מאמר שיטה

ניתוח LC-MS של טסיות האדם כפלטפורמה ללימוד מטבוליזם מיטוכונדריאלי

DOI:

10.3791/53941

⸱

4 באפריל 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Cancer Pharmacology, University of Pennsylvania, 2Center for Excellence in Environmental Toxicology, University of Pennsylvania, 3Penn SRP and Department of Systems Pharmacology and Translational Therapeutics, University of Pennsylvania, 4Division of Traumatology, Department of Surgery, Critical Care and Acute Care Surgery, University of Pennsylvania, 5A.J. Drexel Autism Institute, Drexel University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מראים טסיות אדם מבודדים יכולים לשמש נגיש vivo לשעבר מודל ללמוד עיבודים מטבוליים בתגובה במתחם שאני מעכב rotenone. גישה זו מעסיקה עקיבת איזוטופי וכימות ביחס ידי ספקטרומטריית כרומטוגרפיה-מסה הנוזלית וניתן ליישם במגוון רחב של עיצובי מחקר.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מטבוליזם מיטוכונדריאלי מופרע זכה לעניין מחודש כממלא תפקיד סיבתי במגוון מחלות. בחינת שינויים במסלולים מטבוליים דורשת מודל שבו ניתן לשלוט היטב בגורמים חיצוניים, מה שמאפשר תוצאות ניתנות לשחזור ומשמעותיות. מחקרים רבים משתמשים במודלים תאיים שעברו טרנספורמציה למטרות אלה; עם זאת, תכנות מחדש מטבולי המתרחש בשורות רבות של תאים סרטניים עלול להציג משתנים מבלבלים. מסיבה זו תאים ראשוניים רצויים, אם כי השגת ביומסה מספקת למחקרים מטבוליים יכולה להיות מאתגרת. כאן אנו מראים כי טסיות דם אנושיות יכולות לשמש כפלטפורמה לביצוע מחקרים מטבוליים בשילוב עם ניתוח ספקטרומטריית מסה טנדם של כרומטוגרפיה נוזלית. גישה זו ניתנת לכימות יחסי ולתיוג איזוטופי כדי לחקור את פעילותם של מסלולים מטבוליים ספציפיים. הזמינות של טסיות דם מתורמים בודדים או מבנקי דם הופכת את מערכת המודל הזו לרלוונטית למחקרים קליניים ואפשרית להרחבה. כאן אנו משתמשים בטסיות מבודדות כדי לאשר שינויים מטבוליים מפצים שזוהו בעבר בתגובה לרוטנון מעכב I מורכב. ליתר דיוק, ירידה בגליקוליזה מלווה בעלייה בחמצון חומצות השומן כדי לשמור על רמות אצטיל-CoA. התוצאות שלנו מראות כי טסיות דם יכולות לשמש כמודל נגיש ורלוונטי מבחינה רפואית כדי לחקור את ההשפעות של קסנוביוטיקה על חילוף החומרים התאי.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מטבוליזם מתפקדת המיטוכונדריה היה מעורב במגוון רחב של מחלות ניווניות של מערכת העצבים כולל, סרטן, ומחלות לב וכלי דם 30. ככזה, במאמץ רב הושם על המאפיינים פגמים מטבוליים שתורמים בהיווצרות המחלה. כרומטוגרפיה-טנדם נוזלי ספקטרומטריית מסה (LC-MS / MS) נחשבת תקן הזהב עבור כימות של analytes מ מטריצות ביולוגיות מורכבות, והוא מועסק לעתים קרובות ללימודים מטבולית 8. עם זאת, כפי שקורה לעתים קרובות עם ללימודי ביו, השיג מודל נגיש ומוגדר היטב רלוונטי מחל אנושיות הוא אתגר.

מחקרים רבים להעסיק שינו מודלים הסלולר עבור לחקור את ההשפעה של xenobiotics או מומים גנטיים על חילוף חומרים תאיים 7,9. תכנות מחדש מטבולית המתרחש בתאי סרטן יכול להציג מבלבלים גורמי 21 ולכן הם לא אידיאליים. בעיות אלה יכולים להיות circumvented עם מודלי תא ראשוניים, למרות קבלת ביומסה מספיק עבור ניתוחים מטבולית יכולה להיות מאתגרת. יתר על כן, את ההשפעה של כמויות גבוהות של אנטיביוטיקה בשימוש בתרבות כבר מסומן כמו מחקרים המיטוכונדריה בלבול פוטנציאלי 16.

טסיות אדם להרשות לעצמו את ההזדמנות לנצל מודל תא ראשוני עם תוכן המיטוכונדריה מספיק מחקרים מטבוליים 5,22,27,32. ראשית, טסיות ניתן לרכוש בקלות, באמצעות דם שואבת מתורמים פרטיים, או בכמויות גדולות מבנקי דם, ולכן לספק מודל שבו גורמים חיצוניים ניתן לשלוט בקלות. שנית, בשל גודלם הזעיר, טסיות ניתן בקלות לבודד מרכיבים אחרים בדם עם עבודת הכנה מינימלית אפילו מינימלית 5 מצויד במעבדות. ראוי לציין, טסיות אינם מכילים גרעינים ולכן יכול לשמש כדי לחקור שינויים בחילוף החומרים באופן עצמאי הרגולציה תעתיק. כאן אנו מראים כיבנוסף כימות היחסית של acyl-אנזים (CoA) thioesters, מערכת טסיות המבודדת יכולה לשמש כדי לבחון מטבוליזם הפחמן. באופן ספציפי, אנו מדווחים על השימוש תיוג מטבולית עם איזוטופ יציב (לא רדיואקטיבי) שכותרתו [13 C 6] -glucose ו [13 C 16] -palmitate לחקור ההתאגדות של [13 C] -הוסף תווית לתוך acetyl- המטבוליט חשוב CoA דרך הגליקוליזה או חמצון חומצות שומן. זה מספק פלטפורמה חזקה, להכליל, צדדי בשל המעורבות הנרחבת של מיני acyl-CoA reductase ב הביוכימיים 13,24 ואת העקיבות של מערכת זו לבחינת משתנים אחרים, כגון עיכוב שאני מורכב עם rotenone 3,33. בנוסף המידע המופיע בפרוטוקול בהמשך, לסקירה נרחבת של האמצעים שננקטו על תיוג איזוטופ ועבור ניתוחים מבוססי LC-MS ניתן למצוא Basu ובלייר 4.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

משפט ואתיקה: כל הפרוטוקולים בנושא הטיפול דגימות האדם פעל בהתאם להנחיות של ועדת האתיקה לניסויים בבני אדם של אוניברסיטת פנסילבניה.

1. הכנת מאגרי 100x פתרונות מניות

  1. כן 1 ליטר של החיץ של הבסיס Tyrode. שלב 8.123 גרם NaCl, 1.428 גרם NaHCO 3, 0.466 גרם CaCl 2 ∙ 2 H 2 O, 0.224 גרם KCl, ו 0.095 גרם MgCl 2. התאם הנפח הכולל עד 1 ליטר עם DDH 2 O. סנן לעקר חיץ של בסיס Tyrode.
  2. הכינו פתרונות המניות 100x של גלוקוז וחומצה פלמיטית. לקבלת 100x פתרונות המניות גלוקוז, לפזר 100 גלוקוז מ"ג או [13 C 6] -glucose ב 1 מ"ל של DDH 2 O. לקבלת פתרונות palmitate 100x, לפזר 2.56 מ"ג של חומצה פלמיטית או 2.72 מ"ג של [13 C 16] חומצה -palmitic ב 1 מ"ל של אתנול. סנן לעקר 100x פתרונות המניות.
  3. כן החוצצים של המועשר Tyrode המתאים
    1. עבור מחקרים שאינם תיוג, להוסיף 1 מ"ל של 100x פתרון המניות גלוקוז 1 מ"ל של 100x פתרון פלמיטית וחומצה המניה ל -98 מ"ל של חיץ של בסיס Tyrode.
    2. עבור מחקרים תיוג גלוקוז, להוסיף 1 מ"ל של 100x [13 C 6] פתרון המניות -glucose ו 1 מ"ל של 100x פתרון פלמיטית וחומצה המניה ל -98 מ"ל של חיץ של בסיס Tyrode.
    3. עבור מחקרים תיוג חומצה פלמיטית, להוסיף 1 מ"ל של 100x פתרון המניות גלוקוז 1 מ"ל של [13 C 16] פתרון -palmitic חומצה המניה ל -98 מ"ל של חיץ של בסיס Tyrode.
  4. הכינו פתרונות עבור Rotenone טיפול
    1. הכן פתרון המניות 10 מ"מ של rotenone ב sulfoxide דימתיל (DMSO).
    2. עבור מחקרי מנת תגובה בלתי תיוג, המשך 1.4.3. עבור מחקרי תיוג במינון יחיד, המשך 1.4.5.
    3. בצע דילול סדרתי של המניה rotenone 10 מ"מ DMSO להשיג פתרונות עם ריכוזים rotenone הנעים בין 1 ננומטר עד 100 מיקרומטר. אלה הם 100x מניותים.
    4. הוסף 50 μl של כל מניה 5 מ"ל של חיץ של בסיס Tyrode + גלוקוז + חומצה פלמיטית מ 1.3.1 להכין פתרונות עם ריכוזים rotenone הנעים בין 10 בערב עד 1 מיקרומטר. לחלופין, להוסיף 50 μl של DMSO לשמש שליטה ברכב. המשך 2.1.
    5. לדלל את 1,000 פי פתרון המניות 10 מ"מ DMSO כדי להשיג פתרון עובד 10 מיקרומטר.
    6. הוסף 50 μl של המניה הזו עד 5 מ"ל כל אחד חיץ של בסיס Tyrode + [13 C 6] -glucose + חומצה פלמיטית מ 1.3.2 ובסיס חיץ + גלוקוז של Tyrode + [13 C 16] חומצה -palmitic מ 1.3.3. הריכוז הסופי הוא 100 rotenone ננומטר. לחלופין, להוסיף 50 μl של DMSO לכל חיץ לשמש פקדי הרכב.

2. בידוד טסיות

הערה: שיטה זו ניתנת טסיות נגזרה דם שלמים או משקיות טסיות. הנתונים לדוגמה הכלול במסמך שהוכןבאמצעות טסיות נגזרה שקיות טסיות. עיין Basu et al. 5 לקבלת פרטים נוספים לגבי השימוש טסיות מבודדים מהדם כולו.

  1. בידוד טסיות דם מלא מ
    הערה: אם לבודד טסיות משקית של טסיות, המשך 2.2.1.
    1. דם מלא צנטריפוגה ב 175 x ז במשך 15 דקות ללא בלמים.
    2. העברת 1 מיליליטר של הפלזמה העליונה עשירה-טסיות (PRP) שכבה לצינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר.
    3. צנטריפוגה PRP ב g 400 x למשך 5 דקות.
    4. לשאוב supernatant והמשך לשלב 3.1 או 3.2.
  2. בידוד טסיות משקית טסיות
    1. העברת 1 מ"ל של ההשעיה טסיות לצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל.
    2. צנטריפוגה ההשעיה ב 400 XG במשך 5 דקות.
    3. לשאוב supernatant והמשך לשלב 3.1. או 3.2.

3. ביצוע ניסוי

  1. כדי לקבוע את ההשפעה של xenobioticטיפול (למשל, rotenone) על רמות של מטבוליט של עניין (למשל, אצטיל-CoA reductase), המשך 3.1.1. כדי לקבוע את ההשפעה של xenobiotic (למשל., Rotenone) על התאגדות של מבשר מטבולית לתוך המטבוליט במורד הזרם של עניין, המשך 3.2.1.
    1. שימוש לא פחות משלוש ביולוגי משכפל עבור כל תנאי, resuspend גלולה טסיות משלב 2.1.4 או 2.2.3 ב 1 מ"ל של כל פתרון משלב 1.4.4.
    2. דגירת טסיות מושעות ב CO 2 באינקובטור מים במקטורן מוגדר לחות 95%, 5% CO 2 ו -37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. עבור לשלב 4.1
      הערה: כאן אנו מתארים ניסוי מנת תגובה. לחלופין, ניסוי כמובן זמן יכול להיעשות שבו המינון נקבע ואת משך הדגירה היה מגוון במקום.
  2. כדי לקבוע את ההשפעה של טיפול xenobiotic בזמן ההקמה של מבשר מטבולית לתוך המטבוליט במורד הזרם של עניין.
    1. Uלא לשיר פחות משלושה ביולוגי משכפל עבור כל תנאי, resuspend גלולה טסיות משלבת 2.1.4 או 2.2.3 ב 1ml של כל ניסוח של החיץ של שכותרתו Tyrode משלבים 1.4.6.
    2. דגירת טסיות מושעות ב CO 2 באינקובטור מים במקטורן מוגדר לחות 95%, 5% CO 2 ו -37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. עבור לשלב 4.1.

4. מרווה ו CoA הפקה

  1. גלולת טסיות על ידי צנטריפוגה ב 3000 XG במשך 3 דקות.
  2. לשאוב supernatant.
  3. טסיות Resuspend ב 750 חומצת trichloroacetic μl קרה כקרח 10% (w / v).
  4. הוספת תקן פנימי שכותרתו איזוטופ יציב המתאים. לדוגמא, אם המטרה היא להשוות את הרמות של מיני CoA ברחבי דגימות, השתמשו 100 μl של תערובת של thioesters CoA שכותרתו איזוטופ היציב מתקבל שמרים כפי שתואר לעיל (טכניקת SILEC) 29.
  5. Pulse-sonicate מדגם 30 פעמים עם 0.5 פולסים שניים.
  6. צנטריפוגה דגימות ב XG 16,000 במשך 10 דקות ב 4 °.
  7. להטביע מיצוי מוצק שלב C18 (SPE) עמודות סעפת ואקום.
  8. להתנות את העמודות עם מתנול 1 מ"ל.
  9. לאזן את העמודות עם 1 מ"ל DDH 2 O.
  10. הפעל supernatant הנגזרות המדגם (כ 850 μl במקרה זה) בכל העמודות.
  11. שטוף את העמודות עם מיליליטר מי 1.
  12. צינורות צנטריפוגה זכוכית טען 10 מ"ל לתוך סעפת ואקום לאסוף חלק elution.
  13. Elute את העמודות עם 1 מ"ל של אמוניום אצטט 25 מ"מ מתנול.
  14. eluate יבש תחת גז חנקן.
  15. Resuspend שאריות מיובשים 50 μl 5% (w / v) חומצה 5-sulfosalicylic ולהעביר לתוך צלוחיות HPLC.

5. הגדרת HPLC

  1. שימוש בתוכנת שליטה על מערכת HPLC, ליצור שיטה עם תנאים HPLC אופטימיזציה עבור analytes היעד ועמודה מנוצל, כמפורט בטבלה 1.
    הערה: העמודה לטמפרטורותיור המשמש לייצור שהנתונים אלה C 25 ° אבל הפרמטרים הספציפיים ישתנו לפי מכשיר ביחס התרכובות של עניין. כדי לכמת את acyl-CoA, מספר שיטות של ניתוח LC-MS דווחו, ומאומת עבור analytes שונה 14,19,20 תנאי LC שונים.
  2. אפשר HPLC באופן הולם לאזן.
    הערה: זה צריך לכלול הן יחול ממסים לפני הצמדת טור ו איזון של הטור על התנאים ממסים החלו על השיטה. היקף האיזון צריך מבצע את ההוראות של היצרן, וכתוצאה מכך שפכים צריכים להיות מוסחים לבזבז.
    הערה: התייעץ Basu ובלייר 5 לפרטים נוספים אודות הגדרות HPLC.

6. הגדרת ספקטרומטר מסות

  1. שימוש בתוכנת השליטה על ספקטרומטר המסה, ליצור שיטה ממוקדת עבור זיהוי של צורות מיוננות של התרכובות של עניין. פרמטרים מוצגיםבטבלה 2.
    הערה: אנלוגים איזוטופ היציבים של תרכובות אלה יש להשתמש כדי לקבוע אם מצב חיובי או שלילי נותן הרגישות ביותר וכדי לייעל את המקור ומצבו אופטיקה לגילוי שלהם. שעת זיהוי המוחלטת של שיטת ספקטרומטר מסה צריכה מתאימה מרכיב הזמן של שיטת HPLC קשורה.
    הערה: כאמור, מספר שיטות של ניתוח acyl-CoA דווחו, כולל 15 יינון שלילי 14 וחיובי מצבים ושימוש ספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוהה 17 במקום מכשיר משולש quadrupole 28.
  2. נקי לכייל את המכשיר, להקים תרסיס יציב לתוך ספקטרומטר, ולאפשר זמן פתרון הכיול להתפוגג כראוי מהמקור ואופטיקה פי הוראות היצרן.
  3. הגדרת רצף עבור כל הדגימות עם תוכנות שליטה ספקטרומטר מסה. incluדה השם או מזהה מספרי ומצביע על שיטת נפח מכשיר הזרקה המתאימה. הפעל ריק לפני הוצאת המדגם הראשון, ולהפעיל חסר ושוטף אחרים בין דגימות לפי צורך כדי להפחית השפעות שריד או מטריקס.
    הערה: שיטת עיבוד לשילוב שיא של chromatograms הנוזלי 'analytes שנבחר לעתים קרובות יכולה להיות מוגדרת בתוך רצף זה או ולהחילו בעיבוד נתונים.
  4. בגין רצף ולנטר את המערכת ספקטרומטר ו HPLC המוני מעת לעת בעיות ובין היתר, תנודות בלחץ או כשלים במערכת ואובדן עוצמת האות בזמן הריצה.
    הערה: בעיות חמורות או כשלים בטווח מתמשך עשוי לדרוש לעצור את הריצה הקאה מחדש equilibrating מערכת HPLC וכן ניקוי כיול ספקטרומטר מסה. התייעץ Basu ובלייר 5 לפרטים נוספים בנוגע לדרכי טיפול נתונים והגדרות MS.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי להדגים את התועלת של מתודולוגיה זו יש לנו לשכפל את יכולת ההכללה של הסתגלות מטבולית מפצה שתואר לעיל וכתוצאה מחשיפה rotenone. ממצא זה היה זוהה בעבר במודלי תרבית תאי חקירה זו נועדה לבדוק אם משמרת מטבולית זו מתרחשת גם טסיות, שהן anuclear ולא נוטה לאותו חפצים הניסיונות כמו תרבית תאים. עבודה זו בוצעה עם טסיות בן 6 ימים ממרכז הטראומה פן, אשר היה נחשב זקן מדי עבור עירוי אדם, למרות שהם שמרו על הפעילות המטבולית שלהם. הבידוד בוצע כפי שמוצג באיור 1....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הנה הראינו את התועלת של טסיות מבודדת כפלטפורמה ללימוד מטבוליזם במיטוכונדריה מוטרדת. באופן ספציפי, יש לנו מאופיין הסתגלות מטבולית בתגובת עיכוב שאני מורכב ידי rotenone.

המחקר הנוכחי הרחיב ממצאים שדווחו בעבר על עצם את התפקיד של עיכוב שאני מורכב ידי rotenone בשורות תאיות כדי טסיות אדם. חשוב לציין, זה חשף כי גם rotenone עכבות טסיות succinyl-CoA היווצרות, מגורה עלייה טסיות βHB-CoA ולא השפיעו על רמות הטסיות של אצטיל-CoA...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שום אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מכירים את התמיכה של מענקים NIH P30ES013508 ו T32ES019851.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>ריאגנט
נתרן כלורי (NaCl)סיגמא-אולדריץ'746398
נתרן ביקרבונט (NaHCO<תת>3)סיגמא-אולדריץ'S5761
סידן כלוריד דיהידראט (CaCl<תת>2 * H<תת>2O)סיגמא-אולדריץ'223506
אשלגן כלורי (KCl)Sigma-AldrichP9541
מגנזיום כלוריד (MgCl2)Sigma-Aldrich208337
גלוקוזסיגמא-אולדריץ'G8270
13C6-Globalסיגמא-אולדריץ'389374
חומצה פלמיטיתקיימן10006627
13C16-Palmitic AcidSigma-Aldrich605573
RotenoneSigma-AldrichR8875
Trichloro Acetic AcidSigma-AldrichT6399
5-Sulfosalicylic AcidSigma-Aldrich390275
AcetonitirleFischer ScientificA996-4(optima)
מים (H2O)פישר סיינטיפיקW7-4(אופטימה)
חומצה פורמיתפישר סיינטיפיק85171אופטימה)
דימתיל סולפוקסידסיגמא-אולדריץ'472301
אתנולפישר סיינטיפיק04-355-222
מתנולפישר סיינטיפיקA454-4(אופטימה)
אמוניום אצטטפישר סיינטיפיקA639-500
2 מ"ל צינורות אפנדורףBioExpressC-3229-1
בקבוקוני LC (פלסטיק)מים186002640
10 מ"ל צינורות צנטריפוגה מזכוכיתKimble Chase73785-10
Oasis Solid Phase Extraxtion (SPE) עמודיםWatersWAT094225
Pastuer Pipetsפישר סיינטיפיק13-678-200
שםCompanyCatalog NumberComments
>Equipment
CO2 חממה עם מעטפת מיםNuaireAutoFlow NU-8500
ספקטרומטר מסה משולש קוואדרופולהתרמו מדעיFinnigan TSQ קוונטי
HPLCתרמו מדעיDionex Ultimate 3000
מקורתרמו מדעיHESI II
HPLC עמודהPhenomenexLuna C183 μ M גודל חלקיקים, 200 מ"מ x 2 מ"מ
(

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ault, K. A. The clinical utility of flow cytometry in the study of platelets. Semin. Hematol. 38 (2), 160-168 (2001).
  2. Avila, C., et al. Platelet mitochondrial dysfunction is evident in type 2 diabetes in association with modifications of mitochondrial anti-oxidant stress proteins. Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes. 120 (4), 248-251 (2012).
  3. Basu, S. S., Blair, I. A. Rotenone-mediated changes in intracellular coenzyme A thioester levels: implications for mitochondrial dysfunction. Chem. Res. Toxicol. 24 (10), 1630-1632 (2011).
  4. Basu, S. S., Blair, I. A. SILEC: a protocol for generating and using isotopically labeled coenzyme A mass spectrometry standards. Nat. Protoc. 7 (1), 1-12 (2012).
  5. Basu, S. S., Deutsch, E. C., Schmaier, A. A., Lynch, D. R., Blair, I. A. Human platelets as a platform to monitor metabolic biomarkers using stable isotopes and LC-MS. Bioanalysis. 5 (24), 3009-3021 (2013).
  6. Berson, A., et al. Mechanisms for experimental buprenorphine hepatotoxicity: major role of mitochondrial dysfunction versus metabolic activation. J. Hepatol. 34 (2), 261-269 (2001).
  7. Castell, J. V., Jover, R., Martinez-Jimenez, C. P., Gomez-Lechon, M. J. Hepatocyte cell lines: their use, scope and limitations in drug metabolism studies. Expert. Opin. Drug Metab Toxicol. 2 (2), 183-212 (2006).
  8. Ciccimaro, E., Blair, I. A. Stable-isotope dilution LC-MS for quantitative biomarker analysis. Bioanalysis. 2 (2), 311-341 (2010).
  9. Dang, C. V. Links between metabolism and cancer. Genes Dev. 26 (9), 877-890 (2012).
  10. Darnell, M., Weidolf, L. Metabolism of xenobiotic carboxylic acids: focus on coenzyme A conjugation, reactivity, and interference with lipid metabolism. Chem. Res. Toxicol. 26 (8), 1139-1155 (2013).
  11. Des Rosiers, C., Fernandez, C. A., David, F., Brunengraber, H. Reversibility of the mitochondrial isocitrate dehydrogenase reaction in the perfused rat liver. Evidence from isotopomer analysis of citric acid cycle intermediates. J. Biol. Chem. 269 (44), 27179-27182 (1994).
  12. Ellis, J. K., et al. Metabolic profiling detects early effects of environmental and lifestyle exposure to cadmium in a human population. BMC. Med. 10, 61(2012).
  13. Grevengoed, T. J., Klett, E. L., Coleman, R. A. Acyl-CoA metabolism and partitioning. Annu. Rev. Nutr. 34, 1-30 (2014).
  14. Haynes, C. A., et al. Quantitation of fatty acyl-coenzyme As in mammalian cells by liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry. J. Lipid Res. 49 (5), 1113-1125 (2008).
  15. Ikegawa, S., et al. Characterization of cholyl-adenylate in rat liver microsomes by liquid chromatography/electrospray ionization-mass spectrometry. Anal. Biochem. 266 (1), 125-132 (1999).
  16. Kalghatgi, S., et al. Bactericidal antibiotics induce mitochondrial dysfunction and oxidative damage in Mammalian cells. Sci. Transl. Med. 5 (192), 192ra85(2013).
  17. Liu, X., et al. High-Resolution Metabolomics with Acyl-CoA Profiling Reveals Widespread Remodeling in Response to Diet. Mol. Cell Proteomics. 14 (6), 1489-1500 (2015).
  18. Lopez-Gallardo, E., Iceta, R., Iglesias, E., Montoya, J., Ruiz-Pesini, E. OXPHOS toxicogenomics and Parkinson's disease. Mutat. Res. 728 (3), 98-106 (2011).
  19. Magnes, C., Sinner, F. M., Regittnig, W., Pieber, T. R. LC/MS/MS method for quantitative determination of long-chain fatty acyl-CoAs. Anal. Chem. 77 (9), 2889-2894 (2005).
  20. Mauriala, T., Herzig, K. H., Heinonen, M., Idziak, J., Auriola, S. Determination of long-chain fatty acid acyl-coenzyme A compounds using liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 808 (2), 263-268 (2004).
  21. Murphy, T. A., Dang, C. V., Young, J. D. Isotopically nonstationary 13C flux analysis of Myc-induced metabolic reprogramming in B-cells. Metab Eng. 15, 206-217 (2013).
  22. Paglia, G., et al. Metabolomic analysis of platelets during storage: a comparison between apheresis- and buffy coat-derived platelet concentrates. Transfusion. 55 (2), 301-313 (2015).
  23. Patti, G. J. Separation strategies for untargeted metabolomics. J. Sep. Sci. 34 (24), 3460-3469 (2011).
  24. Robishaw, J. D., Neely, J. R. Coenzyme A metabolism. Am. J. Physiol. 248 (1 Pt 1), E1-E9 (1985).
  25. Rodgers, G. M. Overview of platelet physiology and laboratory evaluation of platelet function. Clin. Obstet. Gynecol. 42 (2), 349-359 (1999).
  26. Salles, I., et al. Development of a high-throughput ELISA assay for platelet function testing using platelet-rich plasma or whole blood. Thromb. Haemost. 104 (2), 392-401 (2010).
  27. Snyder, N. W., Basu, S. S., Worth, A. J., Mesaros, C., Blair, I. A. Metabolism of propionic acid to a novel acyl-coenzyme A thioester by mammalian cell lines and platelets. J. Lipid Res. 56 (1), 142-150 (2015).
  28. Snyder, N. W., Basu, S. S., Zhou, Z., Worth, A. J., Blair, I. A. Stable isotope dilution liquid chromatography/mass spectrometry analysis of cellular and tissue medium- and long-chain acyl-coenzyme A thioesters. Rapid Commun. Mass Spectrom. 28 (16), 1840-1848 (2014).
  29. Snyder, N. W., et al. Production of stable isotope-labeled acyl-coenzyme A thioesters by yeast stable isotope labeling by essential nutrients in cell culture. Anal. Biochem. 474, 59-65 (2015).
  30. Wallace, D. C. Mitochondrial diseases in man and mouse. Science. 283 (5407), 1482-1488 (1999).
  31. Wojtovich, A. P., Brookes, P. S. The complex II inhibitor atpenin A5 protects against cardiac ischemia-reperfusion injury via activation of mitochondrial KATP channels. Basic Res. Cardiol. 104 (2), 121-129 (2009).
  32. Worth, A. J., et al. Stable isotopes and LC-MS for monitoring metabolic disturbances in Friedreich's ataxia platelets. Bioanalysis. 7 (15), 1843-1855 (2015).
  33. Worth, A. J., Basu, S. S., Snyder, N. W., Mesaros, C., Blair, I. A. Inhibition of neuronal cell mitochondrial complex I with rotenone increases lipid beta-oxidation, supporting acetyl-coenzyme A levels. J. Biol. Chem. 289 (39), 26895-26903 (2014).
  34. Zhou, L., Schmaier, A. H. Platelet aggregation testing in platelet-rich plasma: description of procedures with the aim to develop standards in the field. Am. J. Clin. Pathol. 123 (2), 172-183 (2005).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Acetyl CoAI

מאמרים קשורים