הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

In vivo biosensor Tracks ללא אפופטוטיים caspase פעילות תסיסנית

8.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/53992

⸱

27 בנובמבר 2016

 ,  ,  , 
1W. Harry Feinstone Department of Molecular Microbiology and Immunology, Johns Hopkins University Bloomberg School of Public Health, 2School of Life Sciences, Chinese University of Hong Kong

במאמר זה

סיכום

כדי לזהות תאים בריאים בחיות כולה המכילות רמות נמוכות של פעילות caspase, את biosensor הרגישות הגבוהה המיועד CaspaseTracker נוצרה עבור תסיסנית. Caspase-תלוי בפעילות biosensor מזוהית בתאים בריאים האריך ימים ברחבי האיברים הפנימיים של בעלי חיים בוגרים שגדלו בתנאים אופטימיזציה בהיעדר גירויי מוות.

תקציר

Caspases הם המתווכים העיקריים של מוות תאי אפופטוטי באמצעות פעילותם הפרוטאוליטית. כאשר קספאזות מופעלות בתאים לרמות הניתנות לזיהוי על ידי טכנולוגיות זמינות, ההנחה היא שאפופטוזיס מתרחש זמן קצר לאחר מכן. קספזות יכולות לבקע רכיבים פונקציונליים ומבניים רבים ולגרום להרס מהיר ומוחלט של תאים תוך מספר דקות. עם זאת, עדויות מצטברות מצביעות על כך שבתאים בריאים נורמליים לאותם קספזות יש תפקידים אחרים, ככל הנראה ברמות אנזימטיות נמוכות יותר. מחקרים על פעילות קספאז שאינה אפופטוטית נפגעו על ידי קשיים באיתור רמות נמוכות של פעילות קספאז ובמעקב אחר גורל התא הסופי in vivo. כאן, אנו מדגימים את השימוש במדווח קספאז רגיש במיוחד, CaspaseTracker, שמתייג באופן קבוע תאים שחוו פעילות קספאז בבעלי חיים שלמים. חיישן ביולוגי CaspaseTracker בצבע כפול זה in vivo עבור Drosophila melanogaster מבטא באופן חולף חלבון פלואורסצנטי אדום (RFP) כדי להצביע על פעילות קספאז אחרונה או מתמשכת, ומבטא לצמיתות חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) בתאים שחוו פעילות קספאז בכל עת בעבר אך לא מתו. חשוב לציין, חיישן ביולוגי זה התלוי בקספאז חושף בקלות את נוכחותה של פעילות קספאז לא אפופטוטית ברקמות של מערכות איברים ברחבי הזבוב הבוגר. זה מודגם באמצעות נתיחות שלמות של זבובים בודדים כדי לזהות פעילות חיישנים ביולוגיים בתאים בריאים ברחבי המוח, המעיים, צינוריות מלפיגיות, קרדיה, צינורות השחלות ורקמות אחרות. CaspaseTracker מזהה פעילות קספאז לא אפופטוטית בתאים בעלי חיים ארוכים, שכן פעילות חיישנים ביולוגיים מזוהה בתאי עצב בוגרים וברקמות אחרות לפחות 10 ימים לאחר הפעלת הקספאז. חיישן ביולוגי זה משמש ככלי חשוב לחשיפת התפקידים והמנגנונים המולקולריים של פעילות קספאז לא אפופטוטית בבעלי חיים חיים.

מבוא

Caspases הם פרוטאזות ציסטאין אשר מתווכים מוות של תאים אפופטוטיים ידי ביקוע חלבונים תאיים רבים אחרי שאריות aspartate מפתח. לדוגמה, caspases יוזם להפעיל caspases מפעיל, nucleases DNA derepress, רכיבים cytoskeletal תדבק ולשנות את הרכב השומנים של קרום התא לפרק תאי במהירות לעורר הכרה היבלעות על ידי תאים שכנים אשר לסלק את הגוויות התא. 1-4 ההערכה היא כי מיליארדי תאים מתים ליום בגוף האדם, אפופטוזיס הוא מנגנון חשוב של מוות של תאים סרטניים הנגרמת כימותרפיה. 5 סט של caspases שונה יכול לגרום מוות של תאים על ידי תהליכים שאינם אפופטוטיים ברורים כדי לעורר חסינות מולדת. 6 לפיכך, עיקר מחקר על caspases התמקד פונקציות פרו-מותם.

מעניין לציין, כי עדויות ראשוניות בתחום גילו כי באותה caspases האחראי למותו תא קידום יש גם f שאינו מוותמשיחה. המחקרים החלוציים הוכיחו כי caspases מעורבים תפקודים תאיים מגוונים בתאים בריאים, ובכלל זה הסדרת תא התפשטות והגירה במהלך embryogenesis. 7-9 caspases נדרשים עבור אינדיבידואליזציה spermatid תסיסנית 10,11, עבור חסימת מסלול מוות של תאים necroptotic חלופי בעכברים 12,13, ו לעיבוד microRNA ב C. elegans. 14,15 בשנת אולי התאים-מי שמאריך ימים ביותר, נוירונים, caspases ומכונות אפופטוטיים אחרים מעורבים בוויסות הפעילות העצבית על ידי גיזום סופים הסינפטי, תהליך האמין להיות חיוני כדי לחזק סינפסות אחרות על למידה וזיכרון. 16 18 יתכן כי caspases להקל גיזום סינפטי על ידי סוג של מיני-אפופטוזיס של תחזיות עצביות זעירות ללא מות תא כולו. 19 עם זאת, caspases יכול להיות פונקציות חלופיות שאינן קשורות לאירועים כמו אפופטוזיס. 20,21 תפקיד כפולs בחיים ומוות אינם ייחודיים caspases; BCL-2 חלבונים המשפחה ציטוכרום C יש תפקידים אנרגטיקה הסלולר בתאים בריאים אבל הם גם חלק של מסלול אפופטוטיים הליבה כי הוא מופעל על ידי סוגים רבים של מתח התא. 22-25 אמנם לא הוכח, זה נראה הגיוני שהאבולוציה מקושר יום -משרות אל משרות מוות בתוך אותו למולקולות כדי להבטיח חיסול בזמן של תאים מתאימים או לא רצויים.

נכון לעכשיו, את המנגנונים המולקולריים של פעילות caspase הלא אפופטוטיים אינם מובנים, ואת היקף פעילות caspase הלא אפופטוטיים במהלך התפתחות עוברית ברקמות למבוגרות גם אינו ידוע. אחד האתגרים הגדולים הוא הקושי להבחין-עבודות היום ממוות-עבודות של caspases. בניגוד אפופטוזיס pyroptosis, כאשר פעילות caspase מוגברת על ידי מפל פרוטאוליטים, היום-העבודות של caspases צפויות להתרחש בשעה נמוכה בהרבה רמות של פעילות אנזימטית, סביר מתחת זיהוי על ידי techn רב הזמיןologies.

לפני העבודה המוצגת כאן, ואחרים פיתחו מגוון של חיישנים ביולוגיים caspase למטרות שונות. את biosensors SCAT (למשל, ECFP-DEVD-ונוס) במהירות לזהות פעילות caspase בזמן אמת בתאים בתרבית ורקמות החיה באמצעות סריג. 26,27 עם מחשוף caspase, מחצית GFP במיקוד הגרעין של Apoliner (mCD8-RFP-DQVD- nucGFP) עובר relocalization subcellular בתוך דקות כאשר-לקשור קרום הפלזמה שלה הוא ביקע ידי caspases. 28 בדומה לכך, ApoAlert-pCaspase3-Sensor (NES-DEVD-YFP-NLS) relocalizes מן cytosol לגרעין על מחשוף caspase. 29,30 נוסף לאחרונה, chromophore ב iCasper תוכנן בחוכמה כדי לזרוח כאשר בקע ידי caspases, המתיר גילוי של פעילות biosensor בזמן אמת בנוירונים של עבר תסיסנית, אבל בעיקר בשיתוף עם מוות של תאים התפתחותי. 31 מות caspase-תלוי של נוירונים חוש הריח במהלך הזדקנות הייתה demonstעל פי דירוג של איתור חיסוני של הטופס בקע-caspase של חיישנים ביולוגיים CPV (למשל, mCD8-PARP-ונוס). 32,33 חשוב לציין, בצורה המופעלת של caspase-3 זוהתה בהעדר המוות של תאים על ידי immunostain הרגיש קוצים של נוירונים בתרבית, ובשנת סומה באמצעות הקרינה תלויה caspase של צבע כתב CellEvent הגרעיני, אך קשיים נתקלו בשל צילום רעיל, למרות מות תאים התעכב עד לאחר חיסול עמוד שדרה. 19 לפיכך, חיישנים הביולוגיים caspase חדשים יש צורך לזהות ולעקוב אחר תאים עם פעילות caspase הבזליים in vivo.

כדי להתגבר על קשיים אלה, שעוררנו biosensor caspase צבע כפול רומן, מיועד CaspaseTracker. אסטרטגיה זו משלבת גרסה שונה של biosensor Apoliner caspase-רגיש תסיסנית 28 עם מערכת תסיסנית G-TRACE FRT recombinase 34 לתייג לצמיתות ולעקוב אחר תאים in vivo. 35 המערכת G-TRACE Gal4 המופעל מאפשר רמות נמוכות מאוד של caspases להפעיל CaspaseTracker, וכתוצאה מכך ביטוי RFP בציטופלסמה וביטוי GFP גרעינית במיקוד קבוע בכל תא שאי פעם חוותה פעילות caspase. 35 מערכת זו יכולה לתייג תאים לאורך כל החיים בחיות כולו באמצעות תסיסנית, מערכת מודל ממושמע בשימוש נרחב לחקר caspases תהליכי המוות התאי. 36-38

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת זבובים CaspaseTracker

  1. כדי להכין CaspaseTracker (DQVD) זבובים לניסויים, לבצע הצלב הזה: UBI-CaspaseTracker x G-TRACE (כטב"מ-RFP; כטב"מ-FLP; Ubi>> עצירה GFP-NLS), על ידי העברת נקבה בתולה 7-10 (או זכר) זבובים נושאת את המצע biosensor caspase mCD8-DIAP1-Gal4 מונע על ידי האמרגן היוביקוויטין 35 יחד עם מספר זהה של גברים (או נשים) זבובים G-TRACE, אשר יש איזון כרומוזום ארגון הנוער הקתולי השנייה, כדי למנוע הקטלניות של שילוב הומוזיגוטים של G- TRACE (כטב"מ-RFP, כטב"מ-FLP, ו Ubi>> עצירה GFP-NLS) 34. מקום טס בקבוקון מזון טרי עם רסק שמרים טריים כמקור חלבון.
  2. דגירת קבצים על 18 מעלות צלזיוס במשך 5 עד 7 ימים (מקסימום 2 שבועות) ולאחר מכן הסר את ההורה עף מהבקבוקון להימנע צפיפות עם צאצאים חדשים, וכדי להגדיר בקבוקוני רבייה חדשים.
  3. המשך דגירה על 18 מעלות צלזיוס עד צאצאי זבובי eclose. בחר את ארגון הנוער הקתולי הלא [-ג ללאצאצאי urlY כנף] של גנוטיפ הנכונה של CaspaseTracker, שהן מהונדסות עבור אלמנטי CaspaseTracker ו- G-TRACE 35.
  4. במקביל, ליצור שליטה הלא מהונדס הורית זבובי w118 ו caspase-רגישות (DQVA) זבובים במקביל לאמת RFP CaspaseTracker הספציפי GFP קרינה.
  5. בצע genotyping PCR כדי לאשר קבצים עם CaspaseTracker באמצעות פריימרים: 5'-TCCCCCGGGCTGCAGGAATTC, 3'-TGGAATTGGGGTACGTCTAGA, ייצור מוצר 3897 נ"ב. עבור genotyping לוקוסים G-Trace, השתמש פריימרים הבאים GFP (474 ​​נ"ב), 5'-CAC GAC TTC TTC AAG TCC GCC ATG CCC G, 3'-CTT GTA CAG CTC GTC CAT GCC GAG AGT גת C; עבור RFP (258 נ"ב), 5'-GGC TGC TTC ATC TAC AAG GTG AAG TTC ATC GG, 3'-GAT GTC CAG CTT GGA GTC CAC GTA GTA GTA GC; ועבור Flpase (655 נ"ב), 5'- CCACCTAAGGTGCTTGTTCGTCAGTTTGTGG, 3'-GCC TAC TAA CGC TTG TCT TTG TCT CTG TCA .ג גנוטיפ Gal4 ב וקטור pUWR (554 נ"ב), 5'-GAA GCA CAC CTT CGC ATC GCT CAGTCA CGC, 3'-TGG AAT TGG GGT ACG TCT AGA.

2. רקמות הכנות, מכתים שם

  1. עבור וניתוחי זבוב, למנוע רקמות גזורות יידבק טיפי פיפטה פלסטיק צינורות צנטריפוגה, טיפים מעיילים וצינורות עם אלבומין בסרום שור 1% (BSA) מומסים במים.
  2. לנתח זבובים על כרית סיליקון באמצעות מלקחיים.
    1. כדי למנוע נזק קצות מלקחיים על משטח קשה בעת ביצוע לנתיחה רקמות, לבצע דיסקציה על משטח סיליקון. להכנת לוחות לנתיחת סיליקון, להמס את סיליקון בערכה המסחרית בהתאם להוראות יצרן (רשימת חומרים). לאחר המסת סיליקון, להוסיף 3 עד 4 מ"ל לצלחת בתרבית רקמה בקוטר 60 מ"מ. ניתן לעשות שימוש חוזר מנות הסיליקון.
    2. להרדים זבוב עם CO 2, ולהעביר אותו לצלחת סיליקון עם 1 מ"ל של קר PBS. הצג את CO 2 בקבוקון המכיל את הזבוב באמצעות צינורית ירי, ולאחר מכן להעביר את t הזבוב הרדיםOA Pad כי יש אספקה 2 CO.
    3. השתמש זוג מלקחיים להחזיק את הראש לטוס, וזוג נוסף של מלקחיים למשוך את החזה בכיוון ההפוך כדי לנתק את הראש לטוס מהגוף המכסה מבלי לפגוע בקשר בין הראש במעי הקדמי.
    4. שימוש 2 זוגות מלקחיים כדי להסיר את הכנפיים והרגליים מהחזה.
    5. השתמש זוג מלקחיים להחזיק את החזה, ועוד זוג מלקחיים למשוך את הבטן על מנת להפריד בינו לבין בית החזה שוב מבלי לפגוע בקשר בין במעי הקדמי ו midgut.
    6. לנתח האיברים הפנימיים כולל המוח, הבטן, tubules malpighian והשחלות כפי שהוכח בעבר. 39-41
    7. הסר את כל החלקים של לציפורן וגופי השומן עם מלקחיים כמו רקמות אלה לייצר autofluorescence החזק. סבלנות ותרגול נדרשים להכין מערכת איבר שלם כפי שמוצג.
  3. העבר רקמות גזורות 1.5 צינורות צנטריפוגה מיליליטר, ולתקן wi רקמותה 0.5 מ"ל של paraformaldehyde 4% PBS (שנאגרו מלוחים פוספט) ב RT במשך 20 עד 30 דקות עם סיבוב בחושך כדי למנוע RFP הלבנת GFP ברקמות. הימנע קיבוע ממושך שיכול להתפשר תוצאות מכתימות שלאחר מכן.
  4. הסר את paraformaldehyde ידי pipetting עדין ולשטוף 3 פעמים עם 0.5 מ"ל PBST (PBS + 0.1% Triton X-100) ב RT.
  5. Permeabilize הרקמות עם 0.5 מ"ל PBST על 4 מעלות צלזיוס לילה עם רעד עדין. incubations שורטר עלול לגרום לתוצאות permeabilization ופשרת מכתים שלמות.
    1. אם יש צורך להפחית מכתים רקע, שקול דוגרים הרקמות 0.5 מ"ל PBST עם 1% BSA, במקום PBS.
  6. שטפו את רקמות 3 פעמים עם 0.5 מ"ל PBST.
  7. כדי להכתים גרעינים אקטין פילמנטיות (F- אקטין), להחיל 0.5 מ"ל PBST עם 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​של Hoechst 33342 צבע כחול גרעיני 0.3 מיקרומטר אלקסה פלואוריד 633 Phalloidin F- אקטין כתם דגירה זמנית עם רקמות של 1 ש 'ב RT wהסיבוב העדין ה- i בחושך. הימנע מכתים ממושך כמו זה יגדיל את הרקע.
    1. עבור immunostaining, דגירה קבועים permeabilized רקמות עם 0.1% Triton X-100 ב 0.5 מ"ל PBS לילה ב 4 ° C, הכתם עם 1: 100 דילול של נוגדן anti-ELAV או עם 1: 200 דילול של caspase אנטי 3 לילה בשעה 4 ° C (300 μL). עקוב על ידי נוגדנים משני המתאים מדולל 1: 100 ו דגירה במשך 1 עד 3 שעות ב RT. ראה חומרי רשימה למידע נוגדן ספציפי.
  8. שטפו את רקמות 3 פעמים, כל 5 דקות ב 0.5 מ"ל PBST עם סיבוב עדין.
  9. עם pipet, להסיר את כל PBST, ולאחר מכן להוסיף 200 μL אנטי-אקונומיקה סוכן הרכבה (ראה חומרים) כדי לכסות רקמות לחלוטין עבור 1-3 שעות ב RT, או 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. רקמות אופטימליות אשר קלטו סוכן ההרכבה מלא תשקענה לתחתית הצינור.
  10. טרום לנקות את שקופית הזכוכית עם אתנול מים או 70% ולהעביר את הרקמות עם הרכבת סוכן אל גלאסשקופיות של.
  11. בזהירות במקום להחליק כיסוי זכוכית מעל לרקמות. החל וזלין לשקופית הזכוכית ואת הכיסוי להחליק להימנע להרוס את הרקמה על ידי overcompression. הסר סוכן הרכבה נוסף בנייר טישו.
  12. חותם את התלוש לכסות באמצעות החלת לק לאורך כל הקצוות של להחליק את המכסה כדי למנוע דליפה של הרכבת סוכנים מן הרקמות.

3. מיקרוסקופי Confocal

  1. שימוש במיקרוסקופ עלית קרינת confocal הפוך. עם זאת, עד-תקין מיקרוסקופים יכול לשמש גם. לרקמות התמונה באמצעות ריצוף, לשמור על טמפרטורת חדר יציבה כדי למנוע סחיפה של מיקוד משמרת של המטוס xy בשל התרחבות והתכווצות תרמית של רכיבים. מערכות בקרת הסביבה ומערכות פיצוי להיסחף מוקד לעזור להימנע מבעיה זו בשל אובדן שיווי משקל תרמי של מערכת מיקרוסקופ.
  2. מניחים את השקף על הבמה של המיקרוסקופ. קח כמה תמונות בדיקה באמצעות ברזולוציה נמוכה (125 x 125 פיקסלים)d לקבוע את המספר המתאים של אריחי הדרוש כדי לכסות את האזור כולו של (ROI) ריבית.
  3. הגדר את מערכת הסריקה במיקרוסקופ כדי ללכוד תמונות עם רזולוציית סריקה כגון 500 x 500 פיקסלים. בחר את המטרה כגון 20X NA 0.8 או מטרה 63X NA 1.4 Plan-Apochromat לניתוח רקמות באמצעות coverslips זכוכית, כך שכל התמונות (אריחים) חופף ב -20% על כל הצדדים.
  4. הגדר את התמונה ברצף מ ארוך ביותר עד קצרות אורכי גל עירור, כמו האור באורכי הגל ארוך יותר גורם צילום הלבנה נמוכה. רצף מ הארוך ביותר עד הקצר גל עירור הוא: (i) 633 ננומטר עבור Phalloidin F אקטין עבור נוגדנים caspases מופעל, (ii) 561 ננומטר עבור RFP, (iii) 488 ננומטר עבור GFP, וכן (iv) 405 ננומטר עבור גרעיני כתם Hoechst.
  5. במהלך הדמיה, לצמצם את החשיפה של תאים כדי עירור הלייזר פלורסנט במהלך ההדמיה תהליך להימנע צילום הלבנה על ידי הקטנת עוצמת הלייזר כדי להשיג תמונות באיכות גבוהה של הרקמות.
  6. אחרי שאניהמגים נאספים, למזג את התמונות באמצעות תוכנת מיקרוסקופ.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

ישנם שני מרכיבים מרכזיים המאפשרים CaspaseTracker כדי לזהות פעילות caspase בתאים הבריאים (איור 1 א). הראשון שבהם הוא חומצת אמינו 146 פוליפפטיד caspase-cleavable במתכונת (איור 1b) caspase biosensor Apoliner. 28 פוליפפטיד זה נגזר DIAP1 (דרוזופילה מעכב אפופטוזיס) המכיל אתר caspase יחיד טבעי כי הוא ביקע במהלך אפופטוזיס בדרך כלל DrICE ידי caspase. 42,43 DrICE שווה caspase-3 מצעים הסלולר היד...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כאן אנו מדגימים את פעולתו הבנייה הפנימית של CaspaseTracker המאפשר זיהוי של פעילות caspase בסיס נרחבת ברקמות בריאות. השלבים הקריטיים לאיתור פעילות caspase הלא אפופטוטיים in vivo הם: 1) יצירת זבובים עם transgene biosensor, 2) אימות פונקצית כתב ספציפי caspase עם בקרה נאותה, 3) תרגול טכניקות לנתיחה כדי לשמור על כל מערכות האיברים הפנימיות של תסיסנית המבוגרת, ו -4) פעילות biosensor מבדיל בין חפצי autofluorescent.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

אנו מודים Polan סנטוס דארן Obbard לאיורים תסיסנית באיור. 2a, מרסלו ג'ייקובס-לורנה לשימוש של insectary JHMRI. עבודה זו נתמכה על ידי מלגת קרן המחקר מדעי החיים (HLT), ועדת המענקים אוניברסיטת הונג קונג AoE / B-07/99 (MCF), ו- NIH מעניקה NS096677, NS037402 ו NS083373 (JMH). הו לם טאנג הוא עמית קרן Shurl וקיי קורצ'י של קרן המחקר למדעי החיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>חומרים מתכלים וריאגנטים
Vectashieldמוצרי וקטורH-1000הרכבה בינונית
מלקחייםטד פלה#505 (110 מ"מ, #5)פינצטה דומונט כיתה ביולוגיה, נירוסטה
תליית שקופיות טיפהפישר סיינטיפיק12-565Bשקופיות זכוכית
Hoechst 33342בדיקות מולקולריותH1399כתם DNA
Alexa Fluor 633 בדיקותמולקולריותA22284כתם אקטין
Rat-Elav-7E8A10 נוגדנים נגד Elavמחקרים התפתחותיים בנק היברידומה (DSHB)מזהה רישום נוגדנים:  AB_528218 כתם עבור Drosophla pan-neuronal ELAV
קספאז-3 (Asp175) נוגדן שסועאיתות תאים#9661כתם לשבר פעיל של קספאז-3
ProLong Gold מגיב אנטי-דהייהLife TechnologiesP36934לשימור פלואורופורים 
ProLong Diamond Antifade MountantLife TechnologiesP36961לשימור פלואורופורים 
ערכת אלסטומר סיליקון SylGard 182Dow Corning קוד מוצר: 0001023934עבור לוחות
Equipment
LSM780 מיקרוסקופ קונפוקליCarl ZeissN/Aהדמיה
Carl Zeiss סטריאומיקרוסקופ Stemi 2000Carl ZeissN/ADrosophila דיסקציה
AmScope סיבים אופטיים מיקרוסקופ כפול צוואר אווז, 150  WAmScopeWBM99316מקור אור
פלואידין טכנולוגיית חיתוך

מקורות

  1. Salvesen, G. S., Abrams, J. M. Caspase activation - stepping on the gas or releasing the brakes? Lessons from humans and flies. Oncogene. 23, 2774-2784 (2004).
  2. Hay, B. A., Guo, M. Caspase-dependent cell death in Drosophila. Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 623-650 (2006).
  3. Segawa, K., et al. Caspase-mediated cleavage of phospholipid flippase for apoptotic phosphatidylserine exposure. Science. 344, 1164-1168 (2014).
  4. Akagawa, H., et al. The role of the effector caspases drICE and dcp-1 for cell death and corpse clearance in the developing optic lobe in Drosophila. Dev Biol. , (2015).
  5. Souers, A. J., et al. ABT-199, a potent and selective BCL-2 inhibitor, achieves antitumor activity while sparing platelets. Nat Med. 19, 202-208 (2013).
  6. Lamkanfi, M., Dixit, V. M. Mechanisms and functions of inflammasomes. Cell. 157, 1013-1022 (2014).
  7. Bergmann, A., Steller, H. Apoptosis, stem cells, and tissue regeneration. Sci Signal. 3, re8(2010).
  8. Hyman, B. T., Yuan, J. Apoptotic and non-apoptotic roles of caspases in neuronal physiology and pathophysiology. Nat Rev Neurosci. 13, 395-406 (2012).
  9. Juraver-Geslin, H. A., Durand, B. C. Early development of the neural plate: new roles for apoptosis and for one of its main effectors caspase-3. Genesis. 53, 203-224 (2015).
  10. Arama, E., Agapite, J., Steller, H. Caspase activity and a specific cytochrome C are required for sperm differentiation in Drosophila. Dev Cell. 4, 687-697 (2003).
  11. Kaplan, Y., Gibbs-Bar, L., Kalifa, Y., Feinstein-Rotkopf, Y., Arama, E. Gradients of a ubiquitin E3 ligase inhibitor and a caspase inhibitor determine differentiation or death in spermatids. Dev Cell. 19, 160-173 (2010).
  12. Kaiser, W. J., et al. RIP3 mediates the embryonic lethality of caspase-8-deficient mice. Nature. 471, 368-372 (2011).
  13. Gunther, C., et al. Caspase-8 regulates TNF-alpha-induced epithelial necroptosis and terminal ileitis. Nature. 477, 335-339 (2011).
  14. Weaver, B. P., et al. CED-3 caspase acts with miRNAs to regulate non-apoptotic gene expression dynamics for robust development in C. elegans. Elife. 3, e04265(2014).
  15. Ge, X., et al. A novel mechanism underlies caspase-dependent conversion of the dicer ribonuclease into a deoxyribonuclease during apoptosis. Cell Res. 24, 218-232 (2014).
  16. Fannjiang, Y., et al. BAK alters neuronal excitability and can switch from anti- to pro-death function during postnatal development. Dev Cell. 4, 575-585 (2003).
  17. Ofengeim, D., et al. N-terminally cleaved Bcl-xL mediates ischemia-induced neuronal death. Nat Neurosci. 15, 574-580 (2012).
  18. Li, Z., Sheng, M. Caspases in synaptic plasticity. Mol Brain. 5, 15(2012).
  19. Erturk, A., Wang, Y., Sheng, M. Local pruning of dendrites and spines by caspase-3-dependent and proteasome-limited mechanisms. J Neurosci. 34, 1672-1688 (2014).
  20. Campbell, D. S., Okamoto, H. Local caspase activation interacts with Slit-Robo signaling to restrict axonal arborization. J Cell Biol. 203, 657-672 (2013).
  21. Feinstein-Rotkopf, Y., Arama, E. Can't live without them, can live with them: roles of caspases during vital cellular processes. Apoptosis. 14, 980-995 (2009).
  22. Li, P., et al. Cytochrome c and dATP-dependent formation of Apaf-1/caspase-9 complex initiates an apoptotic protease cascade. Cell. 91, 479-489 (1997).
  23. Lewis, J., et al. Inhibition of virus-induced neuronal apoptosis by Bax. Nat Med. 5, 832-835 (1999).
  24. Chen, Y. B., et al. Bcl-xL regulates mitochondrial energetics by stabilizing the inner membrane potential. J Cell Biol. 195, 263-276 (2011).
  25. Yi, C. H., et al. Metabolic regulation of protein N-alpha-acetylation by Bcl-xL promotes cell survival. Cell. 146, 607-620 (2011).
  26. Takemoto, K., Nagai, T., Miyawaki, A., Miura, M. Spatio-temporal activation of caspase revealed by indicator that is insensitive to environmental effects. J Cell Biol. 160, 235-243 (2003).
  27. Takemoto, K., et al. Local initiation of caspase activation in Drosophila salivary gland programmed cell death in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 13367-13372 (2007).
  28. Bardet, P. L., et al. A fluorescent reporter of caspase activity for live imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 13901-13905 (2008).
  29. Tang, H. L., et al. Cell survival, DNA damage, and oncogenic transformation after a transient and reversible apoptotic response. Mol Biol Cell. 23, 2240-2252 (2012).
  30. Golbs, A., Nimmervoll, B., Sun, J. J., Sava, I. E., Luhmann, H. J. Control of programmed cell death by distinct electrical activity patterns. Cereb Cortex. 21, 1192-1202 (2011).
  31. To, T. L., et al. Rationally designed fluorogenic protease reporter visualizes spatiotemporal dynamics of apoptosis in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 3338-3343 (2015).
  32. Florentin, A., Arama, E. Caspase levels and execution efficiencies determine the apoptotic potential of the cell. J Cell Biol. 196, 513-527 (2012).
  33. Chihara, T., et al. Caspase inhibition in select olfactory neurons restores innate attraction behavior in aged Drosophila. PLoS Genet. 10, e1004437(2014).
  34. Evans, C. J., et al. G-TRACE: rapid Gal4-based cell lineage analysis in Drosophila. Nat Methods. 6, 603-605 (2009).
  35. Tang, H. L., Tang, H. M., Fung, M. C., Hardwick, J. M. In vivo CaspaseTracker biosensor system for detecting anastasis and non-apoptotic caspase activity. Sci Rep. 5, 9015(2015).
  36. Suzanne, M., Steller, H. Shaping organisms with apoptosis. Cell Death Differ. 20, 669-675 (2013).
  37. Jenkins, V. K., Timmons, A. K., McCall, K. Diversity of cell death pathways: insight from the fly ovary. Trends Cell Biol. 23, 567-574 (2013).
  38. Sarkissian, T., Timmons, A., Arya, R., Abdelwahid, E., White, K. Detecting apoptosis in Drosophila tissues and cells. Methods. 68, 89-96 (2014).
  39. Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging. J Vis Exp. , (2010).
  40. Wong, L. C., Schedl, P. Dissection of Drosophila ovaries. J Vis Exp. , e52(2006).
  41. Tauc, H. M., Tasdogan, A., Pandur, P. Isolating intestinal stem cells from adult Drosophila midguts by FACS to study stem cell behavior during aging. J Vis Exp. , e52223(2014).
  42. Ditzel, M., et al. Degradation of DIAP1 by the N-end rule pathway is essential for regulating apoptosis. Nat Cell Biol. 5, 467-473 (2003).
  43. Li, X., Wang, J., Shi, Y. Structural mechanisms of DIAP1 auto-inhibition and DIAP1-mediated inhibition of drICE. Nat Commun. 2, 408(2011).
  44. Yi, S. X., Moore, C. W., Lee, R. E. Rapid cold-hardening protects Drosophila melanogaster from cold-induced apoptosis. Apoptosis. 12, 1183-1193 (2007).
  45. Drummond-Barbosa, D., Spradling, A. C. Stem cells and their progeny respond to nutritional changes during Drosophila oogenesis. Dev Biol. 231, 265-278 (2001).
  46. Fan, Y., Bergmann, A. The cleaved-Caspase-3 antibody is a marker of Caspase-9-like DRONC activity in Drosophila. Cell Death Differ. 17, 534-539 (2010).
  47. Fogarty, C. E., Bergmann, A. Detecting caspase activity in Drosophila larval imaginal discs. Methods Mol Biol. 1133, 109-117 (2014).
  48. Koushika, S. P., Lisbin, M. J., White, K. ELAV, a Drosophila neuron-specific protein, mediates the generation of an alternatively spliced neural protein isoform. Curr Biol. 6, 1634-1641 (1996).
  49. Albeck, J. G., et al. Quantitative analysis of pathways controlling extrinsic apoptosis in single cells. Mol Cell. 30, 11-25 (2008).
  50. Galluzzi, L., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell Death Differ. 16, 1093-1107 (2009).
  51. Holland, A. J., Cleveland, D. W. Chromoanagenesis and cancer: mechanisms and consequences of localized, complex chromosomal rearrangements. Nat Med. 18, 1630-1638 (2012).
  52. Green, D. R. Means to an end : apoptosis and other cell death mechanisms. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2011).
  53. Chau, B. N., et al. Signal-dependent protection from apoptosis in mice expressing caspase-resistant Rb. Nat Cell Biol. 4, 757-765 (2002).
  54. Lin, Y., Devin, A., Rodriguez, Y., Liu, Z. G. Cleavage of the death domain kinase RIP by caspase-8 prompts TNF-induced apoptosis. Genes Dev. 13, 2514-2526 (1999).
  55. Han, M. H., et al. The novel caspase-3 substrate Gap43 is involved in AMPA receptor endocytosis and long-term depression. Mol Cell Proteomics. 12, 3719-3731 (2013).
  56. Nakagawa, A., Shi, Y., Kage-Nakadai, E., Mitani, S., Xue, D. Caspase-dependent conversion of Dicer ribonuclease into a death-promoting deoxyribonuclease. Science. 328, 327-334 (2010).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Drosophila melanogasterחיישן ביולוגי CaspaseTrackerרפורטר פלואורסצנטימיקרוסקופיה קונפוקליתדיסקציה של רקמההכלאה גנטיתביטוי RFP GFPביקוע קספאז
In vivo biosensor Tracks ללא אפופטוטיים caspase פעילות תסיסנית
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.