במחזור כימות MicroRNA שימוש DNA מחייבת כימיה דיי PCR דיגיטלי אגל

Summary

מתוארת שיטה רגישה ומדויקת לכימות מיקרו-רנ"א נטול תאים באמצעות כימיה מבוססת צבע וטכנולוגיית PCR דיגיטלית טיפות.

Abstract

במחזור (של תא-חינם) מיקרו-רנ"א (miRNAs) משתחררים מתאי לתוך זרם הדם. סכום של מיקרו-רנ"א ספציפי במחזור נקשר למצב המחלה ויש לו פוטנציאל לשמש סמן ביולוגי למחלה. שיטה רגישה ומדויקת עבור מחזורי כימות microRNA באמצעות כימיה מבוססת לצבוע צַחצוֹחִית טכנולוגית PCR דיגיטלית פותחה לאחרונה. באופן ספציפי, באמצעות נעול חומצות גרעין (LNA) מבוססות פריימרים ספציפי מירנה עם צבע DNA מחייבת פלואורסצנטי ירוק במערכת PCR דיגיטלית תואמת אגל אפשר להשיג כימות המוחלטת של miRNAs הספציפי. כאן אנו מתארים כיצד לבצע בטכניקה זו כדי להעריך כמות מירנה נוזלים ביולוגיים, כגון פלזמה ו בסרום, הוא גם ריאלי אפקטיבי.

Introduction

MicroRNAs (miRNAs) משתחררים למחזור הדם על ידי כל תאי האורגניזם, כתוצאה משחרור פעיל או תהליכים נמקיים ואפופטוטיים. miRNAs נטולי תאים זוהו בזרם הדם כמולקולות יציבות חופשיות או מקושרות לליפופרוטאינים או עטופות בתוך אקסוזומים ומיקרו-שלפוחיות ^1-3. מאמינים שהם מתפקדים כמתקשרים תא ^{לתא 4}, וכמותם משתנה בנוכחות סרטן, הפרעות לב או מחלות אוטואימוניות ^5-7. הכימות המדויק והניתן לשחזור שלהם הוא הבסיס להערכתם כסמנים ביולוגיים של מחלות. עם זאת, מכמה סיבות שכבר תוארו במקום אחר ^8,9, כימות miRNA בסרום או בפלזמה, כמו גם בנוזלי גוף אחרים, יכול להיות מאתגר מאוד ^10,11. לאחרונה פיתחנו שיטה לכימות מוחלט של miRNAs במחזור הדם, המבוססת על פריימרים LNA ספציפיים ל-miRNA וטכנולוגיית PCR דיגיטלית של טיפות צבע קושרות DNA (ddPCR) ¹². מתודולוגיה זו יושמה לאימות סמנים ביולוגיים של סרטן השד ^{miRNA 13,14}.

לאחר החלוקה של כל מולקולת miRNA מתועתקת הפוכה בתוך טיפה בגודל ננו-ליטר, ניתן לספור את מספר העותק של כל miRNA בכל דגימה, ובעצם לספור את מספר הטיפות הפלואורסצנטיות הירוקות, ולכן החיוביות. ברגע שמתרחשת תגובת PCR, מושגת ספירה חיובית, ללא צורך בקביעת עקומה סטנדרטית או התחשבות ביעילות PCR בחישוב כמות היעד, כפי שקורה עם RT-PCR כמותי (RT-QPCR). בנוסף, ddPCR הוכיח את עצמו כרגיש ומדויק יותר מ-RT-qPCR בכימות miRNA במחזור ¹⁵. במאמר זה אנו מציגים את הפרוטוקול המפורט של מתודולוגיה זו, דנים בשלבים הרלוונטיים ביותר ובפרט בהתחשב בדגימות קליניות בסרום ובפלזמה.

Protocol

בידוד MicroRNA מ פלזמה או סרום

הערה: פלזמה והכנה בסרום הוא צעד רלוונטי במחזור כימות מירנה. לא מקיים הליך מועדף עבור פלזמה והכנה בסרום. הדבר היחיד שחשוב לקחת בחשבון הוא כי כל הדגימות מאותו הניסוי חייבות להיות מעובד באמצעות העבודה בדיוק. התחל 200 μl בסרום או פלזמה. RNA סה"כ יכול להיות מבודד סרום או פלזמה באמצעות ערכות זמינות מסחרי.

1. ניתוק פרוטוקול RNA (כולל מירנה)

1. דגימות סרום / פלזמה להפשיר על הקרח.
2. הוסף 1 מ"ל של מגיב תמוגה (למשל., QIAzol) 200 μl בסרום / פלזמה.
3. מערבבים על ידי vortexing ומניחים את שפופרת המכילה את homogenate על הספסל ב RT במשך 5 דקות.
4. הוסף 3 μl של פתרון 4.16 ננומטר של cel-miR-39-3p מירנה הסינטטי ג elegans.
5. הוסף 200 μl של כלורופורם. לנער את הצינור במרץ למשך 15 שניות. ה מקוםצינור דואר על הספסל ב RT במשך 2 דקות.
6. צנטריפוגה במשך 15 דקות ב XG 12,000 ב 4 ° C כדי להשיג הפרדת שלבים: השלב מהימי העליון מכיל RNA.
7. מעביר את השלב המימי לצינור חדש, כ -700 μl, למנוע העברה של כל חומר ביניים לבן.
8. הוסף 1 מ"ל של 100% אתנול ומערבבים על ידי היפוך.
9. Pipet למעלה 700 μl של המדגם לתוך עמוד ספין מיני דגש על צינור איסוף 2 מ"ל. סגור את המכסה צנטריפוגות ב XG 12,000 במשך 15 שניות. מחק את הזרימה דרך.
10. חזור על שלב זה באמצעות המדגם הנותר.
11. הוסף 700 μl מאגר RWT לעמודת הספין המיני, לסגור את המכסה ו צנטריפוגות במשך 15 שניות ב XG 12,000 לשטוף את העמודה. מחק את הזרימה דרך.
12. Pipet 500 μl הצפת רשתית לתוך טור הספין המיני. סגור את המכסה ו צנטריפוגות במשך 15 שניות ב -12,000 סל"ד. מחק את הזרימה דרך. חזור על פעולה זו שוב.
13. צנטריפוגה עמודת הספין המינית במלוא מהירות למשך 2 דקות כדי לייבש את טור הספיןקרום מ אתנול שיורית.
14. מעביר את טור הספין המיני לצינור 1.5 מיליליטר אוסף חדש ומי RNase ללא pipet 35 μl על הממברנה של הטור.
15. צנטריפוגה 1 דקות ב XG 12,000 כדי elute רנ"א.
16. אחסן את RNA ב -80 ° C.
    הערה: מאז ריכוז RNA לא ניתן לקבוע במדויק, משתמשים באמצעי אחסון קבוע כאמצעי עבור סכום קלט.

2. שעתוק לאחור MicroRNA

1. להפשיר את השעתוק לאחור תערובת מגיבה (RT) מרכיבים: חיץ תגובת 5x, nuclease ללא מים. מערבבים בעדינות היפוך הצינורות ומניחים על קרח. מיד לפני השימוש, להסיר את תמהיל האנזים מהמקפיא ומניחים על קרח. ספין למטה כל חומרים כימיים.
2. מכינים את תערובת מגיב RT על הקרח כמתואר בטבלה 1. הכן לפחות לערבב 10% מעבר.
3. מערבבים את התגובה על ידי pipetting, ולאחר מכן ספין למטה.
4. דגירה של 60 דקות ב 42 ג.
5. מחממים להשבית reverse transcriptase במשך 5 דקות ב 95 ג.
6. מיד לצנן עד 4 מעלות צלזיוס.
7. אחסן את cDNA ב -20 ° C.

3. cDNA דילול

1. לדלל את כמות תבנית cDNA דרושי תגובות ddPCR המתוכננות במים חינם nuclease. לדלל את התגובה cDNA בין 01:50 ו -1: 500 במים, תלוי שפע מירנה היעד. אחסן את cDNA מדולל ב -20 ° C. את cDNA בדילול הוכיח להיות יציב במשך 3 חודשים לפחות ב -20 ° C.

דור אגל 4. PCR

הערה: דור אגל צריך להתבצע ב -8 דגימות בכל פעם. משכפל טכני אינו נדרש, בשל השחזור הגבוה של טכנולוגיה זו ^12,15 .א אין שליטת תבנית (NTC) מדגם צריך לרוץ בכל צלחת עבור כל תנאי ddPCR שונים.

1. להפשיר לאזן את תערובת מאסטר (למשל., מיקס מאסטר EvaGreen), סט פריימר microRNA ו cDNA ב RT.
2. מערבבים את ה מיקס מאסטרoroughly על ידי היפוך הצינור מספר פעמים. ספין למטה כל חומרים כימיים.
3. מכינים את תערובת ddPCR כמתואר בטבלה 2. כאשר התגובות ddPCR מרובים מבוצעות, להכין ddPCR לערבב-פתרון עובד. הכן לפחות 10% בתמהיל יעלה.
4. לאחר ההרכבה, ומערבבים היטב ומסובב תמהיל ddPCR.
5. לוותר 12 μl של ddPCR לערבב לתוך צלחת 96-היטב PCR או צינורות PCR.
6. הוסף 8 μl של תבנית cDNA מדולל על צינור אחד / היטב.
7. הכנס את המחסנית גנרטור אגל לתוך מחזיק.
8. העביר 20 μl של כל דגימה מוכנה בארות המדגם (בשורה אמצעית) של מחסנית גנרטור אגל בזהירות תוך הימנעות בועות אוויר בתחתית הבאר.
9. ממלאים כל באר נפט (בשורה התחתונה) עם 70 μl של שמן גנרטור רביב.
10. הוק אטם על בעל מחסנית ולהכניס לתוך הגנרטור רביב.
11. סגור את המכסה כדי להתחיל דור אגל על ​​פי יחסי הציבור של היצרןotocol. כאשר דור אגל סיים, לפתוח את המכסה, הסר את האטם הפנוי. הבארות העליונות של המחסנית להכיל את הטיפין.
12. Pipet לאט חלקה 40 μl של התוכן שמונה הבארות העליונות (הטיפין) לתוך עמודה אחת של צלחת 96-היטב PCR.
13. חותם את הצלחת PCR ברדיד מיד לאחר העברת טיפות כדי למנוע אידוי. השתמש חותמות צלחת רדיד לנקבה התואמות את המחטים בקורא רביב.
14. בגין רכיבת תרמית (PCR) בתוך 30 דקות של איטום הצלחת.
15. בצע את פרוטוקול האופניים לפי טבלה 3.

5. קריאה אגל

1. כוח על הקורא רביב.
2. הזז את הצלחת מן Cycler התרמית לקורא רביב.
3. מניחים את הצלחת ה- PCR 96-היטב המכיל את טיפות שלאחר PCR לתוך הבסיס של בעל צלחת.
4. הנח את החלק העליון של בעל צלחת על צלחת PCR. קש הוא לשוניות השחרור היטבמטה כדי לאבטח את הצלחת ה- PCR במחזיק.
5. הפעל את התוכנה ממחשב המערכת.
   1. לחץ על הגדרה כדי להגדיר את הניסוי (כימותים מוחלטים) ולאחר מכן לחץ על הפעל כדי להתחיל בקריאת רביב.
   2. כאשר קריאת האגל הושלמה, לחץ על "נתח" כפתור כדי לפתוח ולנתח את הנתונים.
   3. השתמש העלילה משרעת 2D בתוכנת הניתוח כדי לבחור את הטיפין החיוביות (כלי הלאסו) (איור 1 ב).
   4. השתמש בכרטיסיית האירועים כדי לבדוק את מספר טיפות חיוביות ומוחלטות. מספר כולל של 18,000 - 21,000 טיפות מושג בדרך כלל עם probeless ddPCR.
   5. לאחר הטיפין החיוביות נבחרות, לייצא את ערכי ריכוז מירנה באמצעות אפשרות .csv היצוא מכרטיסיית הריכוז.

Results

הסכום המוחלט של miRNAs ספציפי לכל מיליליטר של פלזמה או בסרום ניתן לקבוע באמצעות צבע DNA מחייבת ניאון ירוק אַגְלִיל הטכנולוגיה PCR דיגיטלי. איור 1 מציג את התהליך של סלקציה חיובית-טיפות, אשר קובע את הריכוז מירנה הסופי (עותקים / μl ) ב תגובת ההגברה מחושבת על ידי תוכנת הניתוח. הסכום של כל מירנה בדם שונה מאוד, להיות כמה מיני מירנה שופעים יותר מאחרים. באמצעות cDNA 01:50 מדולל התגובה ddPCR אפשר להשיג מספר מספיק של טיפות חיוביות ושליליות. ...

Discussion

miRNAs במחזור הנוכחים בדם בריכוזים נמוכים מאוד וכמות רנ"א שיכול להיות מופקת דגימות פלזמת בדם היא נמוכה. מסיבה זו, הם קשה לכמת עם טכניקות אחרות כגון microarray וסדר RNA. יתר על כן, קיימת חוסר כללי של הסכם על נורמליזצית נתונים ואת הנוכחות של miRNAs "ייחוס" אנדוגני בדם. בהקשר זה, טכנולוגיה רגישה כמו אגל דיגיטלי PCR, מסוגל לספור את מספר העותקים מירנה לכל מ"ל של סרום או פלזמה גם אם נמוך מאוד, הוא מאוד אטרקטיבי. אנחנו לזווג טכנולוגיה זו עם מערכת cDNA אוניברסלית הפוכו...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
miRNeasy Mini Kit	Qiagen	217004	עמודות עבור RNA כולל, כולל miRNA, מיצוי מסרום/פלזמה
100 nmole RNA oligo Cel-miR-39-3p	טכנולוגיות DNA משולבות	מותאם	אישית: UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG
ערכת סינתזת cDNA אוניברסלית II, ערכת 203301 Exiqon 8-64 rxns			לשעתוק הפוך של microRNA
סט פריימר MicroRNA LNA PCR 	Exiqon	204000-206xxx ו-2100000-21xxxxx	פריימרים להגברת miRNA בתוך טיפות
מחולל טיפות QX200	BioRad	186-4002	מכשיר המשמש לקריאת טיפות
קורא טיפות QX200	BioRad	186-4003	מכשיר המשמש ליצירת טיפות
תוכנת QuantaSoft BioRad		186-3007	תוכנה לאיסוף וניתוח נתונים
אוטם צלחת PX1 PCR	BioRad	181-4000	אוטם צלחות
DG8 מחסניות מחולל טיפות ואטמים	BioRad	186-4008	מחסניות המשמשות לערבוב דגימה ושמן ליצירת טיפות
QX200 ddPCR EvaGreen supermix	BioRad	186-4033/36	PCR supermix
QX200 טיפות מחולל שמן עבור EvaGreen צבע	BioRad	186-4005	שמן לייצור טיפות