מאמר שיטה

Microdissection לייזר בסיוע (LAM) ככלי פרופיל תעתיק של סוגי תאים בודדים

8.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/53916

⸱

10 במאי 2016

 ,  , 
1University of Zürich & Zürich-Basel Plant Science Center

במאמר זה

סיכום

כאן אנו מציגים פרוטוקול למיקרו-דיסקציה בסיוע לייזר של סוגי תאי צמחים ספציפיים לפרופיל שעתוק. בעוד שהפרוטוקול מתאים למינים וסוגי תאים שונים, ההתמקדות היא בתאים בלתי נגישים מאוד של קו הנבט הנקבי החשובים לרבייה מינית ואפומית בסוג המצליבים Boechera.

תקציר

הבנת תהליכי התפתחות ברמה המולקולרית דורשת תובנות לגבי ויסות השעתוק, ובכך הטרנסקריפטום, ברמה של סוגי תאים בודדים. בעוד שהשיטות המתוארות כאן ישימות בדרך כלל למגוון רחב של מינים וסוגי תאים, המחקר שלנו מתמקד ברבייה של צמחים. לגידול צמחים וייצור זרעים יש חשיבות מכרעת לתזונת בני אדם ובעלי חיים. הבנה מפורטת של רשתות הרגולציה השולטות בהיווצרות שושלת הרבייה (קו הנבט) ובסופו של דבר של זרעים היא תנאי מוקדם למניפולציה ממוקדת של רביית צמחים. בפרט, הנדסת אפומיקסיס (רבייה א-מינית באמצעות זרעים) לצמחי יבול מבטיחה שיפורים גדולים, מכיוון שהיא מובילה להיווצרות זרעים משובטים זהים גנטית לצמח האם. כתוצאה מכך, לסוגי התאים של קו הנבט הנקבי יש חשיבות רבה להבנה והנדסה של אפומיקסיס. עם זאת, מכיוון שהתאים המתאימים מוטמעים עמוק בתוך רקמות הפרחים, קשה מאוד לגשת אליהם לניתוחים ניסיוניים, כולל טרנסקריפטומיקה ספציפית לסוג התא. כדי להתגבר על מגבלה זו, ניתן לבודד חלקים של תאים בודדים על ידי מיקרו-דיסקציה בסיוע לייזר (LAM). בעוד ש-LAM בשילוב עם פרופיל שעתוק מאפשר זיהוי של גנים ומסלולים הפעילים בכל סוג תא עם ספציפיות גבוהה, קביעת פרוטוקול מתאים יכולה להיות מאתגרת. באופן ספציפי, איכות ה-RNA המתקבלת לאחר LAM עלולה להיפגע, במיוחד כאשר תאים קטנים ובודדים ממוקדים. כדי לעקוף בעיה זו, הקמנו זרימת עבודה עבור LAM שמביאה באופן שחזורי לאיכות RNA גבוהה המתאימה היטב לטרנסקריפטומיקה, כפי שמודגם כאן על ידי בידוד תאים של קו הנבט הנקבי בבוצ'רה אפומיקטית. בפרוטוקול זה מתוארים נהלים להכנת רקמות ו-LAM, גם ביחס למיצוי RNA ובקרת איכות.

מבוא

במחקרי תעתיק נעשו ברמת הרקמה, transcriptomes של סוגי תאים מיוחדים אבל נדירים מאוד לעתים קרובות הם רעול פנים על ידי התאים שמסביב שופעים יותר. דוגמא עבור תאים מסוגים אלה מאוד מיוחדים הם התאים של שושלת הרבייה הנשית (germline) בצמחים. Germline הנקבה המצוין בתוך ביציות מתפתחות, המבשרים של זרעים בתוך gynoecium של 1,2 הפרח. תא אמא megaspore (MMC) הוא התא הראשון של germline הנשי. זה עובר המיוזה לגבש הטטרדה של megaspores מופחת. בדרך כלל, רק אחד megaspores אלה שורד ומחלק mitotically ללא cytokinesis, כלומר, בתוך syncytium. mitoses אלה ואחריו cellularization כדי ליצור את גמטופיט הבוגרת, אשר בדרך כלל מורכב מארבעה סוגי תאים: שלושה antipodals, שני תאים synergid, ביצה, והתא המרכזי. תאי הביצה ומרכזיים הם הגמטות נקבה כי לקבל מופרת על ידי שני תאי זרע במהלך douהפריה ble כדי להצמיח את העובר ואת האנדוספרם של 1,2 הזרע המתפתח. ב thaliana ארבידופסיס מערכת מודל המיני, רק ~ 50 זרעים לפתח לכל פרח בעוד כ -50 - 80 זרעים לפתח לכל פרח הסוג הקשור קשר ההדוק Boechera. לפיכך, germline הנשי מורכב רק כמה מאוד סוגי תאים מיוחדים, מה שהופך אותו מודל מצוין ללמוד תהליכים התפתחותיים, כגון תא מפרט והבחנה.

יתר על כן, תובנה התהליכים רגולטוריים גן מסדירי רביית צמח יכולות להיות בעל ערך שימושי. בצמחים, הוא רבייה מינית מינית באמצעות זרעים (apomixis) יכולה להתרחש. בעוד רבייה מינית מייצר מגוון גנטי באוכלוסייה, apomixis מוביל להיווצרות של צאצא משובט זהה גנטי לצמח האם. לכן, apomixis יש פוטנציאל גדול עבור יישומי חקלאות וייצור זרע, כמו גנוטיפים אימהי מורכב אפילו יכוללהישמר ללא שינוי במשך כמה דורות 3,4,5. בגלל apomixis אינו מתרחש באופן טבעי בכל מיני יבול עיקריים, ההנדסה של apomixis בגידולים הוא של 3,4,5 עניין רב. עם זאת, המטרה ארוך הטווח הזה קשה להשיג כי הבסיס הגנטי ואת המולקולריים שבבסיס של apomixis אינו מובן בפירוט מספיק 6.

כדי לקבל תובנות לתוך הבסיס תעתיק המסדירים רבייה apomictic, פרופיל תעתיק סוג תא ספציפי באמצעות microdissection לייזר בסיוע (LAM) וסדר הדור הבא (NGS) מייצג גישה מאוד חזק 7,8. LAM הוקם הראשון עבור בעלי חיים המחקר הביו-רפואי. בשנים האחרונות LAM גם יושם לביולוגיה צמח 6,9,10. בניגוד לשיטות אחרות המאפשרות אפיון של סוגי תאים ורקמות פרט, LAM אינו מחייב את הדור של קווי סמן 6,9,10. לכן, זה יכול להיות אפליקציהשייקר סוג תא או רקמה שהיא ללא ידע מולקולרי מוקדם. יתרון נוסף של LAM הוא שזה יכול להיות מיושם על כל סוג תא כל עוד התא ניתן להכיר בסעיפים יבשים על בסיס מיקום ו / או תכונות מבניות. יש LAM יתרון הנוסף רקמות קבועות משמשות, אשר מונע שינויים של פרופיל התעתיק במהלך עיבוד.

הרקמה של עניין, למשל, רקמת פרחים, הוא קבוע מקבע הלא crosslinking לפני הטבעה ב פרפין. שיבוץ שעוות פרפין ניתן לעשות זאת באופן ידני, לאחר פרוטוקולים הוקמו 9,11. עם זאת, השימוש של מעבד רקמות אוטומטי התייבשות וחדירה עם השעווה בדרך כלל תוצאות שחזור גבוה במונחים של שימור איכות RNA ומורפולוגיה רקמות. האסטרטגיה החלופית הטבעת רקמות שרף גם שמשה בהצלחה עבור ניתוחי סוג תא ספציפי על ידי LAM 8. עם זאת, השימוש של automמעבד רקמות ated מוטבע שעווה מאוד זמן יעיל, כפי שניתן לעבד דגימות רבות בבת אחת המחייב מינימום של הידיים על הזמן. בעוד בדרך כלל ללא אובדן משמעותי של איכות RNA מתרחש במהלך קיבעון והטבעה, הכנת חלקים דקים עם microtome ו, בפרט, גוברת על frameslides המשמש LAM נשארה צעד קריטי לשמירה על איכות RNA. זה כבר ציין בעבר ושימוש מערכת העברת קלטת תואר לגרום איכות RNA טובה יותר בשלב זה 12. עם זאת, זה מוסיף נדבך נוסף גוזל זמן במהלך תקופת ההכנה של השקופיות וגם דורש ציוד מיוחד. פרוטוקול אופטימיזציה המתואר להלן reproducibly מייצרת RNA כי הוא באיכות מספקת עבור פרופיל תעתיק עם GeneCHIPs ואת הדור הבא הרצף (NGS) מתקרב 7,11,13,14. בנוסף, עם מיקרוסקופ microdissection הליזר המשמש, טוהר גבוה של סוגי התאים המבודדים היא תבוסהinely מיוצר 7,11,13,14.

סוג Boechera היא מערכת מודל מצוינת לחקר השלבים העיקריים של רביית apomictic. בשנת Boechera, מגוון של הצטרפויות מיניות apomictic שונים זוהה וניתן להשתמש בו עבור השוואתי מנתח 15,16,17. בהשוואת transcriptomes סוג תא ספציפי של תאים מן germline נקבה מן ארבידופסיס מינית apomictic Boechera, זיהינו גנים ושבילים באים לידי ביטוי באופן דיפרנציאלי, ובכך לזהות היבטים חדשים של תהליכים רגולטוריים המסדירים apomixis 7. בנוסף, מחקר זה אימת את התאמתו של LAM עבור תעתיק סוג תא ספציפי מנתח של סוגי תאים קטנים ונדירים. אנחנו כבר השתמשנו בפרוטוקול זה לניתוח של תאים מסוגים שונים במגוון של מיני צמחים, אבל מינים ושינויים ספציפי רקמות לפרוטוקול עשויים להידרש במקרים מסוימים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הערה: פרוטוקול זה מתאר הכנת הרקמה, microdissection בסיוע לייזר, והפקת RNA עבור פרופיל תעתיק. תמיד להשתמש בכפפות לאורך כל השלבים של הפרוטוקול. ללמוד ולשקול את הוראות הבטיחות עבור כל כימיקל המשמש. בפרט, יש לזכור כי Xylol מזיק ויכול לחדור כפפות מתנול כי הוא רעיל. עבור כל המכשירים המשמשים, עיין מדריכים למשתמש בהתאם.

הסרת 1. פעילות RNase מ זכוכית וציוד אחר

  1. לפני השימוש, לעטוף כל כלי זכוכית בנייר אלומיניום לפני האפייה עבור ~ 8 שעות ב 180 מעלות צלזיוס על מנת להבטיח RNAse איכות חינם.
  2. פנקו את כל משטחי מתכת (למשל, פינצטה) וכן הספסל העבודה ואת צלחת חימום עם פתרון טיהור RNase המתאים. לאחר מכן, לשטוף את המשטחים עם מים RNAse ללא להסיר את פתרון טיהור. בהמשך לכך, לנקות את המשטחים נוספים עם 70% EtOH.
  3. השתמש בכל היציקהמתכלה טיק (למשל, צינורות) חדש לגמרי ללא כל טיפול מקדים. אם זמין, השתמש מתכלה פלסטיק שיאושרו להיות RNase חינם.

קיבוע רקמות 2.

  1. כן 10 מיליליטר של המקבע של החקלאי (3: 1; V / V אתנול: חומצה אצטית) בצינור 15 מיליליטר טרי על קרח. (תמיד להכין המקבע של פארמר הטרי לפני השימוש). כחלופה, אתנול מקבע הלא crosslinking: חומצה אצטית (5: 1; v / v) יכול לשמש 18.
  2. השתמש זוג קנס של פינצטה לאסוף ניצנים בשלב ההתפתחותי של עניין. מיד לצלול ניצנים מקבע קר כקרח. השתמש 10 מ"ל של מקבע קיבעון של ~ 20 ניצנים או פרחים ארבידופסיס או Boechera הערה:. בעת שימוש מיני צמחים עם פרחים גדולים מומלץ לנתח את הפרחים עם סכין גילוח ליצור חתיכות קטנות לפני קיבוע.
    1. על מנת לקבל גמטופיט בוגרת, לעקר את 2 - 3 ניצני פרחים גדולים של inflorescence 2 ימים לפני הקציר.
  3. מלאו את התחתון של exsiccator עם קרח. פתח את צינורות המכילים דגימות, למשל, פרחים, ומניחים אותם על קרח, או על ידי הצבת אותם ישירות לתוך קרח בצורה שהם לא יכולים ליפול או באמצעות בעל המתאים. אבק לחדור במשך 15 דקות לפני השחרור של שואב האבק.
    1. חזור על חדירת אבק פעם במשך 15 דקות.
  4. שחרר את לילה ואקום ולאחסן (~ 12 שעות) על קרח. מכסים את דלי קרח עם רדיד המכסה או אלומיניום ולאחסן בדלי בחדר 4 ° C. או במקרר כדי למנוע את הקרח מפשיר. הערה: הארכת זמן הקיבעון אינו מומלץ.

רקמות 3. טבעת, חתך דק, ואת הרכבה על שקופיות LAM

  1. הטבעת רקמות.
    1. להחליף מקבע 70% אתנול מוכן עם אתנול טהור ומים חינם RNAse. השאירו את דגימות קרח עד לעיבוד נוסף. התחל לפdding של הדגימות באותו היום. במקרה לא מכונה לעיבוד רקמות זמין, המשך הטבעה ידנית כמתואר במקום אחר 9,11 ולהמשיך עם צעד 3.1.11.
    2. בעדינות להעביר את דגימות קלטות הטבעת רקמות עם פינצטה. היטב לסגור את הקלטות. שלב קריטי: הימנע גם ייבוש חלקי של המדגם במהלך שלב זה. הימנע סחיטה של ​​דגימות עם פינצטה.
      הערה: כדי לתייג את קלטות עיפרון אמור לשמש, באופן אידיאלי על ידי כתיבה על המשטח המשופע של הקלטת.
    3. אחסן את קלטת ההטבעה עמוסה ניצנים או הפרחים באתנול 70% עד שכל החומר מועבר קלטות ומכונת ההטבעה ניתן לטעון. לשם כך, השתמש שוקת מכתים זכוכית מלאה 70% אתנול.
    4. הסר את הסל של מעבד הרקמה מן הגבה של המכונה ולהעביר את קלטות הטבעה לסל עם המשטחים נוטים מול העליון באותו הכיוון. CRISTEP tical: בצע את זה מהר כדי למנוע כל ייבוש של הרקמות. אם עיבוד רב קלטות הטבעה בבת אחת, למקם את הדלי לתוך מיכל בחינם מתאים RNAse מלא 70% אתנול לפני טעינת הדגימות.
    5. שים את המכסה על מהסל ושמה סל חזרה לתוך הגבה. סגור את הגבה.
      הערה: מעבד הרקמות אוטומטיות מייבש את הדגימות, משנה את ממס Xylol, ועושה חדיר עם שעוות פרפין מומסת. בדרך כלל, זה נעשה בין לילה.
    6. הפעל את התוכנית של מעבד רקמות. ההגדרות הרגילות המומלצות הן 1 hr 70% EtOH, שלוש פעמים 1 hr 90% EtOH, שלוש פעמים 1 hr 100% EtOH, פעמיים 1 hr 100% Xylol, פעם אחת 1 hr 15 min 100% Xylol בטמפרטורת החדר, ואחריו חדירת עם שעוות פרפין פעמיים עבור שעה 1 ופעם אחת עבור 3 שעות ב 56 ° C 11.
      הערה: כדי להבטיח שתחנת החסימה מוכנה עם השעווה המותכת, פעולת כלי בכמה שעות לפני התחילה אולהשתמש בפונקציית טיימר לבחירת זמן ההתחלה למידע.
      הערה: במידת הרקמה לא יכולה להיות מעובד מייד לאחר מכן, פעמי דגירה כבר שעוות פרפין ב 56 מעלות צלזיוס אפשרית במקום hr 3 ב 56 מעלות צלזיוס. עיין במדריך למשתמש של המכשיר. בדרך כלל, הקלטות עם רקמות תישארנה אוטומטית שעווה מותכת עד הפקודה "גבה ריק" מאושרת. אם השעווה לא נמס כאשר מתחילים את מעבד רקמות, המענה מתמלא 70% אתנול ו התוכנית נשאר בהמתנה עד מוכן להתחיל.
    7. רוקן את הגבה ומיד להעביר את דגימות אמבטיה שעוות פרפין ב 56 מעלות צלזיוס בתחנת החסימה. מסיר את המכסה מהסל ולכסות באמבטיה פרפין של תחנת החסימה עם המכסה שלה.
    8. פלומה כמו רבי מגשי איזון טריים על פני השטח של תחנת חסימת מחומם ל 56 מעלות צלזיוס כפי שיש קלטות בסל.
      הערה: סמן קבע עמיד אתנול יכול להיות שימושד לתייג התחתון של מגשי איזון. סמנים קבעו עמיד אצטון אינם מומלצים.
    9. באמצעות תחנת החסימה, למלא מגש איזון פלסטיק מחומם מראש טרי עם שעוות פרפין נמסה ב 56 מעלות צלזיוס. הרם את המכסה של אמבטית פרפין, להרים קלטת אחת בלבד בכל פעם, להעביר את הדגימות מן הקלטות אל פרפין הנוזלי ב 56 מעלות צלזיוס במגש האיזון באמצעות פינצטה.
      שלב קריטי: הימנע מכל התקשות של שעווה סביב המדגם בזמן הטיפול קלטת ע"י עבודה במהירות.
      1. מקם את כל דגימות בהתאם לצרכים באמצעות מחט הכנה לפני התקשות של שעווה. בדרך כלל, כמה פרחים מסודרים מגש איזון בנפרד במרווחים על 1 ס"מ לכל כיוון.
      2. חזור על שלב 3.1.9 עד שכל הדגימות מועברות.
    10. מניח את הסל בחזרה למעבד הרקמות ולנקות את הגבה באמצעות תכנית מתאימה (עיין במדריך למשתמש).
    11. כבו מעבד רקמות ותחנת החסימה. המשך לשלב 3.1.13.
    12. במקרה לא מכונת חדירה לרקמות שום תחנת הטבעה זמינה, להשתמש בתנור חימום כדי להמס פראפין ב- C ° 56. על הספסל, למלא את השעווה נמסה מגשים איזון פלסטיק, להעביר את דגימות השעווה, ולהשתמש מחטים כנות כדי למקם את הדגימות.
    13. אפשר פראפין להקשיח בטמפרטורת החדר למשך ~ 1 - 3 שעות לפני אחסון דגימות ב 4 ° C.. דוגמאות ניתן לאחר מכן תעובדנה טריות או לאחסן עד מספר חודשים.
  2. הכנה סעיפים ומגלשות דקים LAM.
    1. על שולחן אור המאיר את גוש השעווה מלמטה, להסיר את שעוות פרפין עם הדגימות מן מגשי הפלסטיק שמסביב. לנתח את גוש שעווה בריבוע המכיל את הרקמות, למשל., ניצן או פרח, באמצעות סכין גילוח חינם RNAse. למטרה זו, תמיד לכוון את הדגימות לעבר החלק העליון של בלוק השעווה (ראה גם איור 1).
      1. כן בלוקי שעווה של כל הדגימות שאמורות לשמש LAM בכל פעם.
    2. הר בלוקים כדי לעבד הטבעת קלטות מלאות שעוות פרפין מוקשה: להמס חתיכה או טיפה קטנה של שעוות פרפין על הקצה של מרית מתאימה באמצעות מנורת אתנול ולהשתמש השעווה החמה לתקן את הבלוק על התמיכה (עם הרקמות המוטבעות לְמַעלָה).
      1. אפשר השעווה להתקשות במשך לפחות 20 דקות ב 4 ° C.
    3. הסר עודף שעווה סביב המדגם עם סכין גילוח על שולחן האור. הקפד לשמור משטח מרובע עם קצוות מקבילים (ראה איור 1).
    4. הגדר את צלחת חימום עד 42 מעלות צלזיוס.
    5. בבטחה הר דגימות אל microtome ולהכין 6 - 10 חלקים עבים מיקרומטר. עיין בהוראות היצרן עבור באמצעות microtome. הערה: בעוד חלקים מדללים לעתים קרובות ינתנו רזולוציה יותר מבחינת מבנה, כמות גדולה של RNA של higheאיכות r ניתן להשיג עם ממקטעים עבים. עבור התאים של Boechera להבשיל גמטופיט אנו משתמשים 7 מיקרומטר כברירת המחדל. העברה די לאט עם הדגימות על סכין microtome לעתים קרובות תוצאות היסטולוגיה טובה יותר.
    6. תמיד להעביר את הסרטים פרפין באורך של כ 10 - 15 ס"מ לתוך קופסת פלסטיק עם קרטון שחור בתחתית לפני מיצוב אותם שקופיות LAM.
    7. במידת האפשר, מראש לבחור את החלקים של רצועות פרפין המכיל סוגי cell- או רקמות של עניין, למשל, הביציות, תחת-היקף הניתוחים וזורקים את השאר.
  3. הכנת שקופיות עבור LAM.
    1. מניחים את הכמות הנדרשת של שקופיות במסגרת מתכת (בדרך כלל 5 - 10) עם משטח ישר על צלחת חימום.
    2. Pipet ~ 1 - 2 מיליליטר מים חינם RNAse מצד הפלסטיק של השקופית. באמצעות סכין גילוח, לחתוך את סרטי פרפין קטעים קצרים של כ 4 - 5 סנטימטר ארוך מספיק על מנת לגשר את חלונות הפלסטיק. Use פינצטה ומחט הכנה אידיאלי למקם את רצועות פרפין מקבילים זה לזה על חלונות פלסטיק של השקופיות. רם בזהירות את השקף בקצה אחד כדי להסיר את המים ומניחים את השקופיות בחזרה.
      1. לחלופין, למקם את צלחת חימום מתחת למכסה המנוע כימי. החל נפח קטן של מתנול לחלק הפלסטיק של השקופיות רק מספיק כדי להרטיב את המשטח (זה יכול לגרום קמטים קלים של השקופיות). מניחים את רצועות פרפין בשקופיות.
        הערה: מטעמי רעילות, למנוע שימוש של מתנול במידת האפשר. עם זאת, השימוש של מתנול בשלב זה עושה לשפר את איכות RNA במקרה איכות מושגת על ידי גובר על מים אינה מספיקה. כדאי בדיקת חלופות אלה בתחילתו של פרויקט חדש, כמו איכות RNA מושגת משתנה עם סוג תא ומינים תחת חקירה.
    3. לייבש את השקופיות לילה על צלחת חימום על 42 מעלות צלזיוס במשך ~ 12 שעות. מכסים את צלחת חימום עםמכסה פלסטיק כי לא נוגע שקופיות. ודא את מכסה הפלסטיק אינו מונע את חילופי האוויר. ליעד זה על המכסה ניתן להציב על תיבות pipet או דומה יוסר.
      1. לחלופין, להפחית את זמן הייבוש עד למינימום של שעות או עד הרקמה מופיעה לגמרי יבשה. צמצום הזמן שעובר חיתוך לאוסף עשוי לשפר את איכות RNA.
    4. מתחת למכסה מנוע כימי, דה-שעוות השקופיות 2 פעמים במשך 10 דקות ב Xylol באמצעות בעלי שקופיות מתאימים. הקפד להטביע את חלק פלסטיק מלא של כל שקופית, אלא כדי לאפשר הסרה של השקופית על ידי נגיעה בקצה הרחב של מסגרת מתכת כי נשמר יבש.
    5. אפשר השקופיות להתייבש במשך 10 דקות ~ מתחת למכסה המנוע כימי לפני LAM.
      הערה: שקופיות לא מעובד מיד ניתן להציב שוב על הצלחת חימום על 42 מעלות צלזיוס עם הרקמה פונה כלפי מעלה עד כמה שעות. זה ימנע כל לחות מן להתפשר על איכות RNA עד לעיבוד נוסף.

4. Microdissection בסיוע לייזר (LAM)

הערה: נוהל LAM ישתנה בהתאם המכשיר בשימוש. פרטים מסוימים של פרוטוקול זה מותאמים למכשיר מסוים ואת הטכנולוגיה של איסוף הדגימות על הִשׁתַמְשׁוּת כובע של כוחות אלקטרוסטטיים. בנוסף, פרטים עשויים להשתנות גם בין גרסאות שונות של התוכנה. עיין להוראות יצרן ספרי משתמש עבור תיאור מפורט והנחיות ספציפיות על מכשיר ותוכנה.

  1. הפעילו את ההתקנים עבור LAM (מחשב, מיקרוסקופ, תיבת הבקרה לייזר).
  2. הפעל את התוכנית הגה מיקרוסקופ לייזר.
  3. הפעילו את הלייזר על ידי לחיצה על הכפתור המתאים על תיבת הבקרה.
  4. מניחים כובע (0.5 מ"ל, ללא diffusor) לתוך מחזיק כובע ולמקם אותו המכשיר.
  5. תמיכת שקופית LAM עם זכוכית שקופית עבור במיקרוסקופ. ודא שמשטח השטוח של שקופיות עםרקמות המצורפות פונות שקופיות הזכוכית.
  6. במקום להחליק את המכשיר כאשר שקופיות זכוכית מתחת.
  7. בחר את המטרה 4X. בתכנית, בחר להעביר את הכובע לתפקיד "למעלה" או להמשיך לבצע סריקה של השקופית.
  8. חיפוש דרך השקופית ולזהות את המבנים של עניין. לאתר ולשמור עמדותיהם בשקופית להיות מסוגל לנוע בחזרה למיקום המדויק עבור שלב החיתוך.
  9. בחר את המטרה המתאימה (למשל 40X או 60X).
  10. במידת הצורך, להתאים את מהירות לייזר, להתמקד, כוח לייזר, וגם לכייל את התנועה הבמה על ידי פנייה במדריך למשתמש של המכשיר. ברגע שהחשבון מוגדר עבור רקמות ספציפיות של עניין, ניתן לעשות שימוש חוזר בהגדרות.
  11. בדוק את המיקום לייזר על ידי ירייה אחת על ידי לחיצה על "ירה לייזר" כפתור של התוכנית, באופן אידיאלי ב חלק של הממברנה ללא רקמות.
    1. במידת הצורך, לכייל את העמדה לייזר ידי ביצוע הדואר להוראות היצרן עבור המכשיר.
  12. בדוק את הכיול של המטרה על ידי הזזת מבנה ברור לכל ארבעת הפינות של חלון תוכנה על המסך, תוך שמירה על הכפתור הימני של העכבר לחוץ. בדוק כי המיקום של היד ביחס למבנה הברור הוא זהה בכל ארבע הפינות. אחרת לכייל את המטרות הבאות במדריך התוכנה.
  13. עם הכובע במצב 'למטה', השתמש בכלי 'יד-עט' כדי לסמן את הגבולות של סוג התא או רקמה של עניין, למשל, תא הביצית. לנתח את התא עניין עם הלייזר על ידי לחיצה על 'לחתוך'. הערה: לעתים קרובות, חתך יש צורך לחזור אם הגבול סביב התא לא היה גזור לגמרי בבת אחת. במקרה זה, מומלץ להגדיר את התוכנה כדי לעשות אוטומטי ולשני שידורים חוזרים של הסעיף כסטנדרט.
  14. הרם את המכסה ולעבור לתפקיד הבא הציל את המבנה של עניין. חזור על שלב 4.13של ההליך כדי לנתח את הקטעים בתא הסמוך עד שכל התאים של עניין משקופית אחת נאספים. ודא הכובע ממוצבת בצורת הקטע החדש נדבק עמדה ריקה על הכובע.
    הערה: מומלץ לבודד חתיכות גדולות של רקמות (למשל, קטעים כולו פרחים או חלקים ממנה) מן כל שקופית לאחר בידוד סעיפי תא בודדים על כובע טרי. אלה יכולים לשמש לבקרת איכות RNA.
  15. להסיר את השקופית ולהמשיך עם לשקופית הבאה על ידי חזרה על שלבים 4.4 - 4.9 ואת 4.13 כדי 4.14.
  16. חזור על שלב 4.15 צעדים בנושא עד סוגי התאים של עניין מכל השקופיות בודדו. הערה: לא מומלץ למסוק יותר מ ~ 4 - 5 שעות על אותו הכובע.
  17. ראייה לבדוק את שטח הכובע אחרי LAM להוציא זיהומים נוקבים של המדגם. בעוד הרקמות הלא גזור מוגנים עם רדיד, אבק יכול מקל על פני השטח עקב הידבקות אלקטרוסטטי.
    1. To בדוק חזותית את הכובע, להסיר את השקופית מהמכשיר. מניחים את בעל כובע במצב 'למטה' ולבדוק את השטח במטרה 4X.
    2. במקרה חתיכות קטנות של אבק גלויות, להסיר אותם עם קצה פיפטה קטן (2 μl). לחלופין, הר השקופית בחזרה על המכשיר, מניח את הכובע על חלק חופשי של השקופית (לא רקמות), ובאופן מוחלט להרוס את הזיהום באמצעות הליזר.
  18. כמוסות לסגור ולהקפיא את הסעיפים היבשים ב -80 ° C עד לשימוש נוסף. במידת הצורך, דוגמאות ניתן לאחסן עד מספר שבועות. עם זאת, ממשיך במהירות בשלב זה מומלץ.

5. בידוד RNA ובקרת איכות

הערה: RNA יכול להיות מבודד על ידי כל שיטה מתאימה כמויות קטנות של RNA. בפרוטוקול זה שימוש ערכת בידוד RNA שצוינה עבור כמויות קטנות של RNA מתואר. פעל על פי הוראות היצרן.

  1. השתמש צינורות עם המדגם מצורףהכובע במישרין או לאחר הוצאתו -80 מעלות צלזיוס.
    1. פתח את הצינורות ובזהירות pipet 11 μl של חיץ חילוץ אל הקיר של צינור אחד באמצעות טיפי סינון. שינוי עצות בין דגימות.
    2. סגור את המכסה ולנער למאגר החילוץ עד הכובע של הצינור.
    3. מניחים את הצינורות עם כובע למטה בתנור חימום שחומם מראש ל 42 מעלות צלזיוס. דגירה למשך 30 דקות בעקבות הוראות היצרן.
  2. פעל על פי הוראות היצרן להכנת טור ואיסוף התמצית בתחתית הצינורות.
    1. אם חומר מיותר מ כובע אחד צריך להיות משולב לתוך דגימה אחת, להמשיך בצעדים 5.1.1 - 5.1.2 בנפרד עבור כל שפופרת / כובע.
    2. לאחר מכן, בריכת תמציות עבור דגימה אחת בצינור אחד למדוד את כמות תמצית ונקווה עם טפטפת לפני תוספת של כמות שווה של EtOH (ראו הוראות היצרן).
    3. ודא שכמות EtOH הוסיף לפני טעינת העמודה היא שווה לנפח של התמצית תיקווה.
    4. לאחר ממטרים RNA עם EtOH, להמשיך במהירות הטעינה של העמודים הבאים הוראות היצרן. המשך הפרוטוקול עם צעד צנטריפוגה 100 XG.
    5. אחרי התוכן של כל צינור איסוף הועבר דרך העמודה, לבצע צעד צנטריפוגה XG 16,000 למשך 30 שניות כדי להסיר את הוראות יצרן זרימה דרך הבא.
    6. המשך עם מיצוי RNA וטיהור הבא הוראות היצרן.
    7. לאחר הטעינה של למאגר elution לעמודה לאפשר בעמודה כדי לדגור במשך 1 דקות. המשך לטעון את הצינורות לתוך צנטריפוגה בעקבות ההוראות להוראות היצרן. הערה: צעד צנטריפוגה נוסף עבור 1 דקות ב 100 XG לפני elution כמצוין בפרוטוקול יכול להגביר את היעילות של elution.
  3. חלץ RNA מן ההמשךrols (סעיפי רקמות גדולים) לבקרת איכות RNA ביצוע שלבי 5.1 5.2.7 של פרוטוקול זה.
  4. עבור עומס בקרת איכות RNA 1 μl רנ"א הכל חי של כל דגימה שליטה על Bioanalyzer באמצעות שבב RNA פיקו בעקבות הוראות היצרן.
    הערה: RNA החילוץ יכול לשמש הגברה ליניארית וניתוח transcriptome באמצעות מערכים או RNA-seq 7,11,13,14. באופן אידיאלי, בקרת האיכות צריכה להצביע על מספר Integrity RNA (רין) של לפחות 7. מספר הספקים לספק ערכות מתאימות הגברה, דוגמאות מתאימות ניתנות 9.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הכנת המדגם LAM נעשים צעדים עוקבים

מספר צעדים רצופים נדרשים להכין RNA לניתוח תעתיק סוגי תאים שנבחרו על ידי LAM (איור 1). זה מתחיל עם הקציר של פרחי קיבעון מיידי על מנת להבטיח כי אוכלוסיית RNA נותרת ללא שינוי לאחר קציר. הרקמה מוטבעת, מחולק, רכובה על שקופיות. זה מאפשר הבידוד של התאים על ידי LAM ואת איגום סעיפי סוג תא ס...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הפרוטוקול הוא מתאים תאים שונים וסוגי רקמות

LAM בשילוב עם transcriptome מנתח ידי microarrays או RNA-seq היא כלי רב ערך כדי לקבל תובנות לתוך דפוסים מסוימים של פעילות גנים ויסות תהליכים התפתחותיים או פיזיולוגיים 7-11,13,14. עם זאת, את התאמתו של שיטה זו עבור כל סוג תא נתון תלויה באופן מכריע בעיות מבניות. התא צריך להיות ברור לעין וקלה לזיהוי חד משמעי בסעיפים היבשים המשמשים LAM. בשנת Boe...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

אנו מודים לטימותי פ. שרבל (IPK Gatersleben) על אספקת זרעי Boechera divaricarpa ולשרון קסלר (אוניברסיטת אוקלהומה) על קריאה ביקורתית והגהה. העבודה על ניתוחי טרנסקריפטום ספציפיים לסוג התא לחקר התפתחות גמטופיטים ואפומיקס במעבדה של UG נתמכת על ידי אוניברסיטת ציריך, על ידי מלגה של "Deutsche Forschungsgemeinschaft" ופרויקט מארי קירי IDEAGENA ל-AS, על ידי מענקים מ-"Staatssekretariat für Bildung und Forschung" במסגרת COST action FA0903 (ל-UG ו-AS) והקרן הלאומית השוויצרית (ל-UG).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אתנולVWR1,009,861,000מוחלט EMPROVE Ph Eur, BP, USP
15 מ"ל צינורות צנטריפוגה בזVWR62406-200
2100 BioanalyzerAgilentG2939AA
Acetic AcidApplichemA3686,2500100% ביולוגיה מולקולרית כיתה
אמביון טכנולוגיות חיים ללא נוקלאזAM9932
ASP200 SLeica14048043624 
קרטוןבחנויות נייר מיוחדות
שקופיות מסגרת ללא DNA ו-RNAseMicro Dissect GmbH1, 4 ומיקרו; m קרום PET; ניתן לרכוש גם מ- Leica
Dumond OccipsActimed0208-5SPSF-PS
מנורת
Sigma-AldrichZ354074-1EANalgene Vaccuum Dessicator או ציוד דומה
טיפים לסינון 10  ומיקרו; lניתן להחליף את Axon Lab AGAL60010בטיפים דומים
טיפים מסננים 1,000  ומיקרו; lAxon Lab AGAL60010בטיפים דומים
טיפים מסננים 20  ומיקרו; lAxon Lab AGAL60020בטיפים דומים
טיפים מסננים 200  ומיקרו; lAxon Lab AGAL60200בקצוות דומים
מלקחיים דיוקVWE232-1221
מחזיק שקופיות זכוכיתHuber & Co.AG10.0540.01Fä rbekä sten nach Hellendahl
שוקת צביעת זכוכיתHuber & Co.AG10.0570.01Fä rbekasten
מודול הטמעת פרפין מחומם LeicaLeica Leica EG 1150H תחנת חסימה, מכשירים דומים מתאימים
שולחן חימום וייבושMedax15501דגמים ו/או ספקים אחרים מתאימים
דלי קרחVWR דלי קרח עם מכסה 10146-184דליים דומים מתאימים באותה מידה
שולחן אורUVP חברת ג'נה אנליטיתTW-26 טרנס-אור לבן
שקופית מיקרוסקופThermo Scientific10143562CEקצוות חתוכים
להב מיקרוטוםThermo ScientificFEAHS35S35 להב מיקרוטום חד פעמי
MMI Cell Cut Plus מכשירMMI (מכונות ותעשיות מולקולריות)
נון-סטיק, צינורות מיקרופוגה ללא RNAse, 2 מ"לטכנולוגיות חייםAM12475
Paraplast X-TRARothX882.2להיסטולוגיה
PicoPure RNA בידוד ערכתחיים טכנולוגיות חייםKIT0204Arcturus PicoPure RNA בידוד ערכת
איזון מגשי Semadeni AG2513
פלסטיק קופסאSemadeni AG2971Plastikdose PS
פלסטיק מכסה לחימום צלחתתוצרת בית
מחט הכנהVWR631-7159
RNA 6000 Pico KitAgilent5067-1513
צינורות מיקרופוגה ללא RNAseטכנולוגיות חייםAM12400
RNAse ZAP פתרון טיהורטכנולוגיות חייםAM9780
מיקרוטום סיבובי חצי אוטומטי LeicaRM2245מתאימים באותה מידה
קלטות מסך Tissue Loc HistoThermo ScientificC-1000_AQקלטות דומות של ספקים אחרים מתאימות
צינורות עם מכסה דבק, ללא מפזר 500 ומיקרו; l MMI (מכונות ותעשיות מולקולריות)50204
קסילול (איזומר) ROTIPURANVWR4436.2דקות 99%, p.a., ACS, ISO SP
תהליך הטמעת קלטותLeica14039440000Leica Jet Cassette I ללא מכסה
תנור אוניברסליMemmertUF55דגמים ו/או ספקים אחרים מתאימים
מעבד רקמות ניתן לרכוש שחור Exsiccator אתנול ניתן להחליף את ניתן להחליף את ניתן להחליף את פלסטיק מכשירים דומים של

מקורות

  1. Maheshwari, P. An Introduction to the Embryology of Angiosperms. , McGraw-Hill. New York. (1950).
  2. Willemse, M. T. M., Van Went, J. L. The female gametophyte. Embryology of Angiosperms. Johri, B. M. , Springer-Verlag. Berlin. 159-196 (1984).
  3. Koltunow, A. M., Bicknell, R. A., Chaudhury, A. M. Apomixis: Molecular strategies for the generation of genetically identical seeds without fertilization. Plant Physiol. 108, 1345-1352 (1995).
  4. Vielle-Calzada, J. P., Crane, C., Stelly, D. M. Apomixis - the asexual revolution. Science. 274, 1322-1323 (1996).
  5. Grossniklaus, U., Koltunow, A., van Lookeren Campagne, M. A bright future for apomixis. Trends Plant Sci. 3, 415-416 (1998).
  6. Schmidt, A., Schmid, M. W., Grossniklaus, U. Plant germline formation: molecular insights define common concepts and illustrate developmental flexibility in apomictic and sexual reproduction. Development. 142, 229-241 (2015).
  7. Schmidt, A., et al. Apomictic and sexual germline development differ with respect to cell cycle, transcriptional, hormonal and epigenetic regulation. PLOS GENET. 10, e1004476(2014).
  8. Okada, T., et al. Enlarging cells initiating apomixis in Hieractium praealtum transition to an embryo sac program prior to entering mitosis. Plant Physiol. 163, 216-231 (2013).
  9. Wuest, S. E., Grossniklaus, U. Laser-assisted microdissection applied to floral tissues. Methods Mol Biol. 1110, 329-344 (2014).
  10. Wuest, S. E., Schmid, M. W., Grossniklaus, U. Cell-specific expression profiling of rare cell types as exemplified by its impact on our understanding of female gametophyte development. Curr Opin Plant Biol. 16 (1), 41-49 (2013).
  11. Wuest, S. E., et al. Arabidopsis female gametophyte gene expression map reveals similarities between plant and animal gametes. Curr Biol. 20, 1-7 (2010).
  12. Cai, S., Lashbrook, C. C. Laser capture microdissection of plant cells from tape-transferred paraffin sections promotes recovery of structurally intact RNA for global gene profiling. Plant J. 48 (4), 628-637 (2006).
  13. Schmidt, A., Wuest, S. E., Vijverberg, K., Baroux, C., Kleen, D., Grossniklaus, U. Transcriptome analysis of the Arabidopsis megaspore mother cell uncovers the importance of RNA helicases for plant germ line development. PLOS BIOL. 9, e1001155(2011).
  14. Schmid, M. W., Schmidt, A., Klostermeier, U. C., Barann, M., Rosenstiel, P., Grossniklaus, U. A powerful method for transcriptional profiling of specific cell types in eukaryotes: laser-assisted microdissection and RNA sequencing. PLOS ONE. 7, e29685(2012).
  15. Mau, M., et al. Hybrid apomicts trapped in the ecological niches of their sexual ancestors. Proc Natl Acad Sci.U S A. 112 (18), 2357-2365 (2015).
  16. Aliyu, O. M., Seifert, M., Corral, J. M., Fuchs, J., Sharbel, T. F. Copy number variation in transcriptionally active regions of sexual and apomictic Boechera. demonstrates independently derived apomictic lineages. Plant Cell. 25 (10), 3808-3823 (2013).
  17. Corral, J. M., et al. A conserved apomixis-specific polymorphism is correlated with exclusive exonuclease expression in premeiotic ovules of apomictic boechera species. Plant Physiol. 163 (4), 1660-1672 (2013).
  18. Deeken, R., Ache, P., Kajahn, I., Klinkenberg, J., Bringmann, G., Hedrich, R. Identification of Arabidopsis thaliana. phloem RNAs provides a search criterion for phloem-based transcripts hidden in complex datasets of microarray experiments. Plant J. 55, 746-775 (2008).
  19. Schmid, M. W. Genome Scale Quantitative Biology in Arabidopsis thaliana. , University of Zürich. PhD Thesis 40-104 (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

RNABoechera

מאמרים קשורים