מאמר שיטה

Cycloheximide ניתוח צ'ייס של פירוק חלבונים ב

29.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/53975

⸱

18 באפריל 2016

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Ball State University, 2Bioproduct Research & Development, Eli Lilly and Company

במאמר זה

סיכום

שפע החלבונים משקף את שיעורי סינתזת החלבון ופירוק החלבון. מאמר זה מתאר את השימוש במרדף ציקלוהקסימיד ואחריו הכתמה מערבית כדי לנתח פירוק חלבון במודל האיקריוט החד-תאי, Saccharomyces cerevisiae (שמרים ניצנים).

תקציר

הסדרת שפע חלבון חיונית כמעט בכל תהליך הסלולר. שפע חלבון משקף את השילוב של שיעורי סינתזת חלבון פירוק חלבונים. מבחני רבים מדווחים על שפע חלבון (למשל, סופג מערבי נקודה חד פעמי, cytometry זרימה, מיקרוסקופ פלואורסצנטי, או מבחני כתב מבוסס צמיחה) אינו מאפשרים אפליה של ההשפעות היחסיות של תרגום proteolysis על רמות חלבון. מאמר זה מתאר את השימוש של מרדף cycloheximide ואחריו מערבי סופג כדי לנתח את החלבון שפל במפורש eukaryote unicellular המודל, שמר אפייה (שמרים ניצנים). בהליך זה, תאי שמרים מודגרת בנוכחות cycloheximide מעכב translational. Aliquots של התאים נאספים מיד לאחר ובנקודות זמן מסוים לאחר תוספת של cycloheximide. תאים lysed, ואת lysates מופרדים על ידי אלקטרופורזה polyacrylamide ג'ל FOr ניתוח כתם המערבי של שפע חלבון בכל נקודת זמן. הליך מרדף cycloheximide היתרים להדמיה של קינטיקה השפלה של אוכלוסיית המצב היציבה של מגוון של חלבונים תאיים. ההליך ניתן להשתמש כדי לחקור את הדרישות גנטיות והשפעות סביבתיות על פירוק חלבונים.

מבוא

חלבונים לבצע פעולות מכריעות כמעט בכל תהליך הסלולר. תהליכים פיזיולוגיים רבים דורשים נוכחות של חלבון מסוים (או חלבונים) לתקופה מוגדרת של זמן או בנסיבות מיוחדות. אורגניזמים ולכן לפקח ולהסדיר שפע חלבון כדי לענות על צרכים הסלולר 1. לדוגמא, cyclins (חלבונים השולטים חלוקת תא) נוכח בשלבים מסוימים של מחזור התא, ואת אובדן רמות cyclin המוסדרים נקשר עם היווצרות גידולים ממאירים 2. בנוסף ויסות רמות חלבון כדי לענות על צרכים הסלולר, תאים במנגנוני בקרת איכות degradative לחסל misfolded, מוכנות להרכבה, או סוטות אחרת מולקולות חלבון 3. פיקוח על שפע חלבון כרוך הסדרה הן סינתזת macromolecular (שעתוק ותרגום) ושפלה (ריקבון רנ"א proteolysis). פירוק חלבונים פגומים או מוגזם תורם פתולוגיות מרובים, כולל סרטן, סיסטיק פיברוזיס, תנאים ניווניות, והפרעות קרדיו 4-8. מנגנוני פרוטאוליטים ולכן הם בגדר מטרות טיפוליות מבטיחים עבור מגוון של מחל 9-12.

ניתוח של חלבונים בנקודת זמן אחת (למשל, על ידי כתם המערבי 13, cytometry זרימה 14, או פלואורסצנטי מיקרוסקופיה 15) מספק תמונת מצב של שפע חלבון מצב יציב מבלי לחשוף את התרומה היחסית של סינתזה או השפלה. בדומה לכך, מבחני כתב מבוסס צמיחה לשקף את רמות חלבון מצב יציבות על פני תקופת זמן ממושכת בלי להיפלות בין ההשפעות של סינתזת שפלה 15-20. אפשר להסיק את התרומה של תהליכי degradative לרמות חלבון מצב יציב על ידי השוואת שפע לפני ואחרי עיכוב רכיבים ספציפיים של מנגנון degradative (למשל, על ידי פרמקולוגית inactivating והגנה של המחזורasome 21 או לדפוק את גן שיערו להידרש השפלה 13). לשינוי ברמת חלבון מצב יציב לאחר עיכוב מסלולים degradative מספק ראיות חזקות תרומת proteolysis לשליטת שפע חלבון 13. עם זאת, כגון ניתוח עדיין אינו מספק מידע לגבי קינטיקה של מחזור חלבון. מרדף cycloheximide ואחריו מערבי סופג מתגבר חולשות אלה בכך שהוא מאפשר לחוקרים לחזות פירוק חלבונים לאורך זמן 22-24. יתר על כן, כי גילוי חלבונים לאחר מרדף cycloheximide מבוצע בדרך כלל על ידי מערבי סופג, איזוטופים רדיואקטיביים וצעדי immunoprecipitation ממושכים אינם נדרש עבור מרדף cycloheximide, בניגוד טכניקות מרדף דופק רבות נפוצות, אשר מבוצעות גם לדמיין חלבון שפל 25.

Cycloheximide זוהה לראשונה כמתחם עם אנטי פטרייתי נאהקשרים המיוצר על ידי Streptomyces חיידק חיובי גרם griseus 26,27. זוהי מולקולה התא חדיר המעכבת cytosolic איקריוטיים במיוחד (אבל לא organellar) תרגום על ידי פגיעה ריבוזומלי טרנסלוקציה 28-31. בניסוי מרדף cycloheximide, cycloheximide מתווסף תאים, aliquots של התאים נאספים מיד ובנקודות זמן מסוים לאחר תוספת של תרכובת 22. תאים lysed, ושפע חלבון בכל נקודת זמן מנותח, בדרך כלל על ידי כתם המערבי. ירידות שפע חלבונים לאחר תוספת של cycloheximide ניתן לייחס בבטחה פירוק חלבונים. חלבון יציב יקטן בשפע לאורך זמן, בעוד חלבון יציב יחסית יפגין שינוי קטן בשפע.

מנגנוני פירוק חלבונים סלקטיבית כבר שמורים ביותר ברחבי Eukarya. הרבה ממה שידוע על פירוק חלבונים נודע ראשוןeukaryote unicellular המודל, cerevisiae Saccharomyces (שמרים ניצנים) 25,32-36. מחקרים עם שמרים צפויים להמשיך ולספק תובנה רומן וחשובות לתוך פירוק חלבונים. שיטת מרדף cycloheximide בתאי שמרים ואחריו ניתוח כתם המערבי של שפע חלבון מוצגת כאן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

צמיחה 1. קציר של תאים שמרים

  1. אם לא בניתוח קינטיקה השפלה של חלבון שמרים אנדוגני, להפוך זן שמרים הרצוי (ים) עם פלסמיד המקודד את החלבון של עניין. שיטות אמינות לטרנספורמציה שמרים תוארו בעבר 37.
  2. לחסן שמרים ב 5 מ"ל של המדיום המתאים (למשל, מוגדר סינתטי סלקטיבית (SD) בינוני עבור תחזוקה פלסמיד של התאים שהשתנו או שמרים הלא סלקטיבי לחלץ דקסטרוז-peptone (YPD) בינוני עבור תאים שאינם טרנספורמציה). דגירה לילה בשעה 30 ° C, מסתובבת.
    הערה: 30 ° C היא הטמפרטורה לצמיחה אופטימלית עבור זני שמרים מעבדה wild-type טיפוסי 38. עם זאת, בגלל זני שמרי מוטציה כמה לא גדלים בצורה אופטימלית על 30 מעלות צלזיוס וכמה חלבונים עוברים שפלת טמפרטורה תלויה, הטמפרטורות המשמשות צמיחת שמרי תא ולרדוף cycloheximide צריכות להיקבע באופן אמפירי 39.
  3. מדוד הצפיפות הדואר אופטית ב 600 ננומטר (OD 600) של כל תרבות לילה.
    הערה: תאים עשויים להיות בשלב הצמיחה לוגריתמי או נייח אבל צריך מינימלית הגיעו צפיפות שיאפשר דילול ל OD 600 = 0.2 ב 15 מ"ל של מדיום חדש.
  4. לדלל את התרבויות לילה ערך OD 600 של 0.2 ב 15 מ"ל של מדיום חדש.
  5. דגירה שמרים ב 30 מעלות צלזיוס, רועד עד התאים מגיעים לשלב צמיחת אמצע לוגריתמים (כלומר, OD 600 בין 0.8 ו -1.2).
  6. במהלך גדילת תאים שמרים, לבצע את הפעולות הבאות כהכנת הליך מרדף cycloheximide:
    1. הגדר גוש חום שיכול להכיל 15 מ"ל צינורות חרוטי 30 מעלות צלזיוס במשך הדגירה של תאים בנוכחות cycloheximide. מוסיפים מים עד הבארות של גוש חום לאפשר פיזור חום יעיל לתרבויות. מוסיפים מים היטב כל כך צינור חרוטי 15 מ"ל תגרום מפלס המים לעלות, אבל לא עולה על גדותיו, שפת הבאר.
    2. גדר גוש חום שני שיכול להכיל 1.5 מיליליטר צינורות microcentrifuge עד 95 מעלות צלזיוס במשך denaturation חלבונים לאחר תמוגה תא.
    3. מדיום גידול טרי טרום חם (1.1 מיליליטר לכל נקודת זמן לכל תרבות להיות assayed) עד 30 מעלות צלזיוס.
    4. הוסף 50 μl 20x עצור מיקס מראש שכותרתו צינורות microcentrifuge (פעם אחת צינור לכל נקודה לכל תרבות להיות assayed). מניחים צינורות על הקרח.
      זהירות: אזיד הנתרן, מרכיב 20x עצור מיקס, הוא רעיל באמצעות בליעה דרך הפה או מגע עורי. פעל על פי המלצות של יצרן בעת ​​הכנה, אחסון והטיפול יזיד הנתרן. במקרה של חשיפה מקרית, להתייעץ גיליון נתוני בטיחות חומרים הניתנים על ידי היצרן.
  7. כאשר תאים הגיעו צמיחת אמצע לוגריתמים, לאסוף 2.5 OD 600 יחידות של כל תרבות לכל נקודת זמן להיות assayed (למשל, 7.5 OD 600 יחידות לנתח שפע חלבון בשלוש נקודות זמן). צנטריפוגה שנאספו התאים צינורות חרוטי 15 מ"ל ב 3,000 XG בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות.
    הערה: קישור אחד OD 600 היחידה היא שווה לסכום של שמרים נוכח 1 תרבות מ"ל ב OD של 600 1.0. היקף התרבות (ב מיליליטר) נדרשה למסוק יחידות X OD 600 (V) יכול להיקבע באמצעות המשוואה הבאה: V = X OD 600 יחידות / נמדדת OD 600. לדוגמה, כדי לקצור 7.5 OD 600 יחידות של תרבית תאים שמרים OD של 600 1.0, לאסוף 7.5 OD 600 יחידות / 1.0 = 7.5 מ"ל תרבית שמרים.
  8. Resuspend כל גלולה תא 1 מ"ל של 30 ° C (מחומם מראש) מדיום הגידול טריים לכל 2.5 OD 600 יחידות של תאים (למשל, 3 מ"ל תמורת 7.5 OD 600 יחידות).

2. cycloheximide צ'ייס

  1. לאזן השעיות תא שמרים ידי דגירה במשך 5 דקות בתוך הגוש החום 30 מעלות צלזיוס.
  2. כן טיימר לספור למעלה מ 00:00.
  3. כדי להתחיל את מרדף cycloheximide, לחץ על "התחל" על טיימר. מַהֵר,אבל בזהירות, בצע את הפעולות הבאות:
    1. להוסיף cycloheximide לריכוז סופי של 250 מיקרוגרם / מ"ל ההשעיה תא שמרים הראשונה (למשל, להוסיף 37.5 μl של 20 מ"ג / מ"ל המניות cycloheximide עד 3 מ"ל של תרחיף תאים), מערבולת בקצרה לערבב.
      זהירות: cycloheximide הוא מגרה עורי והוא רעיל באמצעות בליעה דרך הפה. פעל על פי המלצות של יצרן בעת ​​הכנה, אחסון וטיפול cycloheximide. במקרה של חשיפה מקרית, להתייעץ גיליון נתוני בטיחות חומרים הניתנים על ידי היצרן.
    2. מיד לאחר הוספת cycloheximide ו vortexing, להעביר 950 μl (~ 2.4 OD 600 יחידות) של ההשעיה תא שמרים עם הוסיף cycloheximide לצינור microcentrifuge מראש שכותרתו המכיל 50 תמהיל μl קר כקרח 20x להפסיק. וורטקס צינור microcentrifuge, ומניח על קרח עד שכל הדגימות נאספו.
    3. החזר את ההשעיה תא שמרים עד 30 מעלות צלזיוס.
  4. חזור על שלבים 2.3.1 דרך 2.3.3 עבור כל אחד השעיות תא שמרים הנותרים במרווחי זמן קבועים (למשל, כל 30 שניות, כך cycloheximide מתווסף לדוגמא # 1 0:00, לדוגמא # 2 ב- 00:30, לדוגמא # 3 בשעה 1:00 , וכו '.).
  5. בכל נקודת זמן לאחר מכן, השעיות תא מערבולת שמרים העברת 950 μl לצינורות microcentrifuge שכותרתו המכיל 50 μl מראש צונן 20x עצור מיקס. וורטקס ותאי שנאספו ומניחים על קרח. חזור 15 מ"ל צינורות חרוטי 30 ° C בבלוק חום.
    1. לדוגמה, עבור אוסף של תאים 30 דקות לאחר תוספת cycloheximide (בהנחה של 30 שניות במרווחים בין בנוסף cycloheximide כדי השעיות תא שמרים בתחילת הקורס הזמן), מערבולת ולהסיר 950 μl של ההשעיה תא ממדגם # 1 ב- 30:00 . חזור על הפעולה עבור לדוגמא # 2 ב- 30:30, וכן הלאה.
      הערה: כדי למנוע התיישבות של שמרים, השעיות תא מערבולת ב 15 מ"ל צינורות חרוטי בערך כל 5 דקות במהלך הקורס של המרדף. לחלופין, השעית תא שמריםהים עשוי להישמר באמבט מי התססה ברציפות למשך ניסוי מרדף cycloheximide.
  6. כאשר כל הדגימות נאספו, גלולה שנאספו התאים על ידי צנטריפוגה ב 6,500 XG בטמפרטורת החדר למשך 30 שניות. הסר את supernatant ידי pipetting או שאיפה. תאים מוכנים כעת תמוגה אלקליין. לחלופין, הצמד להקפיא תאים pelleted בחנקן נוזלי חנות ב -80 ° C.

3. הפקת חלבון פוסט אלקליין (השתנה מ 16,40)

  1. הוספת 100 μl של מים מזוקקים לכל תא גלול. Resuspend ידי pipetting למעלה ולמטה או vortexing.
  2. הוספת 100 μl של 0.2 M NaOH מדגם זה. מערבבים על ידי pipetting למעלה ולמטה או vortexing.
  3. דגירה תאים מושעה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. בשלב זה, תאי שמרים שלא היה lysed, וחלבונים לא שוחררו 40.
  4. תאים גלולים ידי צנטריפוגה ב 18,000 XG ב מזג בחדרature למשך 30 שניות. הסר supernatant ידי pipetting או שאיפה.
  5. כדי lyse תאים, להוסיף 100 μl של חיץ מדגם Laemmli לכל תא גלול. Resuspend ידי pipetting למעלה ולמטה או vortexing.
    הערה: הדגירה סדרתית של תאים עם חלבונים משחרר חיץ מדגם NaOH ו Laemmli בצורה תואמת ג'ל אלקטרופורזה סולפט-polyacrylamide dodecyl נתרן (SDS-PAGE) באמצעות מערכת חיץ ריצה טריס-גליצין.
  6. לדגור על 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כדי לפגל חלבונים באופן מלא.
    הערה: דגירה על 95 מעלות צלזיוס לא יכולה להיות מתאימה ניתוח של חלבונים כי הם מועדים צבירה (למשל, חלבונים עם כמה קטעים הטרנסממברני). חלבונים אלה עשויים להיות מסיסים כאשר מודגרות בטמפרטורות גבוהות 41. לכן, לצורך ניתוח של חלבונים כאלה, lysates צריך להיות מודגרות בטמפרטורות נמוכות (למשל, 37 ° C - 70 ° C) במשך 10 - 30 דקות, כפי שנקבע באופן אמפירי.
  7. lysates צנטריפוגה ב 18,000 XG ב roטמפרטורת om דקות 1 עד גלולת חומר מסיס. Supernatant (חלבון חילוץ solubilized) מוכן להפרדה על ידי SDS-PAGE וניתוח כתם המערבי לאחר מכן. לחלופין, lysates ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס.

4. נציג SDS-PAGE ונוהל המערבי סופג (מעובד מתוך 16)

  1. חלבון טען סטנדרטים משקל מולקולרי ונפח לקבוע באופן אמפירי של lysates על ג'ל SDS-PAGE.
    הערה: בחר את אחוז acrylamide ו bis-acrylamide ב ג'ל SDS-PAGE לפי המשקל המולקולרי של החלבון של עניין. באופן כללי, ג'לים שיעור נמוך מתאימים יותר לפתרון חלבונים בעלי משקל מולקולרי גבוה.
  2. ג'ל לרוץ 200 V עד בחזית לצבוע הגיע לקצה התחתון של ג'ל.
  3. עבר חלבונים מן ג'ל פלואוריד polyvinylidene (PVDF) קרום בהעברה רטובה ב 20 V 60 - 90 דק 'ב 4 ° C..
  4. חסום הממברנה על ידי דוגרי טריס-בופר (TBS) המכיל 5% חלב רזה, נדנדה, בטמפרטורת החדר למשך שעה 1 או 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    הערה: כדי למנוע התפתחותם של חיידקים בנוכחות קרום מודגרות לילה, מומלץ לכלול אזיד הנתרן הפתרון חוסם בריכוז סופי של 0.02%.
  5. דגירה הממברנה עם נוגדן ראשוני ספציפי לחלבון של עניין TBS עם 0.1% Tween-20 (TBS / T) וחלב 1% דל שומן, נדנדה, בטמפרטורת החדר למשך שעה 1.
  6. לשטוף קרום בטמפרטורת החדר 3 x 5 דקות עם TBS / T, נדנדה.
  7. דגירה הממברנה עם נוגדן משני fluorophore מצומדות מתאים TBS / T עם חלב דל שומן 1% בטמפרטורת חדר למשך שעה 1, נדנדה.
    הערה: fluorophores הוא רגיש לאור. לכן, דילולים של נוגדנים מצומדות כדי fluorophores צריך להיות מוכן בחושך, ו הדגירה של ממברנות בנוכחות נוגדנים מצומדות כדי fluorophores וצעדים לשטוף לאחר מכן אמור להתרחש ב lightproof (למשל, עטופה בנייר כסף) במשותףntainers.
  8. לשטוף קרום בטמפרטורת החדר 3 x 5 דקות עם TBS / T, נדנדה.
  9. קרום תמונה באמצעות LI-COR אודיסיאה CLX ותוכנה סטודיו תמונה (או ציוד הדמיה להשוות ותוכנה), בעקבות המלצות היצרן.
  10. לאחר רכישת התמונה קרום, דגירה הממברנה עם נוגדן ראשוני ספציפי עבור חלבון טעינה מלאה ב TBS / T עם 1% חלב דל שומן בטמפרטורת החדר למשך שעה 1, נדנדה.
  11. לשטוף קרום בטמפרטורת החדר 3 x 5 דקות עם TBS / T, נדנדה.
  12. דגירה הממברנה עם נוגדן משני fluorophore מצומדות מתאים TBS / T עם חלב דל שומן 1% בטמפרטורת חדר למשך שעה 1, נדנדה.
  13. לשטוף קרום בטמפרטורת החדר 3 x 5 דקות עם TBS / T, נדנדה.
  14. קרום תמונה כמו בשלב 4.9.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כדי להמחיש מתודולוגיה מרדף cycloheximide, יציבות Deg1 -Sec62 (איור 1), reticulum endoplasmic שמרים מודל (ER) השפלה -associated (ERAD) המצע, נותח 42-44. בשנת ERAD, אנזימי אנזים היוביקוויטין בקרה איכות לצרף קוולנטית שרשרות של היוביקוויטין החלבון הקטן לחלבונים סוטים המקומיים על קרום ER. חלבונים polyubiquitylated כזה ובהמשך יוסרו מן ER ו מושפל על ידי הפרוטאזום, פרוטאז גדול, cytosolic 45. חלבון Deg1

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

במאמר זה, שיטה לניתוח קינטיקה פירוק חלבונים מוצגת. טכניקה זו יכולה בקלות להיות מיושמת מגוון של חלבונים מושפלים על ידי מגוון של מנגנונים. חשוב לציין כי ניסויי cycloheximide מרדף לדווח על קינטיקה השפלה של ברכת המצב היציבה של חלבון נתון. טכניקות אחרות ניתן להשתמש כדי לנתח את קינטיקה השפלה של אוכלוסיות ספציפיות של חלבונים. לדוגמא, גורל degradative של פוליפפטידים המתהווה יכול להיות מועבר על ידי ניתוח מרדף דופק 55. בניסויים כאלה, חלבונים המתהווה הם הדופק שכותרתו בקצרה (למ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

המחברים מודים לחברים בהווה ובעבר במעבדת רובינשטיין על שסיפקו סביבת מחקר תומכת ונלהבת. המחברים מודים למארק הוכסטרסר (אוניברסיטת ייל) על שיתוף ריאגנטים ומומחיות. E.M.R. מודה לסטפן קרפט (אוניברסיטת קונסטנץ) ולג'ניפר ברונס (אוניברסיטת פיטסבורג) על שיתוף מומחיות שלא תסולא בפז בניתוח קינטי של חלבונים. עבודה זו נתמכה על ידי מענק של המכונים הלאומיים לבריאות (R15 GM111713) ל-E.M.R., פרס מחקר ASPiRE של אוניברסיטת בול סטייט ל-E.M.R, פרס מחקר מסניף אוניברסיטת בול סטייט של סיגמא שי ל-S.M.E., וכספים ממשרד ראש אוניברסיטת בול סטייט והמחלקה לביולוגיה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
זני שמרים רצויים, פלסמידים, מדיום סטנדרטי ורכיבי
צינורות זכוכית בורוסיליקט חד פעמייםFisher Scientific14-961-32זמין ממגוון יצרנים
חממה מווסתת טמפרטורה (למשל חממת Heratherm דגם IMH180)Dot Scientific51028068זמין ממגוון יצרנים
תוף להחלפה של ניו ברונסוויק לצינורות 18 מ"מ (רולר צינור)ניו ברונסוויקM1053-0450רולר צינור מומלץ לשמירה על תרביות התחלה של תאי שמרים בתרחיף. לחלופין, אם רולר צינור אינו זמין, ניתן להשתמש בשייקר פלטפורמה בחממה מבוקרת טמפרטורה לתרביות התחלה ללילה. ניתן להשתמש בשייקר פלטפורמה או רולר צינור כדי לשמור על תרביות גדולות יותר בהשעיה.
ניו ברונסוויק TC-7 רולר תוף 120 V 50/60 Hניו ברונסוויקM1053-4004לשימוש עם רולר צינור
SmartSpec Plus ספקטרופוטומטרBio-Rad170-2525זמין ממגוון יצרנים
צנטריפוגה 5430Eppendorf5427 000.216 רוטור שנמכר עם יחידה מכיל צינורות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 ו -2.0 מ"ל. ניתן להחליף את הרוטור לאחד המכיל צינורות חרוטיים של 15 ו-50 מ"ל
רוטור זווית קבועה F-35-6-30 עם מכסה ומתאמים לצנטריפוגה דגם 5430/R, צינורות חרוטיים 15/50 מ"ל, 6 מקומותEppendorfF-35-6-30
15 מ"ל צינור מכסה בורג מודפס מסך 17 x 20 מ"מ חרוטי, פוליפרופילןSarstedt62.554.205זמין ממגוון יצרנים
צינור גמיש 1.5 מ"ל, צינורות מיקרוצנטריפוגה נקיים וטבעיים PCREppendorf22364120זמין ממגוון יצרנים
תנורי חימום אנלוגיים לאמבטיהFisher Scientific1172011AQמומלץ שיהיו שני תנורי חימום זמינים (אחד לדגירת תאים במהלך טיפול בציקלוקסימיד ואחד להרתחת ליזטים לדנטורציה של חלבונים). לחלופין, 30 מעלות; אמבט מים C עשוי לשמש לדגירה של תאים בנוכחות ציקלוהקסימיד. אמבט מים רותחים עם פלטה חשמלית עשוי לשמש לסירוגין כדי לנטרל חלבונים.
בלוק חימום לצינורות חרוטיים בגודל 12 x 15 מ"לפישר סיינטיפיק11-473-70לשימוש עם תנור חימום במהלך דגירה של תאים בנוכחות ציקלוהקסימיד.
בלוק חימום לצינורות חרוטיים בגודל 20 x 1.5 מ"לFisher Scientific11-718-9Qלשימוש עם מחמם Dri-Bath להרתחת ליזטים לדנטורציה של חלבון.
מכשירי הפעלה והעברה של SDS-PAGE, ספקי כוח וציוד הדמיה או חדרי חושך עבור SDS-PAGE והעברה לממברנהישתנו בהתאם למעבדה וליישום
מערכת הדמיה של Western Blot (למשל סורק Li-Cor Odyssey CLx ותוכנת Image Studio)Li-Cor9140-01ישתנה בהתאם למעבדה וליישום
EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer MembranesFisher ScientificIPFL00010ישתנה בהתאם למעבדה וליישום
נוגדנים ראשוניים (למשל פוספוגליצרט קינאז (Pgk1), נוגדן חד-שבטי, עכבר (שיבוט 22C5D8)))Life Technologies459250ישתנה בהתאם למעבדה וליישום
נוגדנים משניים (למשל Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H + L))LifeTechnologiesA-21065ישתנה בהתאם למעבדה וליישום
חיץ

מקורות

  1. Jankowska, E., Stoj, J., Karpowicz, P., Osmulski, P. A., Gaczynska, M. The proteasome in health and disease. Cur Pharm Des. 19 (6), 1010-1028 (2013).
  2. Nakayama, K. I., Nakayama, K. Ubiquitin ligases: cell-cycle control and cancer. Nat Rev Cancer. 6 (5), 369-381 (2006).
  3. Amm, I., Sommer, T., Wolf, D. H. Protein quality control and elimination of protein waste: the role of the ubiquitin-proteasome system. Biochim Biophys Acta. 1843 (1), 182-196 (2014).
  4. Goldberg, A. L. Protein degradation and protection against misfolded or damaged proteins. Nature. 426 (6968), 895-899 (2003).
  5. Guerriero, C. J., Brodsky, J. L. The delicate balance between secreted protein folding and endoplasmic reticulum-associated degradation in human physiology. Physiol Rev. 92 (2), 537-576 (2012).
  6. Pagan, J., Seto, T., Pagano, M., Cittadini, A. Role of the ubiquitin proteasome system in the heart. Circ Res. 112 (7), 1046-1058 (2013).
  7. Rubinsztein, D. C. The roles of intracellular protein-degradation pathways in neurodegeneration. Nature. 443 (7113), 780-786 (2006).
  8. Turnbull, E. L., Rosser, M. F., Cyr, D. M. The role of the UPS in cystic fibrosis. BMC Biochem. 8 Suppl 1, S11(2007).
  9. Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Nat Rev Drug Discov. 10 (1), 29-46 (2011).
  10. Kar, G., Keskin, O., Fraternali, F., Gursoy, A. Emerging role of the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Curr Pharm Des. 19 (18), 3175-3189 (2013).
  11. Paul, S. Dysfunction of the ubiquitin-proteasome system in multiple disease conditions: therapeutic approaches. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 30 (11-12), 1172-1184 (2008).
  12. Shen, M., Schmitt, S., Buac, D., Dou, Q. P. Targeting the ubiquitin-proteasome system for cancer therapy. Expert Opin Ther Targets. 17 (9), 1091-1108 (2013).
  13. Crowder, J. J., et al. Rkr1/Ltn1 Ubiquitin Ligase-Mediated Degradation of Translationally Stalled Endoplasmic Reticulum Proteins. J Biol Chem. 290 (30), 18454-18466 (2015).
  14. Gardner, R. G., et al. Endoplasmic reticulum degradation requires lumen to cytosol signaling. Transmembrane control of Hrd1p by Hrd3p. J Cell Biol. 151 (1), 69-82 (2000).
  15. Metzger, M. B., Maurer, M. J., Dancy, B. M., Michaelis, S. Degradation of a cytosolic protein requires endoplasmic reticulum-associated degradation machinery. J Biol Chem. 283 (47), 32302-32316 (2008).
  16. Watts, S. G., Crowder, J. J., Coffey, S. Z., Rubenstein, E. M. Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae. J Vis Exp. (96), e52428(2015).
  17. Cohen, I., Geffen, Y., Ravid, G., Ravid, T. Reporter-based growth assay for systematic analysis of protein degradation. J Vis Exp. (93), e52021(2014).
  18. Ravid, T., Kreft, S. G., Hochstrasser, M. Membrane and soluble substrates of the Doa10 ubiquitin ligase are degraded by distinct pathways. EMBO J. 25 (3), 533-543 (2006).
  19. Kohlmann, S., Schafer, A., Wolf, D. H. Ubiquitin ligase Hul5 is required for fragment-specific substrate degradation in endoplasmic reticulum-associated degradation. J Biol Chem. 283 (24), 16374-16383 (2008).
  20. Medicherla, B., Kostova, Z., Schaefer, A., Wolf, D. H. A genomic screen identifies Dsk2p and Rad23p as essential components of ER-associated degradation. EMBO Rep. 5 (7), 692-697 (2004).
  21. Habeck, G., Ebner, F. A., Shimada-Kreft, H., Kreft, S. G. The yeast ERAD-C ubiquitin ligase Doa10 recognizes an intramembrane degron. J Cell Biol. 209 (2), 261-273 (2015).
  22. Tran, J. R., Brodsky, J. L. Assays to measure ER-associated degradation in yeast. Methods Mol Biol. 832, 505-518 (2012).
  23. Kao, S. H., et al. GSK3beta controls epithelial-mesenchymal transition and tumor metastasis by CHIP-mediated degradation of Slug. Oncogene. 33 (24), 3172-3182 (2014).
  24. Hampton, R. Y., Rine, J. Regulated degradation of HMG-CoA reductase, an integral membrane protein of the endoplasmic reticulum, in yeast. J Cell Biol. 125 (2), 299-312 (1994).
  25. Hochstrasser, M., Varshavsky, A. In vivo degradation of a transcriptional regulator: the yeast alpha 2 repressor. Cell. 61 (4), 697-708 (1990).
  26. Schneider-Poetsch, T., et al. Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin. Nat Chem Biol. 6 (3), 209-217 (2010).
  27. Whiffen, A. J., Bohonos, N., Emerson, R. L. The Production of an Antifungal Antibiotic by Streptomyces griseus. J Bacteriol. 52 (5), 610-611 (1946).
  28. Obrig, T. G., Culp, W. J., McKeehan, W. L., Hardesty, B. The mechanism by which cycloheximide and related glutarimide antibiotics inhibit peptide synthesis on reticulocyte ribosomes. J Biol Chem. 246 (1), 174-181 (1971).
  29. Ennis, H. L., Lubin, M. Cycloheximide: Aspects of Inhibition of Protein Synthesis in Mammalian Cells. Science. 146 (3650), 1474-1476 (1964).
  30. Kerridge, D. The effect of actidione and other antifungal agents on nucleic acid and protein synthesis in Saccharomyces carlsbergensis. J Gen Microbiol. 19 (3), 497-506 (1958).
  31. Chakrabarti, S., Dube, D. K., Roy, S. C. Effects of emetine and cycloheximide on mitochondrial protein synthesis in different systems. Biochem J. 128 (2), 461-462 (1972).
  32. Seufert, W., Jentsch, S. In vivo function of the proteasome in the ubiquitin pathway. EMBO J. 11 (8), 3077-3080 (1992).
  33. Varshavsky, A. Discovery of the biology of the ubiquitin system. JAMA. 311 (19), 1969-1970 (2014).
  34. Heinemeyer, W., Kleinschmidt, J. A., Saidowsky, J., Escher, C., Wolf, D. H. Proteinase yscE, the yeast proteasome/multicatalytic-multifunctional proteinase: mutants unravel its function in stress induced proteolysis and uncover its necessity for cell survival. EMBO J. 10 (3), 555-562 (1991).
  35. Sommer, T., Jentsch, S. A protein translocation defect linked to ubiquitin conjugation at the endoplasmic reticulum. Nature. 365 (6442), 176-179 (1993).
  36. Hiller, M. M., Finger, A., Schweiger, M., Wolf, D. H. ER degradation of a misfolded luminal protein by the cytosolic ubiquitin-proteasome pathway. Science. 273 (5282), 1725-1728 (1996).
  37. Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nature Protoc. 2 (1), 31-34 (2007).
  38. Bergman, L. W. Growth and maintenance of yeast. Methods Mol Biol. 177, 9-14 (2001).
  39. Biederer, T., Volkwein, C., Sommer, T. Degradation of subunits of the Sec61p complex, an integral component of the ER membrane, by the ubiquitin-proteasome pathway. EMBO J. 15 (9), 2069-2076 (1996).
  40. Kushnirov, V. V. Rapid and reliable protein extraction from yeast. Yeast. 16 (9), 857-860 (2000).
  41. Sharma, M., Benharouga, M., Hu, W., Lukacs, G. L. Conformational and temperature-sensitive stability defects of the delta F508 cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in post-endoplasmic reticulum compartments. J Biol Chem. 276 (12), 8942-8950 (2001).
  42. Mayer, T. U., Braun, T., Jentsch, S. Role of the proteasome in membrane extraction of a short-lived ER-transmembrane protein. EMBO J. 17 (12), 3251-3257 (1998).
  43. Rubenstein, E. M., Kreft, S. G., Greenblatt, W., Swanson, R., Hochstrasser, M. Aberrant substrate engagement of the ER translocon triggers degradation by the Hrd1 ubiquitin ligase. J Cell Biol. 197 (6), 761-773 (2012).
  44. Scott, D. C., Schekman, R. Role of Sec61p in the ER-associated degradation of short-lived transmembrane proteins. J Cell Biol. 181 (7), 1095-1105 (2008).
  45. Thibault, G., Ng, D. T. The endoplasmic reticulum-associated degradation pathways of budding yeast. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (12), (2012).
  46. Fisher, E. A., et al. The degradation of apolipoprotein B100 is mediated by the ubiquitin-proteasome pathway and involves heat shock protein 70. J Biol Chem. 272 (33), 20427-20434 (1997).
  47. Pariyarath, R., et al. Co-translational interactions of apoprotein B with the ribosome and translocon during lipoprotein assembly or targeting to the proteasome. J Biol Chem. 276 (1), 541-550 (2001).
  48. Yeung, S. J., Chen, S. H., Chan, L. Ubiquitin-proteasome pathway mediates intracellular degradation of apolipoprotein. B. Biochemistry. 35 (43), 13843-13848 (1996).
  49. Biederer, T., Volkwein, C., Sommer, T. Role of Cue1p in ubiquitination and degradation at the ER surface. Science. 278 (5344), 1806-1809 (1997).
  50. Metzger, M. B., et al. A structurally unique E2-binding domain activates ubiquitination by the ERAD E2, Ubc7p, through multiple mechanisms. Mol Cell. 50 (4), 516-527 (2013).
  51. Bazirgan, O. A., Hampton, R. Y. Cue1p is an activator of Ubc7p E2 activity in vitro and in vivo. J Biol Chem. 283 (19), 12797-12810 (2008).
  52. Kim, I., et al. The Png1-Rad23 complex regulates glycoprotein turnover. J Cell Biol. 172 (2), 211-219 (2006).
  53. Chen, P., Johnson, P., Sommer, T., Jentsch, S., Hochstrasser, M. Multiple ubiquitin-conjugating enzymes participate in the in vivo degradation of the yeast MAT alpha 2 repressor. Cell. 74 (2), 357-369 (1993).
  54. Jungmann, J., Reins, H. A., Schobert, C., Jentsch, S. Resistance to cadmium mediated by ubiquitin-dependent proteolysis. Nature. 361 (6410), 369-371 (1993).
  55. Tansey, W. P. Pulse-chase assay for measuring protein stability in yeast. Cold Spring Harb Protoc. , (2007).
  56. Hanna, J., Leggett, D. S., Finley, D. Ubiquitin depletion as a key mediator of toxicity by translational inhibitors. Mol Cell Biol. 23 (24), 9251-9261 (2003).
  57. Wilson, W. A., Hawley, S. A., Hardie, D. G. Glucose repression/derepression in budding yeast: SNF1 protein kinase is activated by phosphorylation under derepressing conditions, and this correlates with a high AMP:ATP ratio. Curr Biol. 6 (11), 1426-1434 (1996).
  58. Ashe, M. P., De Long, S. K., Sachs, A. B. Glucose depletion rapidly inhibits translation initiation in yeast. Mol Biol Cell. 11 (3), 833-848 (2000).
  59. Grant, C. M., MacIver, F. H., Dawes, I. W. Mitochondrial function is required for resistance to oxidative stress in the yeast Saccharomyces cerevisiae. FEBS Lett. 410 (2-3), 219-222 (1997).
  60. Javmen, A., et al. beta-Glucan from Saccharomyces cerevisiae Induces IFN-gamma Production In Vivo in BALB/c Mice. In Vivo. 29 (3), 359-363 (2015).
  61. Link, A. J., LaBaer, J. Trichloroacetic acid (TCA) precipitation of proteins. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (8), 993-994 (2011).
  62. Hornbeck, P. V. Enzyme-Linked Immunosorbent Assays. Curr Protoc Immunol. 110, 2.1.1-2.1.23 (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Western BlotSDS PAGE

מאמרים קשורים