1 2 על ידי הזנת מזהה רצף ההתייחסות mRNA (NM_011920.3) לתוך חלון החיפוש של דפדפן הגנום Ensembl 17, לחץ על "GO". במסך הבא, בחר רצף באורך מלא (מכיל 16 אקסונים):
    1. במסך הבא ( "התצוגה מבוססת תמליל"), בחר "16 אקסונים." זה יציג את מסך המכיל את הרצף של כל אקסונים של Bcrp1. אקסון 2 של Bcrp1 ייקרא "59; -AAAGGC ... TATCAA-3 ' "התוצאות שהושגו יהיה דומה לאלו המוצגים התייחסות 18..
    2. לחץ על אפשרות "רצף הורדה". במסך הבא, בחר את תבנית FASTA, ולאחר מכן לחץ על "תצוגה מקדימה". במסך הבא, להעתיק את רצף תצוגה מקדימה של אקסון 2 אל הלוח.
  2. נווט אל דף הבית תפציץ 19 על המרכז הלאומי למידע ביוטכנולוגיה (צמח השדה) אתר 20.
    1. בחר הגנום "עכבר". הדבק את רצף אקסון 2 מהלוח לתוך תיבת השאילתה.
    2. "ליערות" לבחור מתוך התפריט הנפתח מסד נתונים, אופטימיזציה "רצפים דומים מאוד," ולאחר מכן לבחור "הפיצוץ." זמן לרוץ ייקח כמה דקות. כאשר לרוץ תפציצו יושלם, בעמוד "התוצאות" יופיע.
    3. תחת כותרת משנה "תיאורים" עמוד "תוצאות", בחר "ALL," ואז "הורדה" ולאחר מכן "FASTA (מלאהרצף) "בתפריט הנפתח, ולאחר מכן בחר" המשך "קובץ .txt יופיע;. פתוח להעתיק את הקובץ כולו אל לוח קובץ .txt מכיל רצפים של כל ליערות עם דמיון רצף גבוה עם העכבר Bcrp1 exon2. אבל לא עמדו ביחס שלהם אקסון 2 בגן Bcrp1.
      הערה: מניתוח ביצע ב -15 באפריל 2015 זיהו 14 ליערות בעכברים כי מיושר עם אקסון Bcrp1 2. אלו מפורטים בטבלה 1.
  3. זהה את המיקום של הרצף EST כי הוא 5 'כדי אקסון 2 בגן Bcrp1. הגן העכברי Bcrp1 ממוקם NC_000072.6 contig כרומוזום 6 (GI: 372,099,104).
    1. בדף הבית של תפציץ תחת כותרת המשנה "הפיצוץ Specialized", בחר "יישר שני (או יותר) רצפים באמצעות תפציץ (bl2seq)."
    2. הדבק את קובץ הטקסט מהלוח אל תוך תיבת שאילתה ולהזין 372099104 בתיבת רצף הנושא. מטב עבור "רצפים דומים מאוד" במסגרת תוכניתבחירה, ואת הפיצוץ לרוץ.
    3. לאחר חלון התוצאות יופיע, להציג המערכים בצורה גרפית על ידי לחיצה על "גרפיקה" בחלון "היישור". השתמש בחצים ימינה ושמאלה וזום להתמקד Bcrp1 / Abcg2 ואת יישור רצף.
    4. שמור את יישור הרצף: לבחור "הכל" בתיבת "תיאורים", אז תחת התפריט הנפתח "הורדה" לבחור "הכה שולחן (CSV)," ולאחר מכן לחץ על "המשך". קובץ זה מכיל את יישור רצף של Bcrp1 אקסון 2 ואת היישור של כל רצפי EST עם הדמיון רצף Bcrp1 Exon2 ביחס המספור של נוקלאוטידים ב contig העכבר כרומוזום 6. כל רצף EST מלא עלול ליצור מערכים מרובים פורשים אזורים 5 'ו 3' כדי אקסון 2 כולל הרצפים חופפים עם Bcrp1 אקסון 2.
    5. כמו המיקום של סוף '5 של אקסון 2 יתאים נוקלאוטיד 58,655,638 ב contig כרומוזום 6, לייעד זה+1, ולאחר מכן לחשב את המיקום של הרצפים החלקיים של כל EST 5 'ל 58,655,638. תוצאות עבור 14 ליערות ניתנות בטבלה 1.
      הערה: היזהר לנתח רצפי EST כי הם 5 'ל +1 (כלומר, יש ערך נוקלאוטיד שלילי) כפי אקסונים הפוטנציאלי הראשון. לדוגמה, בשניים ליערות כי מיושר עם Bcrp1 אקסון 2 שמוצג בטבלה 1 (AI647825 ו AI664571) רצף שנותר היה 3 'כדי אקסון 2.

2. הערכת Bcrp1 פונקצית יזם אלטרנטיבי

  1. עיצוב של כתב בונה עבור Bcrp1 E1U, e1a, E1B ומקדם E1C
    1. באמצעות רצף של E1U המתקבל בחיפוש במאגר EST, לייעד את נוקלאוטיד 5 'הראשון של E1U כמו +1.
    2. השג כרומוזום בקטריאלי מלאכותי (BAC) שיבוט של כרומוזום העכבר 6 שמכיל את רצף הגן Bcrp1 / Abcg2 ואת רצף לפחות 100 kb במעלה הזרם שלBcrp1 / גן Abcg2 (ראה רשימה של חומרים וציוד).
      1. זהה וקטור כתב מתאים כגון pGL3 הבסיסי פלסמיד כתב בלוציפראז.
      2. קבע את אתרי שיבוט מרובים וקטור הכתב. KpnI, SACI, Mlu1, NheI, SmaI, XhoI, BglII ו HindIII הם אתרי endonuclease הגבלת אתר השיבוט המרובה של הווקטור בסיסי pGL3, ב 5 'ל 3' כיוון.
        הערה: הרצף של אתרי העיכול זמין מקטלוגי תוצר של חברות המייצרות את אנזימי ההגבלה.
      3. זיהוי כל האתרים העיכול אקסון E1U והאזור 2 kb 5 'של E1U באמצעות תוכנות כגון DNA5. לזהות לפחות שני אתרי עיכול אתר השיבוט המרובה pGL3-יסוד שאינו נמצאים ב E1U או באזור 2 kb במעלה הזרם.
        הערה: הקפד לבחור אתר הגבלת אתר שיבוט מרובה עבור פריימר קדימה כי הוא זרם של אחד שנבחר פריימר הפוך על מנת להבטיח כי wil הכנסl להיות בכיוון הנכון.
    3. כן קדימה לאחור תחל עבור PCR המכילים רצפים עבור באתרי endonuclease הגבלת אתר שיבוט המרובה pGL3-יסוד שנבחרו באמצעות שירותי סינתזה מסחריים הגן / פריימר או תוכנת בחירת פריימר (ראה רשימה של חומרים וציוד). בחר פריימר קדימה הממוקם ~ 2 kb במעלה הזרם מן הרצף E1U ו פריימר הפוכה בתוך רצף E1U. פריימרים המשמשים המחברים 'העבודה הקודמת שולבו באתר SACI ב פריימר קדימה, ואתר NheI ב פריימר הפוכה, והעצים באזור הגנומי של כ -1.906 כדי +64 עם 5 הראשון' נוקלאוטיד של E1U כמפורט + 1 (ראה שלב 2.1.1 לעיל), וכן ניתנים ביחס 16.
      1. PCR להגביר את האזור הגנומי E1U באמצעות פריימרים אלה, 0.01 כדי 1 מיקרוגרם של BAC, ואת תערובת אמן PCR המכיל polymerases תקי באיכות גבוהה (ראה רשימה של חומרים וציוד) עם denaturing ב95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, ולאחר מכן 35 עד 40 מחזורים של PCR, עם סיומת על 72 מעלות צלזיוס (2 דק '), ואת חישול לטמפרטורת היתוך מבוסס על מאפייני ההיתוך של פריימרים בשימוש.
        הערה: שימוש polymerases תקי באיכות הגבוהה חיוני אזורי אמרגן רצף שיש תוכן GC גבוה. בעת שימוש קטעי דנ"א גנומי גדולים כגון BAC כתבנית, המבנה המשני של הדנ"א הגנומי עשוי להקשות על פריימרים PCR להיקשר. אם בעיה זו מתעוררת, תוצאות PCR טובות ניתן לקבל אם תבנית ה- DNA הגנומי הארוכה היא טיעון בעדינות על ידי sonication לפני תגובת PCR.
      2. בדוק את אורכו של מוצר ה- PCR מוגבר על ידי השוואת נגד סולם DNA 1 kb באמצעות ג'ל אלקטרופורזה agarose 0.8% טה.
    4. לעכל את מוצר ה- PCR שהושג ואת הווקטור בסיסי pGL3, באמצעות ההגבלה endonucleases ספציפית באתרי עיכול ההגבלה המוחדרים קדימה הפוך פריימרים לפי תוספותtructions שמצורף אנזימי עיכול הגבלה.
      1. לטהר את תגובות העיכול באמצעות ג'ל SV המסחרי PCR ניקיון ערכת מערכות (ראה רשימה של חומרים וציוד), בעקבות פרוטוקול הערכה 21.
        1. ודא עיכול לינאריזציה של וקטור על ידי השוואתה נגד וקטור נימול באמצעות ג'ל אלקטרופורזה agarose, ולאחר מכן לחתוך ולטהר את הלהקה DNA וקטור מתעכל. למדוד את הריכוז של מוצר PCR מטוהר הווקטור המטוהר באמצעות ספקטרומטריית UV (ראה רשימה של חומרים וציוד).
    5. הכן את לבנות כתב E1U ידי ligating המטוהר, אנזים הגבלה מתעכל מוצר ה- PCR וקטור כתב בלוציפראז גחלילית pGL3 בסיסי (כלול בערכת assay הכתב; לראות רשימה של חומרים וציוד) בשעה כנס: יחסי וקטור של 11, 21 ו -31, באמצעות "ערכת T4 DNA אנזים הקשירה מהירה" 22, ובכך בהתאם להנחיות ערכת הפקת E1U reporter לבנות, בשם pGL3-E1U.
      1. השתמש פלסמיד pGL3-E1U להפוך חיידקים להרחיב clonally pGL3-E1U ההוראות הבאות בערכת שיבוט ת"א (ראה רשימה של חומרים וציוד).
      2. אשר את האוריינטציה ונאמנות של הכנס על ידי ניתוח רצף.
    6. כתב כן בונה עבור e1a, E1B ו E1C שימוש במתודולוגיה דומה באשר E1U. אשר את הנאמנות של מוסיף על ידי רצף כאמור בסעיף 2.1.5.2.
      הערה: מוסיף היזמית e1a, E1B ו E1C צריך להיות כ -1875 / + 10, -1847 / + 60, ו -1904 / + 83 ביחס 5 נוקלאוטיד 'הראשונה (יועד +1) של e1a, E1B, או E1C, בהתאמה.
  2. שיטות assay Reporter
    הערה: אסטרטגיה כללית של מבחני כתב: האמרגן המשוער (5 'באזור במעלה זרם) של גן מוכנס לתוך אתר השיבוט המרובה של וקטור ריק "עיתונאי" המכיל "reporteגן r "(למשל, גחלילית בלוציפראז) במורד זרם מן אתר השיבוט המרובה. הווקטור הוא transfected מכן לתאים איקריוטיים המבטאים את הגן של עניין. הגורמים הפועלים-trans מקדמי ביטוי של הגן של עניין בתאים אלה צריכים להפעיל את האמרגן של וקטור הכתב טרנספקציה, גרימת ביטוי של בלוציפראז גחלילית, אשר ניתן לכמת בקלות עם assay הארה.
    1. בחר את שורת התאים המתאימה לשימוש עבור assay הכתב.
      הערה: כדי להעריך את פעילותו של לבנות כתב האמרגן אלטרנטיבה E1U, יש צורך transfect כי לבנות לתוך תאים המבטאים Bcrp1 תחת שליטה של ​​האמרגן E1U. השורה תא סרטולי murine TM4 (ראה רשימה של חומרים וציוד) מבטא חלבון Bcrp1 ו Bcrp1 mRNA המכיל E1U, כמו גם e1a, E1B, ו E1C 5. כביקורת שלילית, כדאי לשקול שימוש קו התא אינו מבטא Bcrp1 חלבון או mRNA.
    2. תרבות לספירת TM4LLS ב 24 גם צלחות בצפיפות הראשונית של 200,000 תאים / גם ביחס של 1: תערובת 1 של מדיום F12 של חם ובינוניים של הנשר שונה של Dulbecco עם 1.2 גרם / סודיום ביקרבונט L, 15 מ"מ HEPES בתוספת סרום סוס 5%, 2.5% בסרום שור עוברי, פניצילין (100 IU / ml), ו סטרפטומיצין (100 מיקרוגרם / מיליליטר), על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, כפי שתוארו לעיל 5.
    3. שש שעות לאחר הצבת התאים בתרבית, transfect התאים עם 0.2 מיקרוגרם של וקטור pGL3-בסיסי ריק או עם 0.2 מיקרוגרם של וקטור pGL3 המכיל את -1906 / + 64 E1U או -1875 / + 10 e1a או -1847 / + 60 E1B או -1904 / + 83 E1C BCRP 1 מחיקה לבנות יחד עם 4 ng של PRL-TK (וקטור Renilla להביע בלוציפראז) כפי בקרה פנימית, באמצעות ערכת transfection DNA מסחרית הפרוטוקול של היצרן 23 (ראה רשימה של חומרים וציוד) .
    4. 30 שעות transfection הבא, להסיר את תקשורת הצמיחה מן cultured transfected תאים. שוטפים את התאים פעם עם 200 μl של PBS, ולאחר מכן להסיר את הפתרון לשטוף.
      1. מדוד גחלילית ופעילות בלוציפראז Renilla באמצעות ערכה מסחרית על פי הפרוטוקולים של יצרן 24.
    5. לבטא את הפעילות עבור כל צינור כיחס של פעילות בלוציפראז גחלילית מחולק הבקרה הפנימית (בלוציפראז Renilla); תוצאות הכוללות בדרך כלל מבוטאות הפעילות של כל עיתונאי לבנות ביחס לזו של תאי transfected עם וקטור pGL3 בסיסי הריק, אשר ניתן ערך של 1.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

זיהוי של ניצול אמרגן BCRP 1 חלופי testis עכבר על ידי ניתוח של אקסונים מנהיג

כאשר בבסיס הנתונים EST ב צמח השדה עבר מבחנים (אפריל 2015) באמצעות הפעולות המתוארות בפרוטוקול 1, ליערות נמצא כי היו רציף עם תום '5 של אקסון 2 BCRP 1 mRNA מוצגים

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

רוב השיטות ותוצאות נציג הציגו מתוארים בעבודה קודמת תחת כותרת "שעתוק B crp1 ב testis עכבר נשלט על ידי אמרגן במעלה הזרם של אקסון הראשון רומן (E1U) מווסת על ידי גורם-1 steroidogenic," אשר פורסם בשנת 2013 5 . בנוסף לתוצאות הנציג המתוארות כאן, בעיתון הקודם ספק אומדני ניצול אקסון הראשון חלופי באמצעות מתודולוגיה 5'-RACE PCR ו RT-PCR. יתר על כן, ב-סיליקון זיהוי של אלמנט תגובה משוער SF-1 האמרגן במעלה זרם E1U השלמתו; immunoprecipitation הכרומטין (ש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

דאגלס ד רוס מאוניברסיטת מרילנד, בולטימור להחזיק זכויות הפטנט BCRP האדם.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי פרסי סקירת כשרון דאגלס ד רוס וכדי עריף חוסיין מהמחלקה לענייני יוצאי הצבא.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>חומרים ביולוגיים מסחריים וערכות:
ערכת RLM-RACE הבחירה הראשונהAmbion Inc., אוסטין, טקסס, זמינה כעת דרך Life TechnologiesAM17005'-RACE PCR ערכת
שיבוט TOPO TALife TechnologiesK450001ערכה זו מכילה את חיידקי TOP10 המסוגלים כימית E. coli.
ערכת קשירה מהירה T4 DNA ligaseNew England BiolabsM2200
Faststart בנאמנות גבוהה Taq- DNA פולימראזSigma-Aldrich/Roche3553400001/RMB-4738284001 מכיל תערובת אנזימים Taq פולימראז בנאמנות גבוהה
XtremeGENE HP DNA ריאגנט טרנספקציהRoche6366236001
ערכת בדיקת דיווח כפול לוציפראזPromegaE1910כוללת את וקטור המדווח הריק הבסיסי pGL3 (גחלילית לוציפראז), pRLTK רנילה לוציפראז וקטור ביטוי וקטורי בקרה אחרים.
QIAprepQiagen27104עבור מיני-הכנה של פלסמיד - בידוד וטיהור של DNA פלסמיד ממושבות חיידקים
pCR2.1 וקטורחלק מערכת השיבוט TOPO TA
לוציפראז המכיל וקטורPromegaE1751
pRL-TK Renilla luciferase וקטור ביטויPromegaE2241
כרומוזום מלאכותי חיידקימרכז המשאבים של BACPAC, ילדים s Hospital Oakland Research Institute, אוקלנד, קליפורניהRP23-285A12 ו-RP24-314E24http://bacpac.chori.org/clones.htm
<חזק>ריאגנטים/כימיקלים/מדיה/אספקה
TRIzolLife Technologies15596026
Wizard® מערכת ניקוי ג'ל SV ו-PCR PromegaA9281שימושי לטיהור מוצרי PCR לאחר עיכול עם אנדונוקלאזות הגבלה
CRYOVIALSDenville ScientificV9012
SOFTWARE:
Ensembl softwareפרויקט אנסמבלhttp://Ensembl.org פרויקט האנסמבל מייצר מאגרי מידע גנומיים עבור בעלי חוליות ומינים איקריוטיים אחרים, והופך את המידע הזה לזמין בחינם באינטרנט.
תוכנת פיצוץNCBIhttp://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD=
אינטרנט & PAGE_TYPE=תוכנת BlastHome
Primer 3Simgenehttp://simgene.com/Primer3שימושי לתכנון פריימרים עבור מסד
נתונים נוקלאוטידיNCBIhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/
<חזק>קווי תאים:
TM4 תאי סרטולי עכברייםATCC, Manassas, VirginiaCRL-1715&1715™
<חזק>מכשירים:
לומינומטרטרנר ביוסיסטמסTD-20/20זהו לומינומטר זול יחסית, המופעל ידנית. מערכות אוטומטיות זמינות גם מאותו יצרן המשתמשות ב-96 צלחות באר.
ספקטרופוטומטרים NanoDropThermo Scientific, Inc.NanoDrop 2000יכול להשתמש בכמויות קטנות מאוד של
ספקטרופוטומטר DU 800 UV/VIS דגימה ותוכנת ניתוח חומצות גרעין IIBeckmanCoulter Inc, Fullerton,CA DU 800
pGL3-בסיסי 5'-RACE PCR NCBI ספקטרופוטומטר

מקורות

  1. Kimura, K., et al. Diversification of transcriptional modulation: large-scale identification and characterization of putative alternative promoters of human genes. Genome Res. 16 (1), 55-65 (2006).
  2. Doyle, L. A., et al. A multidrug resistance transporter from human MCF-7 breast cancer cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (26), 15665-15670 (1998).
  3. Natarajan, K., Xie, Y., Baer, M. R., Ross, D. D. Role of breast cancer resistance protein (BCRP/ABCG2) in cancer drug resistance. Biochem Pharmacol. 83 (8), 1084-1103 (2012).
  4. Qian, X., Cheng, Y. H., Mruk, D. D., Cheng, C. Y. Breast cancer resistance protein (Bcrp) and the testis--an unexpected turn of events. Asian J Androl. 15 (4), 455-460 (2013).
  5. Xie, Y., et al. Bcrp1 transcription in mouse testis is controlled by a promoter upstream of a novel first exon (E1U) regulated by steroidogenic factor-1. Biochim Biophys Acta. 1829 (12), 1288-1299 (2013).
  6. Maliepaard, M., et al. Subcellular localization and distribution of the breast cancer resistance protein transporter in normal human tissues. Cancer Res. 61 (8), 3458-3464 (2001).
  7. Fetsch, P. A., et al. Localization of the ABCG2 mitoxantrone resistance-associated protein in normal tissues. Cancer Lett. 235 (1), 84-92 (2006).
  8. Cooray, H. C., Blackmore, C. G., Maskell, L., Barrand, M. A. Localisation of breast cancer resistance protein in microvessel endothelium of human brain. Neuroreport. 13 (16), 2059-2063 (2002).
  9. Kolwankar, D., Glover, D. D., Ware, J. A., Tracy, T. S. Expression and function of ABCB1 and ABCG2 in human placental tissue. Drug Metab Dispos. 33 (4), 524-529 (2005).
  10. Xiong, H., et al. ABCG2 is upregulated in Alzheimer's brain with cerebral amyloid angiopathy and may act as a gatekeeper at the blood-brain barrier for Abeta(1-40) peptides. J Neurosci. 29 (1-40), 5463-5475 (2009).
  11. Woodward, O. M., et al. Identification of a urate transporter, ABCG2, with a common functional polymorphism causing gout. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (25), 10338-10342 (2009).
  12. Huls, M., et al. The breast cancer resistance protein transporter ABCG2 is expressed in the human kidney proximal tubule apical membrane. Kidney Int. 73 (2), 220-225 (2008).
  13. Nakanishi, T., et al. Novel 5' untranslated region variants of BCRP mRNA are differentially expressed in drug-selected cancer cells and in normal human tissues: implications for drug resistance, tissue-specific expression, and alternative promoter usage. Cancer Res. 66 (10), 5007-5011 (2006).
  14. Ayoubi, T. A., Van De Ven, W. J. Regulation of gene expression by alternative promoters. FASEB J. 10 (4), 453-460 (1996).
  15. Zong, Y., Zhou, S., Fatima, S., Sorrentino, B. P. Expression of mouse Abcg2 mRNA during hematopoiesis is regulated by alternative use of multiple leader exons and promoters. J Biol Chem. 281 (40), 29625-29632 (2006).
  16. Natarajan, K., et al. Identification and characterization of the major alternative promoter regulating Bcrp1/Abcg2 expression in the mouse intestine. Biochim Biophys Acta. 1809 (7), 295-305 (2011).
  17. Ensembl Genome Browser. , http://Ensembl.org (2015).
  18. Transcript-based Display from Ensembl. , http://www.ensembl.org/Mus_musculus/Transcript/Exons?db=core;g=ENSMUSG00000029802;r=6:58584523-58692869;t=ENSMUST00000031822 (2015).
  19. Basic Logical Alignment Search Tool (BLAST) homepage. , http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD=Web&PAGE_TYPE=BlastHome (2015).
  20. National Center for Biotechnology Information (NCBI). , http://www.ncbi.nlm.nih.gov (2015).
  21. Promega. Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System - INSTRUCTIONS FOR USE OF PRODUCT. , (2009).
  22. New_England_Biolabs. Quick Ligation Kit Protocol - M2200S. , (2014).
  23. Roche. XtremeGENE HP DNA Transfection Reagent Protocol - Manual version 1.0). , (2010).
  24. Promega. Quick Protocol for the use of the Dual-Luciferase Reporter Assay. , (2009).
  25. Carninci, P., et al. The transcriptional landscape of the mammalian genome. Science. 309 (5740), 1559-1563 (2005).
  26. VanBuren, V., et al. Assembly, verification, and initial annotation of the NIA mouse 7.4K cDNA clone set. Genome Res. 12 (12), 1999-2003 (2002).
  27. Bonaldo, M. F., Lennon, G., Soares, M. B. Normalization and subtraction: two approaches to facilitate gene discovery. Genome Res. 6 (9), 791-806 (1996).
  28. Okazaki, Y., et al. Analysis of the mouse transcriptome based on functional annotation of 60,770 full-length cDNAs. Nature. 420 (6915), 563-573 (2002).
  29. Landry, J. R., Mager, D. L., Wilhelm, B. T. Complex controls: the role of alternative promoters in mammalian genomes. Trends Genet. (11), 640-648 (2009).
  30. Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nat Rev Genet. 10 (10), 669-680 (2009).
  31. Bulun, S. E., et al. Regulation of aromatase expression in breast cancer tissue. Ann N Y Acad Sci. 1155, 121-131 (2009).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Bcrp1in silicoEST
שיטות לגלות אלטרנטיבי שימוש יזם ותקנת תעתיק של Murine Bcrp1
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.