יישום סדרתית של הזכוכית Coverslips להעריך את הדחיסה הנוקשת של עדשות העכבר: ניתוח זנים ואת morphometric

סיכום

עלייה הקשורה לגיל בנוקשות עדשות העיניים קשורה לפרסביופיה. פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה וחסכונית למדידת קשיחות עדשת העכבר. עדשות עכבר, כמו עדשות אנושיות, נעשות נוקשות יותר עם הגיל. שיטה זו מדויקת וניתנת להתאמה לעדשות מבעלי חיים גדולים יותר.

תקציר

עדשת העין היא איבר שקוף כי ומשגרת ומתמקד אור כדי ליצור תמונה ברורה על הרשתית. אצל בני אדם, שרירים מתכווצים ריסים כדי לעוות את העדשה, מה שמוביל לעלייה בכוחה האופטי 'העדשה להתמקד בעצמים קרובים, תהליך המכונה אירוח. גיל הקשורים שינויים נוקשים עדשה קושרו פרסביופיה, הפחתת העדשה 'היכולת להכיל, ובהרחבה, את הצורך במשקפי קריאה. למרות עדשות עכבר אינה להתאים או לפתח פרסביופיה, במודלים של עכברים יכולים לספק כלי רב ערך עבור גנטי פתולוגיות עדשת הבנה, וההזדקנות המואצת נצפתה בעכברים מאפשרת הלימוד של שינויים הקשורים בגיל בעדשה. פרוטוקול זה מדגים שיטה פשוטה, מדויקת, וחסכונית לקביעת נוקשות עדשת עכבר, באמצעות coverslips זכוכית ליישם ברצף הגדלת עומסי דחיסה על גבי העדשה. נציג נתונים לאשר עדשות העכבר להיות נוקשה עם הגיל, כמועדשות אדם. שיטה זו היא מאוד לשחזור ואף עלול להיות מדורג עד מכנית עדשות מבחן מחיות גדולות יותר.

מבוא

העדשה היא איבר שקוף וכלי דם בחדר הקדמי של העין האחראי על מיקוד עדין של האור על הרשתית. קרום בסיס שקוף, הנקרא קפסולת העדשה, מקיף כמות גדולה של תאי סיבים מוארכים המכוסים בשכבה חד-שכבתית קדמית של תאי אפיתל^1,2. צמיחה לכל החיים של העדשה תלויה בשגשוג ובהתמיינות מתמשכת של תאי אפיתל בקו המשווה של העדשה לתאי סיבים חדשים המתווספים לדורות קודמים של תאי סיבים באופן קונצנטרי². עם הזמן, תאי סיבי העדשה עוברים דחיסה, וכתוצאה מכך נוצר מרכז קשיח באמצע העדשה הנקרא גרעין¹. התאמה, המוגדרת כשינוי דיופטרי בכוח האופטי של העין, מתרחשת בבני אדם כאשר שרירי הריסים מתכווצים כדי לעוות את העדשה ולאפשר עלייה אמיתית בכוח האופטי להתמקד בעצמים קרובים^3-5. בעין הלא מותאמת, העדשה מוחזקת במצב שטוח יחסית עקב מתח מסיבים אזוריים. כאשר השרירים הריריים מתכווצים, המתח על העדשה משתחרר, מה שמוביל לירידה בקוטר קו המשווה של העדשה ולעלייה בעובי הצירי. שינויים הקשורים לגיל בעדשה גורמים לפרסביופיה, אובדן מתקדם של התאמות העדשה, מה שמוביל לצורך במשקפי קריאה.

מספר מחקרים קשרו פרסביופיה לעלייה הקשורה לגיל בנוקשות הפנימית של העדשה^6-11. קשיחות מוגדרת כהתנגדות של חפץ אלסטי להתעוות בעומס מופעל. נעשה שימוש במגוון שיטות לבחינת קשיחות של עדשות אנושיות, כולל דחיסת ספין^12-14, דחיסת מפעיל¹⁵, כניסת בדיקה¹⁶, ניתוח מכני דינמי ^6,10 וכוח קרינה אקוסטית מבוסס בועות¹⁷. בעוד שעדשות עכבר אינן מתאימות או מפתחות פרסביופיה, מודלים של עכברים לפתולוגיות עדשות הם כלים יקרי ערך מכיוון שעכברים זולים יותר מבעלי חיים גדולים יותר, מאופיינים היטב מבחינה גנטית ועוברים שינויים מואצים הקשורים לגיל עקב הזדקנות מהירה. קומץ מחקרים בחנו את נוקשות עדשות העכבר בשיטות דחיסה והדגימו שינויים בנוקשות העדשות עקב הזדקנות או הפרעות גנטיות ממוקדות^18-21. לפיכך, עדשות עכבר הן מודלים טובים לחקר שינויים הקשורים לגיל בנוקשות העדשות.

פרוטוקול זה מתאר שיטת דחיסה פשוטה וזולה, אך מדויקת וניתנת לשחזור, לקביעת קשיחות עדשת העכבר המבוססת על יישום כיסויי זכוכית על העדשה בשילוב עם צילום העדשה דרך מיקרוסקופ דיסקציה ומראה. שיטה זו מניבה מתח חזק ונתונים מורפומטריים עם מכשיר קל לייצור והרכבה. התוצאות המייצגות מאשרות כי עדשות עכבר עולות בנוקשות עם הגיל.

פרוטוקול

הנהלים כל חיה בוצעו בהתאם ההמלצות מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות ותחת פרוטוקול שאושר על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש במכון המחקר סקריפס.

1. עדשות Dissection

1. להרדים עכברים על פי המלצות המכונים הלאומיים לבריאות "מדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה" ופרוטוקולי שימוש בבעלי חיים במוסד שאושר.
2. Enucleate העין מעכברים באמצעות מלקחיים מעוקלים. לדכא את הרקמה סביב העין עם מלקחיים כדי להביא את העין מתוך השקע, ואז לקטוף את העין מהשקע עם מלקחיים. עבר עיניים בופר פוספט 1x הטרי (PBS) בצלחת לנתיחה.
3. חותכים את עצב הראייה קרוב גלגל העין ככל האפשר. בעדינות ובזהירות להכניס פינצטה ישר עדין אל תוך גלגל העין דרך wher חורדואר עצב הראייה יוצא האחורי.
4. בזהירות עושים חתך במספריים לתוך גלגל העין מן אחורי אל הקצה של הקרנית. עדשות מכרסמות לכבוש ~ 30% של העין. ודא חתכים אלה בזהירות, ואל תכניס פינצטה או מספריים עמוק מדי לתוך העין כדי למנוע נזק העדשה.
5. חותכים לאורך המפגש בין הקרנית בלובן העין בבית חצי הדרך לפחות סביב גלגל העין.
6. דחוף בעדינות את הקרנית כדי להסיר את העדשה מהעין דרך הפתח שנעשה צעדי 1.4 ו -1.5.
7. שימוש במלקחיים ישר טיפ נאים כדי להסיר כל פסולת גדולה בזהירות כי הוא עדיין מחובר העדשה. ראייה לבדוק את העדשה לכל נזק לפני שתמשיך המדידות נוקשות.

2. מדידות נוקשות

1. לשקול לפחות 10 coverslips מאותה תיבה באמצעות איזון אנליטיים. מצא את המשקל הממוצע של coverslips. לקבלת עקביות, השתמש באותה קופסת coverslips עבור כל הניסויים. טרום רטובבמראה coverslips ו-זווית ישרה ב PBS 1x בטמפרטורת החדר למשך שעה לפחות 2 לפני תחילת הניסויים.
2. ממלא את החדר המדיד (ראה איור 1) עם 65 - 75 מיליליטר של 1x PBS. תא המדידה נעשה מתוך פרספקס ידי חנות מכונת in-house, ואת divots בתא נעשה על ידי מקדחה מוגדרת לעומק הרצוי עם מקדח מתאים. עדשות לשמור על שקיפות ב 1x PBS בטמפרטורת החדר למשך בדיקות מכניות.

איור 1:. נוקשות מדידת לשכת תצלום מראה את הממדים של חדר המדידה נוקשת מחוייט עם מגוון רחב של divots עומקים שונים ובצורות שונות. Divots העגול 200 מיקרומטר או 300 מיקרומטר עמוק (ראשי חץ צהובים) משמש את המידות על עדשות עכבר. Divots הם 2 מ"מ בקוטר ~ 13-. 14 מ"מ מהקצה של החדר אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

3. מניחים המראים בזווית ישר לתוך התא במרחק קבוע מן השקע אשר ישמש כדי להחזיק את העדשה. ודא במראה לא זז במהלך הניסוי.
4. עדשות העברת גזור לתא מדידה בקפידה עם מלקחיים לתפוס או מלקחיים מעוקלים.
5. קח תמונה עליונה לאור העדשה פרקה ישר מלמעלה. קח תמונות העדשה העכבר 30X הגדלה עם תאורה מ מיקרוסקופ לנתח (למטה) ומקור אור סיבים אופטיים על הצדדים על ימין ועל שמאל. הגדר את אספקת החשמל סיבים אופטיים עד 80% של עוצמת האור המקסימלית. התאם את פלט אספקת החשמל מבוסס על תאורה מפוזרת, העדפות המשתמש ואת איכות התמונה לפי הצורך.
6. קח תמונת נוף בצד של העדשה לא הטעונה, אשר ניתן לראות דרך רימראה ght-זווית. אם המצלמה אינה מכוילת, לצלם תמונה של הקצה המראה בפוקוס. קצה המראה באורך 5 מ"מ, מדידה זו ניתן להשתמש מאוחר יותר כדי לקבוע את הפיקסלים / מ"מ ולשמש סרגל קנה המידה של תמונות.
7. עדשת מקום לתוך השקע, ולאשר כי העדשה מונחת כהלכה ו ישר את השקע. קח תמונה של העדשה לפני הטעינה. העדשה צריכה להיות נחה את השקע על הקדמי שלה או בקוטב אחורי.
8. מקום 1 coverslip בעדינות על העדשה. חכה 2 דקות כדי לאפשר שרץ, ולקחת עוד תמונת הצד להציג של העדשה הטעונה.
9. ממשיכים להוסיף coverslips כמו בשלב 2.8 וצילמו-מבט מהצד לאחר תוספת של כל coverslip כמו בשלב 2.8 עד סך של 10 coverslips מוחלים.
10. הסר את כל coverslips. חכה 2 דקות, ולצלם תמונת נוף בצד של העדשה (ומחוץ לה את השקע) לאחר הסרת כל coverslips.

3. מדידת העדשה Nucleus

1. כדי determine בגודל גרעין העדשה, להזיז את העדשה אל צלחת נקייה פטרי מלא 1x PBS.
2. בעדינות decapsulate העדשה באמצעות מלקחיים ישר בסדר.
3. להשיל את תאי סיבי קליפת המוח על ידי גלגול העדשה בין אצבע עטוית כפפה. גרעין העדשה הנותר ירגיש כמו גולה קשה. השתמש בהליך זה כדי לבודד את הגרעין על עדשות מבוגרות מתחיל ב -1 לחודש של גיל. מאז הגרעין המבודד הוא גוף נוקשה, בדיקה מכאנית נוספת של גרעין העדשה לא יכולה להתבצע באמצעות שיטה מתוארת זה.
4. לשטוף בעדינות את גרעין העדשה 1x PBS בצלחת פטרי.
5. מניחים את גרעין העדשה בחזרה לתוך תא המדידה (לא את השקע), ולקחת תמונה של גרעין העדשה דרך המראה בזווית ישרה.

איור 2:. עדשות עכבר דחוסים ידי Coverslips (א) סכמטי ו- (ב) תצלום של האקסהתקנת perimental מראה עדשת עכבר 2 בן חודש בתוך שקע 200 מיקרומטר עמוק בתוך תא המדידה מלא 1x PBS. מראה זווית נכונה ומצלמה דיגיטלית רכובה על מיקרוסקופ לנתיחה שמשו כדי לאסוף תמונות של העדשה במהלך דחיסה על ידי coverslips. (C) תמונות של נופי sagittal של עדשת wild-type 2-בן חודש הדחוסה על ידי מספר הגדל והולך של coverslips ברציפות ספקו את הנתונים הגולמיים למדידת קטרים ​​ציריים משווניים וחישוב זנים ציריים משווניים במהלך בדיקת דחיסה מבוססת coverslip. השתקפות של העדשה ניתן לראות לפעמים את coverslips (רוב נראה בבירור בתמונה 1 coverslip). בעת ביצוע מדידות, להתעלם ההשתקפות ולמדוד אל הקודקוד של העדשה. (ד) תמונות של נופי sagittal של עדשת wild-type בן חודש 2-דחיסת הדואר ועל גרעין העדשה המבודד. עדשת פוסט-דחיסת הגרעין מבודד ישב מחוץ את השקע. ברי סולם, 1 מ"מ. נתון זה שונה מן Gokhב, et al. PLoS ONE, 2012 ^19. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

ניתוח תמונה 4.

1. מדוד בקטרים ​​משווניים ו ציריים של עדשות לפני טעינה ואחרי כל שלב טעינה באמצעות ImageJ או תוכנה דומה. מדוד את הקוטר של כל גרעין העדשה. גרעין העדשה כמעט כדורי כך מדידה בכל אורינטציה תספיק ^19,21.
2. תקן את העדשה צירית בקטרים ​​ידי הוספת עומק השקע בשימוש. בתא המדידה, את השקע הסתיר 200 מיקרומטר (עדשות עכבר 2-בן חודש) או 300 מיקרומטר (4 בן חודש ו -8 חודשים ישנות עדשות עכבר) של העובי הצירי של העדשה.
3. חשבת את צירית זנים משווניים מן מדידות קוטר עדשה באמצעות המשוואה, ε = (d - d ₀₎ / ד _0, שם ε הוא זן, d הוא צירי או דוארקוטר quatorial בעומס נתון, ד ₀ הוא בקוטר צירי או משווני המקביל בעומס אפס.
4. מגרש את צירית זנים משווניים כפונקציה של העומס המוטל (במ"ג).
5. מגרש את צירי, הקו משווה ובקטרים ​​גרעיניים. לחשב ולתכנן את יחס ממדי עדשה על ידי חלוקה בקוטר הצירי ידי הקוטר המשווני.
6. לחשב ולתכנן את היקף העדשה באמצעות המשוואה, נפח = 4/3 × π × r _E ² × r _A, כאשר r _E הוא _רדיוס r המשווני הוא הרדיוס הצירי נמדד על פי התמונה לקחה צעד 2.6. משוואה זו מניחה העדשה היא אליפטית oblate (אליפסואיד) ^1,22.
7. לחשב ולתכנן את היקף גרעיני באמצעות המשוואה, נפח = 4/3 × π × r _N ^3, כאשר r _N הוא רדיוס של גרעין העדשה כפי שהן נמדדות תמונה לקחה צעד 3.5. משוואה זו מניחה את i גרעין העדשהsa בתחום ^19,21.
8. לחשב ולתכנן את השבר גרעיני כיחס בין היקף גרעיני בהיקף העדשה.

תוצאות

הנוקשות והממדים של 2, 4 ו 8 חודשים ישני עדשות עכבר נמדדו. עכברים היו כל wild-type חיות על רקע המתח טהור C57BL6 המתקבל מתקן גידול בעלי חיים TSRI, ואת כל עדשה היתה עמוסה 1 עד 10 coverslips. הזנים הציריים משווניים חושבו כפונקציה של עומס המופעל על ידי מדידה הצירית ובקטרי קו משווים של העדשה לאחר התוספת של כל coverslip, ולאחר מכן נרמול כל שינוי בקוטר לקוטר פרקו המקביל. שמונה עדשות מכל גיל נבדקו, והתוצאות באות לידי ביטוי בדברים ± סטיית התקן הממוצעת. כפי ש...

דיון

ישנם מספר שיקולים מרכזיים בעת שימוש בשיטה זו כדי למדוד נוקשות עדשה. ראשית, coverslips מוחלים על העדשה בזווית אלכסונית מעט (8 - 8.5 °) ביחס לחלק התחתון של החדר (θ). זה יחול מרכיב קטן מאוד של עומס equatorially ולא axially. עם זאת, עומס משווני זה נחשב זניח בגלל חטא θ ≈ 0.1 ^19. אם שיטה זו מותאמת עבור עדשות גדולות, את הזווית של coverslips אל החלק התחתון של החדר היה צריכה להימדד על מנת לקבוע האם עומס משווני יש בחשבון חישובי זן. שנית, חשוב לאפשר את העדשה כדי לאזן לאחר תוספת של...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מלקחיים ישרים עם קצה עדין	Fine Scientific Tools	11252-40
מספריים מיקרו-דיסקציה, קצה ישר	Fine Scientific Tools	15000-00
מלקחיים מעוקלים	Fine Scientific Tools	11272-40
תפיסת מלקחיים	Hammacher	HSC 702-93
צלחת דיסקציה	Fisher Scientific	12565154
צלחת פטרי 60 מ"מ	פישר סיינטיפיק	0875713A
1x תמיסת מלח חוצץ פוספט (PBS)	Life Technologies	14190
18 x 18 מ"מ כיסויי זכוכית	פישר סיינטיפיק	12-542A
תא מדידה עם חריצים להחזקת			בהתאמה אישית (ראה <חזק>איור 1)
מראה בזווית ישרה	אופטיקה אדמונד	45-591
מקור אור	Schott/Fostec	8375
מיקרוסקופ ניתוח מואר	אולימפוס	SZX-ILLD100	עם מצלמה דיגיטלית SZ-PT Phototube
	Nikon	Coolpix 990