Cycloheximide ניתוח צ&#39;ייס של פירוק חלבונים ב<em&gt; שמר האפייה</em

סיכום

שפע החלבונים משקף את שיעורי סינתזת החלבון ופירוק החלבון. מאמר זה מתאר את השימוש במרדף ציקלוהקסימיד ואחריו הכתמה מערבית כדי לנתח פירוק חלבון במודל האיקריוט החד-תאי, Saccharomyces cerevisiae (שמרים ניצנים).

תקציר

הסדרת שפע חלבון חיונית כמעט בכל תהליך הסלולר. שפע חלבון משקף את השילוב של שיעורי סינתזת חלבון פירוק חלבונים. מבחני רבים מדווחים על שפע חלבון (למשל, סופג מערבי נקודה חד פעמי, cytometry זרימה, מיקרוסקופ פלואורסצנטי, או מבחני כתב מבוסס צמיחה) אינו מאפשרים אפליה של ההשפעות היחסיות של תרגום proteolysis על רמות חלבון. מאמר זה מתאר את השימוש של מרדף cycloheximide ואחריו מערבי סופג כדי לנתח את החלבון שפל במפורש eukaryote unicellular המודל, שמר אפייה (שמרים ניצנים). בהליך זה, תאי שמרים מודגרת בנוכחות cycloheximide מעכב translational. Aliquots של התאים נאספים מיד לאחר ובנקודות זמן מסוים לאחר תוספת של cycloheximide. תאים lysed, ואת lysates מופרדים על ידי אלקטרופורזה polyacrylamide ג'ל FOr ניתוח כתם המערבי של שפע חלבון בכל נקודת זמן. הליך מרדף cycloheximide היתרים להדמיה של קינטיקה השפלה של אוכלוסיית המצב היציבה של מגוון של חלבונים תאיים. ההליך ניתן להשתמש כדי לחקור את הדרישות גנטיות והשפעות סביבתיות על פירוק חלבונים.

מבוא

חלבונים לבצע פעולות מכריעות כמעט בכל תהליך הסלולר. תהליכים פיזיולוגיים רבים דורשים נוכחות של חלבון מסוים (או חלבונים) לתקופה מוגדרת של זמן או בנסיבות מיוחדות. אורגניזמים ולכן לפקח ולהסדיר שפע חלבון כדי לענות על צרכים הסלולר ^1. לדוגמא, cyclins (חלבונים השולטים חלוקת תא) נוכח בשלבים מסוימים של מחזור התא, ואת אובדן רמות cyclin המוסדרים נקשר עם היווצרות גידולים ממאירים ^2. בנוסף ויסות רמות חלבון כדי לענות על צרכים הסלולר, תאים במנגנוני בקרת איכות degradative לחסל misfolded, מוכנות להרכבה, או סוטות אחרת מולקולות חלבון ^3. פיקוח על שפע חלבון כרוך הסדרה הן סינתזת macromolecular (שעתוק ותרגום) ושפלה (ריקב....

פרוטוקול

צמיחה 1. קציר של תאים שמרים

1. אם לא בניתוח קינטיקה השפלה של חלבון שמרים אנדוגני, להפוך זן שמרים הרצוי (ים) עם פלסמיד המקודד את החלבון של עניין. שיטות אמינות לטרנספורמציה שמרים תוארו בעבר ^37.
2. לחסן שמרים ב 5 מ"ל של המדיום המתאים (למשל, מוגדר סינתטי סלקטיבית (SD) בינוני עבור תחזוקה פלסמיד של התאים שהשתנו או שמרים הלא סלקטיבי לחלץ דקסטרוז-peptone (YPD) בינוני עבור תאים שאינם טרנספורמציה). דגירה לילה בשעה 30 ° C, מסתובבת.
   הערה: 30 ° C היא הטמפרטורה לצמיחה אופטימלית עבור....

תוצאות

כדי להמחיש מתודולוגיה מרדף cycloheximide, יציבות Deg1 -Sec62 (איור 1), reticulum endoplasmic שמרים מודל (ER) השפלה -associated (ERAD) המצע, נותח ^42-44. בשנת ERAD, אנזימי אנזים היוביקוויטין בקרה איכות לצרף קוולנטית שרשרות של היוביקוויטין החלבון הקטן לחלבונים סוטים המקומיים על קרום ER. חלבונים polyubiquitylated כזה ובהמשך יוסרו מן ER ו מושפל על ידי הפרוטאזום, פרוטאז גדול, cytosolic ^45. חלבון Deg1

דיון

במאמר זה, שיטה לניתוח קינטיקה פירוק חלבונים מוצגת. טכניקה זו יכולה בקלות להיות מיושמת מגוון של חלבונים מושפלים על ידי מגוון של מנגנונים. חשוב לציין כי ניסויי cycloheximide מרדף לדווח על קינטיקה השפלה של ברכת המצב היציבה של חלבון נתון. טכניקות אחרות ניתן להשתמש כדי לנתח את קינטיקה השפלה של אוכלוסיות ספציפיות של חלבונים. לדוגמא, גורל degradative של פוליפפטידים המתהווה יכול להיות מועבר על ידי ניתוח מרדף דופק ^55. בניסויים כאלה, חלבונים המתהווה הם הדופק שכותרתו בקצרה (למ.......

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
זני שמרים רצויים, פלסמידים, מדיום סטנדרטי ורכיבי
צינורות זכוכית בורוסיליקט חד פעמיים	Fisher Scientific	14-961-32	זמין ממגוון יצרנים
חממה מווסתת טמפרטורה (למשל חממת Heratherm דגם IMH180)	Dot Scientific	51028068	זמין ממגוון יצרנים
תוף להחלפה של ניו ברונסוויק לצינורות 18 מ"מ (רולר צינור)	ניו ברונסוויק	M1053-0450	רולר צינור מומלץ לשמירה על תרביות התחלה של תאי שמרים בתרחיף. לחלופין, אם רולר צינור אינו זמין, ניתן להשתמש בשייקר פלטפורמה בחממה מבוקרת טמפרטורה לתרביות התחלה ללילה. ניתן להשתמש בשייקר פלטפורמה או רולר צינור כדי לשמור על תרביות גדולות יותר בהשעיה.
ניו ברונסוויק TC-7 רולר תוף 120 V 50/60 H	ניו ברונסוויק	M1053-4004	לשימוש עם רולר צינור
SmartSpec Plus ספקטרופוטומטר	Bio-Rad	170-2525	זמין ממגוון יצרנים
צנטריפוגה 5430	Eppendorf	5427 000.216	רוטור שנמכר עם יחידה מכיל צינורות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 ו -2.0 מ"ל. ניתן להחליף את הרוטור לאחד המכיל צינורות חרוטיים של 15 ו-50 מ"ל
רוטור זווית קבועה F-35-6-30 עם מכסה ומתאמים לצנטריפוגה דגם 5430/R, צינורות חרוטיים 15/50 מ"ל, 6 מקומות	Eppendorf	F-35-6-30
15 מ"ל צינור מכסה בורג מודפס מסך 17 x 20 מ"מ חרוטי, פוליפרופילן	Sarstedt	62.554.205	זמין ממגוון יצרנים
צינור גמיש 1.5 מ"ל, צינורות מיקרוצנטריפוגה נקיים וטבעיים PCR	Eppendorf	22364120	זמין ממגוון יצרנים
תנורי חימום אנלוגיים לאמבטיה	Fisher Scientific	1172011AQ	מומלץ שיהיו שני תנורי חימום זמינים (אחד לדגירת תאים במהלך טיפול בציקלוקסימיד ואחד להרתחת ליזטים לדנטורציה של חלבונים). לחלופין, 30 מעלות; אמבט מים C עשוי לשמש לדגירה של תאים בנוכחות ציקלוהקסימיד. אמבט מים רותחים עם פלטה חשמלית עשוי לשמש לסירוגין כדי לנטרל חלבונים.
בלוק חימום לצינורות חרוטיים בגודל 12 x 15 מ"ל	פישר סיינטיפיק	11-473-70	לשימוש עם תנור חימום במהלך דגירה של תאים בנוכחות ציקלוהקסימיד.
בלוק חימום לצינורות חרוטיים בגודל 20 x 1.5 מ"ל	Fisher Scientific	11-718-9Q	לשימוש עם מחמם Dri-Bath להרתחת ליזטים לדנטורציה של חלבון.
מכשירי הפעלה והעברה של SDS-PAGE, ספקי כוח וציוד הדמיה או חדרי חושך עבור SDS-PAGE והעברה לממברנה			ישתנו בהתאם למעבדה וליישום
מערכת הדמיה של Western Blot (למשל סורק Li-Cor Odyssey CLx ותוכנת Image Studio)	Li-Cor	9140-01	ישתנה בהתאם למעבדה וליישום
EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer Membranes	Fisher Scientific	IPFL00010	ישתנה בהתאם למעבדה וליישום
נוגדנים ראשוניים (למשל פוספוגליצרט קינאז (Pgk1), נוגדן חד-שבטי, עכבר (שיבוט 22C5D8)))	Life Technologies	459250	ישתנה בהתאם למעבדה וליישום
נוגדנים משניים (למשל Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H + L))Life	Technologies	A-21065	ישתנה בהתאם למעבדה וליישום

חיץ