באמצעות טומוגרפיה מיקרו שחושבת הערכת התפתחות גידול ומעקב של תגובה לטיפול במודל עכברי של סרטן הריאות

Summary

אנו מתארים שיטה לזיהוי התפתחות קשריות גידול בריאות של מודל עכבר אדנוקרצינומה באמצעות טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת והשימוש בה לניטור שינויים בגודל הגוש לאורך זמן ובתגובה לטיפול. דיוק ההערכה אושר באמצעות כימות היסטולוגי של נקודת הקצה.

Abstract

סרטן ריאות הוא הסרטן הקטלני ביותר בעולם. מחקר אינטנסיבי נמשך ברחבי העולם לזיהוי טיפולים חדשים לסרטן הריאות. מספר מודלים עכבריים של סרטן ריאות משמשים לחקר מנגנון התפתחות הסרטן ולניסויים באסטרטגיות טיפוליות שונות. עם זאת, היעדר טכניקה בזמן אמת לזיהוי התפתחות גושי גידול בריאות עכברים ולניטור השינויים בגודלם בתגובה להתערבויות ניסיוניות וטיפוליות שונות פוגע ביכולת לקבל תיאור מדויק של מהלך המחלה ותגובתה בזמן לטיפולים. במחקר זה מתוארת שיטה המשתמשת בסורק טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת (CT) לאיתור התפתחות גידולי ריאה במודל עכבר של אדנוקרצינומה ריאתית. לאחר מכן, אנו מראים כי מעקב חודשי עם מיקרו-CT יכול לזהות שינויים דינמיים בגידול הריאה, כגון הופעת גושים נוספים, עלייה בגודל הגושים שזוהו בעבר וירידה בגודל או ברזולוציה המלאה של גושים בתגובה לטיפול. לבסוף, הדיוק של שיטת הערכה בזמן אמת זו אושר באמצעות כימות היסטולוגי של נקודת הקצה. טכניקה זו סוללת את הדרך לתכנון וביצוע ניסויים מורכבים יותר במודלים של בעלי חיים של סרטן ריאות, והיא מאפשרת לנו להבין טוב יותר את מנגנוני הסרטן ואת ההשפעות של שיטות טיפול שונות תוך חיסכון בזמן ובמשאבים.

Introduction

סרטן הריאות הוא הגורם המוביל למוות מסרטן ברחבי העולם ^1. מחקר לתוך מניעה, איתור מוקדם וטיפול של סרטן ריאות הוא מתמשך מרכזי מחקר רבים ברחבי העולם ^2,3. במודלים של בעלי חיים כמה לסרטן הריאות פותחו, והם הוכיחו שימושיים לחקר המנגנונים של סרטן ריאות תאים ממוצא, בקביעת הנוכחות של תאי גזע סרטני, ובבחינת אסטרטגיות טיפוליות חדשניות שונות ^4. דגמים קודמים הסתמכו על התחלה של גידול נגרם מסרטן זנים רגישים של עכברים ^5. התפתחות בנוקאאוט ומודלים עכבר מהונדס בהם סרטן הריאות עולה כתוצאה נגעים גנטי מניפולציות במיוחד השתפרה היכולת שלנו באופן משמעותי לשלוט אינדוקציה הגידול והיבטים לחקות כמה סרטן ריאה אנושית ^4. עם זאת, אתגר גדול בשימוש במודלים של בעלי חי סרטן הריאות הוא העדר שיטה בזמן אמתבמדויק לזהות ולנטר את ההופעה ופיתוח של גידולי ריאות עכבר כדי לתעד כל שינוי מאוחר יותר בגדלים שלהם, כגון צמיחה או המשך ההקטנה שלהם בתגובת טיפולים. זה אלץ לחוקרים לנקוט כמה זמן, מאמץ, וטכניקות גוזלות משאבים לזהות את הגידולים, להעריך תוצאות הניסוי שלהם. הנוכחות של וריאציה בין עכבר טמונה בתגובת אינדוקצית גידול מחייבת שימוש של מספר רב של בעלי חיים בכל קבוצת ניסוי כדי להפחית השתנות נתונים. חוסר היכולת להעריך את צמיחת גידול או תגובה לטיפול בזמן האמת אלצה חוקרים להרדים עכברים בעיוורון בזמן נקודות מרובות פרוטוקולי ניסוי ממושכים כדי להבטיח שהם יאספו את הנתונים הנכונים, וכתוצאה מכך הבזבוז של משאבים מן הדגימות שנאספו בנקודות זמן כי הם או מוקדם מדי או מאוחר מדי.

במחקר הנוכחי, שיטה לנצל ג-מיקרו קטן-חיהטומוגרפיה omputed (מיקרו CT) סורק לאיתור ומעקב גידולי ריאה לחיות עכברים הוא הציג. השתמשנו תיאר שלנו לאחרונה Sftpc-rtTA ו Tre-FGF9-ires-egfp פעמיים מהונדס (DT) עכברים לפתח במהירות אדנוקרצינומה ריאות בעקבות אינדוקציה עם דוקסיציקלין ^6,7. שימוש מייקרו-CT מאפשר לנו (בין יתר) לכלול עכברים עם מומי ריאות סוטים לפני הגיוס, לאשר פיתוח של גושים סרטניים הבריא לאחר אינדוקציה, ולבחון שינויי גושים סרטניים בתגובת טיפולים ניסיוניים. המתת חסד של עכברים קצה והערכה היסטולוגית אישרו את הדיוק של הערכה בזמן אמת שנערך עם-CT מיקרו. אנו מאמינים כי הטכניקה הזו תסלול את הדרך לביצוע ניסויים טוב מתוכנן תוך שימוש במודלים של בעלי חיים סרטן הריאות תוך חיסכון משאבים יקרי ערך, קיצור זמן תצפית והגדלת דיוק והבנה של תוצאות.

Protocol

ניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש של Keio University.

הערה: במחקר זה, השתמשנו Sftpc-rtTA ו Tre-FGF9-ires-egfp DT עכברים שבו אדנוקרצינומה ריאות מפתחת במהירות לאחר אינדוקציה על ידי האכלה צ'או המכיל דוקסיציקלין ^6,7. עם זאת, כל נהלי ההערכה ניתן ליישם מודלים עכבריים של סרטן הריאה אחרים.

מתאר ניסוי 1.:

1. לזהות את המצב של הריאות על קו הבסיס:
   1. לפני אינדוקציה הגידול, כאשר העכברים DT הם 8 - 12 שבועות, לבצע את הסריקה מיקרו-CT הראשון (ראו סעיפים 2 ו 3 להלן). זה ממשמש את סריקת בסיס הריאות, מאשר בהעדר הגושים להיוצר באופן נגרם על ידי transgene דולף, ולתעד בהעדר פתולוגיה ריאות קיימת לפני גיוס גידול.
2. ליזום אינדוקצית גידול:
   1. Switch עכברי DT מ ch הרגילow כדי צ'או דוקסיציקלין לגרום גורם הגדילה פיברובלסטים (FGF) ביטוי 9 בתאי השומן וליזום התפתחות גידולים. תן צ'או דוקסיציקלין (200 עמודים לדקה) כרצונך.
3. אשר את הפיתוח של גושים סרטניים ריאות עכבר:
   1. ביצוע סריקה מיקרו-CT לזהות התפתחות של גושים סרטניים לעומת הסריקה מראש אינדוקציה.
4. הערכת תגובה לטיפול:
   1. כדי לבדוק את היכולת של מיקרו-CT כדי לזהות שינויים גושים סרטניים בתגובה טיפול, לנהל את קולטן FGF (FGFR) מעכב AZD4547, ואז לבצע סריקות מיקרו-CT נוספת לאחר 5 ו -10 שבועות.
5. הערכת נקודת סיום:
   1. להרדים כל עכברי הטיפול וביקורת ורקמות תהליך להערכה היסטולוגית (ראה סעיף 6 להלן).

2. עכברי הכנות לקראת רכישת תמונת מייקרו-CT:

1. הפעל את הסורק והמחשב מיקרו-CT.
2. Click על תוכנה בשם "R_m CT2", ואז ללחוץ על "להתחמם".
3. הסר המיטה המדגם שעליו העכבר יוצב מהאולם מיקרו-CT. עוטפים את המיטה בניילון נצמד.
4. הגדר את תיבת אינדוקציה הרדמה על ידי הוספת isoflurane כדי מאדה הרדמה עד לרמה ניכרת. הגדר את קצב זרימת isoflurane ב 3 ליטר / דקה.
5. פתח את בלון החמצן כדי להפעיל את זרימת החמצן לתוך תיבת האינדוקציה ולהגדיר את קצב הזרימה של 1 ליטר / דקה.
6. מניחים את העכבר בתיבת הרדמה אינדוקציה אשר שהוא בהרדמה עמוקה מהיעדרם של תנועה ספונטנית ובתגובה קמצוץ העור (קמצוץ עדין של קפל קטן של העור, אשר אינו גורם נזק לרקמות או הפסקה העור).
7. החל סיכה עינית למניעת יובש קרני במהלך הרדמה.
8. פתח את תא מיקרו-CT ומניחים את העכבר עם הצד הגבי על המיטה מדגם. להחזיק את הראש של העכבר ולמשוך את הגוף כלפי מטה מן הגפיים התחתונים ב יורדr למתוח וליישר את הגוף באופן סימטרי.
9. כבה את זרימת הרדמה אל תיבת אינדוקציה ולהדליק אותו לכיוון הצינור המתחבר לתא מיקרו-CT.
10. מניח את צינור ההרדמה לתוך האף של העכבר כדי לנהל הרדמה רציפה.
11. על מנת לתקן את העכבר בעמדה; לעטוף את העכבר והמיטה מדגם בניילון נצמד.
    הערה: זה קריטי כדי לשמור על העכבר בהרדמה עמוקה עטוף למיטה המדגמת כי כל תנועה קלה או טוויסט של הגוף שלה במהלך הסריקה תגרום תמונות מעורפלות וקושי הפרשנות.
12. סגור את תא מיקרו-CT.
13. התאם את מערכת מיקרו CT עד 90 קילו ו -160 מיקרו-אמפר ואת זמן הסריקה ל -4.5 דקות. הגדר את טווח התמונה 24 × 19 מ"מ ואת גודל voxel 50 × 50 × 50 מיקרומטר. השתמש במצב סינכרוני עבור פעימות לב.
14. צור תיקייה חדשה במסד הנתונים "" כדי לשמור את התמונות חדשות בתיקייה זו.
15. התחל את הסריקה.
16. לאחר השלמת הסריקה, להזיז את העכבר לתוך כלוב ריק ולבחון אותו עד שהוא חוזר להכרה. אין לשים אותה עם עכברים אחרים עד שהוא התאושש לחלוטין מהשפעות ההרדמה.

3. ויזואליזציה תמונה טרום אינדוקציה מיקרו-CT וניתוח:

1. כדי להמחיש את התמונות מיקרו-CT, להוריד את התוכנה ImageJ בחינם מאתר האינטרנט הבא: http://imagej.nih.gov/ij/ . הערה: כל קובץ נתונים מיקרו-CT הוא ערימה של כ 500 קבצי TIF (.tif). תוכנה להצגת תמונות אחרת יכולה לשמש גם.
2. פתח את קבצי התמונות מיקרו-CT סדרתי לגלול את כל התמונות של כל עכבר מהצוואר אל הבטן או להיפך.
3. באמצעות סריקות של עכברי-בר נאיבי, לזהות את הצפיפות של אזורים שונים ומבנים אנטומיים נורמלים בחזה המבוסס על ידע של אנטומיה עכבר (ראה איור 1 א).
   1. החזק את הסמן עםעכבר המחשב לגלול מעלה, החל מן הקרביים לבנבן הבטן והסרעפת, דרך החזה עד הצוואר.
   2. זהה את ציוני הדרך כלוב החזה הגרמי (עצם החזה מלפנים, החוליות בגב ובצלעות בצדדים).
   3. זהה את הלב בחלק הקדמי של החזה ואת כלי הדם הגדולים ליד הלב ובסופו של חלל החזה.
   4. שימו לומן קנה הנשימה (כמו עיגול כהה קטן ברמה של הצוואר והחזה העליון), אשר מתפצל ימינה הסמפונות הבכירים עזבו אז ממשיכים להסתעף לתוך הסמפונות ומצטמק. שים לב שכל הסמפונות קשורה קשר הדוק עם כלי דם שניים או שלושה (איור 1 א).
4. התחל בחינת הסריקות של עכברי un-induced DT ולזהות את הנוכחות של כל חריגות.
   1. אל תכלול עכברים עם צללי ריאות טרם גיוס חריגים (למשל, גושים, בולות emphysematous, וכו ') מכל ניסויים נוספים. (תרשים 1C-E, G, H ).

אינדוקציה גידול 4.:

1. כדי לגרום להתפתחות גידולים בעכברים הניסיונות הראתה סריקות ריאות נורמליות, לעבור את מזונם צ'או צ'או סדיר דוקסיציקלין המכיל (200 עמודים לדקה).

5. סריקות מעקב:

1. לאחר 10 שבועות, לבצע סריקה מיקרו-CT השני של כל העכברים כדי לאשר את הפיתוח של גושים סרטניים הריאות שלהם (ראה איור 2).
2. פיצול עכברים לשתי קבוצות. לנהל את AZD4547 חוסם FGFR (125 מיקרוגרם / קילו / היום באמצעות צינור קיבה במשך 6 ימים / שבוע במשך 10 שבועות) לקבוצה אחת ופלצבו לקבוצת הביקורת האחרת במשך 10 שבועות נוספים.
3. בצע את השינויים בין צללי קשרים ידי ביצוע סריקה שלישית 4 - כעבור 5 שבועות.
4. בסוף 10 שבועות של טיפול, לבצע סריקה רביעית.
5. להרדים כל העכברים עם משאיפת CO ₂ או עם זריקה intraperitoneal של 0.1 מ"ג / 200 μl של pentobarbital.
6. ללזהות את השינויים הדינמיים הגושים הסרטניים לאחר אינדוקציה בתגובה לטיפול, לזהות עמדות דומות בתוך לסרוק תמונות סדרתי של אותה העכבר שונה שתיים או יותר נקודות זמן ואז לבדוק את המראה / היעלמות כל צללים נורמלים (איור 3 ).
7. כדי להקל על זיהוי של אותו המישור באותו עכבר בזמן נקודות שונות, לנסות לשייך את מטוס עניינים עם מבני ציון דרך אנטומי בתוך חזה העכבר.
   1. להשתמש בציוני דרך כגון קנה נשימה, ההסתעפות שלה, ימין הסמפונות בכירים עזבו, אב עורקים, סרעפת, וכלי דם גדולים.
      הערה: עצמות חזה, כוללים חוליות בית החזה, צלעות, ועצם החזה הן פחות שימושיות כציונים דרך מיצוב בגלל ומטה קטין נפוץ יישור גוף עכבר על המיטה המדגמת, המגדילים את האפשרות של פרשנות שגויה של עמדת הסריקה. באופן דומה, את המספר הסידורי תמונה בתוך קובץ הסריקה אינו מהימן עבור identifyinז באותה תנוחה לאורך זמן בגלל השינוי באורך גוף העכבר מ-נקודת זמן אחת לאחרת. אי או אי דיוק בזיהוי באותו מישור בנקודות זמן שונות עלול לגרום פרשנות חיובית / שלילית שגויה של הממצאים.

6. עכבר המתת חסד ריאות אוסף:

1. להרדים עכברים עם שאיפת CO ₂ או עם זריקה intraperitoneal של 0.1 מ"ג / 200 μl של pentobarbital.
2. לחשוף את הקרביים בטן ידי חיתוך אורכי דרך דופן הבטן. Bleed בעכבר כדי להפחית את נפח הדם של הריאות על ידי לנתח את אבי העורקים בבטן.
3. חותכים את הסרעפת עם מספריים בסדר; זו תגרום לאובדן של לחץ שלילי מחלל החזה, ובכך ממוטט את הריאות. לחשוף את הריאות והלב על ידי חיתוך והסרת חלקים של הצלעות של דופן בית החזה הקדמי. נקה את החלק הקדמי של הצוואר על ידי חיתוך בעור וברקמות רכות לחשוף את קנה הנשימהא.
4. לחתוך את הלב ואת בלוטת התימוס. הכנס מלקחיים מאחורי קנה הנשימה כדי להפריד בינו לבין הוושט.
5. Cannulate קנה הנשימה עם צינורית G24 ואז לאבטח אותו במקומו על ידי הידוק חוט סביב החלק המוכנס.
6. לנפח ולתקן את הריאות באמצעות paraformaldehyde 4% קר כקרח (PFA) דרך צינורית לקנה הנשימה באמצעות טור 25 ס"מ. לנתק את הצינורית להדק את החוט כדי למנוע דליפת PFA ואז לחתוך את קנה הנשימה העליונה את התקשרותו אל הגרון.
7. משוך את קנה הנשימה מן החוט תפר לנתח אותו מעיקול שלה, ולהמשיך כלפי מטה כדי להסירו עם ריאות en -block. הכנס אותו לתוך צינור 15 מ"ל המכיל 5 מ"ל של 4% PFA. השאירו את הריאות ב PFA O / N כדי להבטיח חדירה רקמה שלמה קיבעון, ואז לעבד את הרקמה לתוך בלוק פרפין תקן ^8.
8. חותכים בלוקים פרפין לתוך 6 אום-פרוסות עבות על microtome ואת הכתם עם hematoxylin ו eosin באמצעות טכניקות סטנדרטיות.

7. הערכה היסטולוגית:

הערה: למרות השימוש של "סורק שקופיות" להערכה דיגיטלית היסטולוגית מתואר כאן, השימוש מיקרוסקופי רגילות ערכה היסטולוגית חזותית להערכה הוא גם אפשרי.

1. הפעל את המכשיר סורק שקופיות המחשב.
2. הקש על תוכנת "סריקת NDP".
3. בחר את מצב הסריקה "תצווה של שקופיות" לבין "מצב אוטומטי חצי" לסריקת סדרה של שקופיות.
   הערה: זרוע רובוטית כי מרימה את השקופיות במהלך סריקה סדרתית רגיש מאוד חריגות על הקצוות של שקופיות זכוכית.
4. למשש את הקצוות של כל שקופיות הזכוכית לפני הטעינה אותם למכונית. אם יש בליטה של ​​הזכוכית המכסה או הרכבה בינונית יבש, לנקות אותו בסכין חיתוך או אזמל.
5. טען את השקופיות לתוך קלטת שקופיות. פתח את צוהר הדגימה וחלק את הקלטת למקומו "אחד";. סגור את הדלת.
6. על תוכנת המחשב, לתת שמות תיאוריים קצרים על כל השקופיות בעמדה שלהם שמופיעים קלטת ולאחר מכן לחץ על הלחצן "אישור".
7. בחרו במצב פרופיל: "Brightfield".
8. לחץ על "התחל יצווה" כדי להתחיל את הסריקה הזמנית.
   הערה: לאחר שהמכשיר כבר סיים לסרוק את כל השקופיות, התוכנה תזהה באזורים אוטומטיים עם רקמות על כל השקופיות ולהציע אותו כאזור של עניין.
9. במידת הצורך, להגדיר מחדש את האזור של עניין על ידי לחיצה רצופה על כפתור העכבר השמאלי מושך את הגבול באזור.
   הערה: הגדרת שטחים גדולים באופן מוגזם של השקופיות כמו האזורים של הריבית יביאו מחזיק מעמד זמן רב סריקה.
10. לאחר מרוצים האזורים של אינטרסים על כל השקופיות, לחץ על "סרוק" כדי להתחיל לסרוק כל השקופיות.
    הערה: הקבצים הסרוקים ניתן לראות דיגיטלית ברזולוציה נמוכה וגבוהה, וניתן לייצא תמונות כמו JPEGקבצים.

Results

זיהוי של עכברים עם מומי ריאות בוצע בתחילת המחקר. לפני אינדוקציה הגידול, כאשר העכברים DT היו 8 - 12 שבועות של גיל, הריאות של כל העכברים נסרקו עם-CT מיקרו. באופן מפתיע, כ 50% של עכברים הראו מומים כי הכריחו אותנו רואה אותם מתאימים להכללה במחקר שלאחר מכן. ליקויים אלה היו צללים דמויים גולים, בולות emphysematous קטנות אחד או מספר גדולים ו / או תמט ריאות אוֹנִי (איור 1 א, ג, DE, GH). לאחר מכן, אינדוקצית transgene ואת גידול FGF9 ה...

Discussion

שיטת מייקרו-CT המבוסס המתואר כאן לזיהוי בזמן האמת של מומי ריאות והניטור של התפתחות גושים סרטניים ואת התגובה לטיפול בבעלי חי סרטן הריאות תאפשרנה למדענים שמנהלי ניסויים הקשורים לסרטן ריאות לתכנן יותר ניסויים מדויקים ויעילים תוך חיסכון בזמן ומשאבים. השתמשנו בעבר MRI לאותה מטרה ^6. הבהירות של הסריקה סף לצורך זיהוי של גושים ריאות עם MRI היו נחותים מאלו עם סריקות מיקרו-CT המתוארים במחקר זה ^6.

מחקרי...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
מיקרו-רנטגן– טומוגרפיה ממוחשבת	Rigaku	R_mCT2
NanoZoomer RS מערכת פתולוגיה דיגיטלית	Hamamatsu	RS C10730
NDP.view2  תוכנת צפייה	Hamamatsu	U12388-01
וופורייזר איזופלורן http://www.hamamatsu.com/jp/en/U12388-01.html - תא	VETEQUIP	911103
, 2 ליטר  W9.5 ופעמים; D23 וזמנים; H9.5	VETEQUIP	941444
Isoflurane	Mylan	ES2303-01
AZD 4547	LC Labratories	A-1088
Pentobarbital	Kyoritsu	SOM02-YA1312
G24 צינורית	Terumo	SP-FS2419
Paraformaldehyde	Wako	163-20145
Microtome	Leica	RM2265
Doxycycline	SLC Japan/PMI Nutrition International	5TP7
ImageJ תוכנה	המכון הלאומי לבריאות		http://imagej.nih.gov/ij/
משחה וטרינרית Puralube (חומר סיכה אוקולרי)	Dechra	NDC 17033-211-38