ספציפי כריכת נוגדן עבור קאפה (Vκ) שרשרת המכילה באור אנושי (IgM) נוגדנים: Polysialic החומצה (PSA) מצורפים NCAM כמקרה מבחן

סיכום

אנו מציגים פרוטוקול לזיהוי חלקיקי חלבון המכילים אנטיגנים לנוגדני IgM אנושיים ועכברים עם שרשראות קלות ספציפיות של קאפה (Vκ). פרוטוקול זה אינו מוגבל לנוגדנים מסוג IgM אלא חל על כל האיזוטיפים של אימונוגלובולין המכוונים לאנטיגן שלהם עם זיקה גבוהה מספיק במהלך משקעים חיסוניים.

תקציר

נוגדנים של איזוטיפ IgM מוזנחים לעתים קרובות כטיפולים פוטנציאליים בניסויים בבני אדם, מודלים של בעלי חיים של מחלות אנושיות וכן חומרים לאיתור בטכניקות מעבדה סטנדרטיות. לעומת זאת, מספר IgM אנושיים הוכיחו יעילות במודלים סרטניים ומודלים של הפרעות במערכת העצבים המרכזית, כולל טרשת נפוצה (MS) וטרשת אמיוטרופית צידית (ALS). הסיבות לחוסר התחשבות בהן כוללות קשיים לבטא, לטהר ולייצב נוגדנים מסוג IgM, אתגר בזיהוי אנטיגנים (שאינם חלבונים), קשירת זיקה נמוכה ופערי ידע בסיסיים במחקר פחמימות ושומנים.

כתב יד זה משתמש ב-HIgM12 כדוגמה כדי לספק פרוטוקול מפורט לזיהוי אנטיגנים על ידי כתמים מערביים, משקעים חיסוניים ואימונוציטוכימיה. HIgM12 מכוון לחומצה פוליסיאלית (PSA) המחוברת למולקולת ההידבקות של התא העצבי (NCAM). רקמת מוח מוקדמת של עכברים לאחר לידה מעכברים מסוג בר (WT) ו-NCAM נוקאאוט (KO) חסרי שלושת גרסאות החיבור העיקריות של מערכת העצבים המרכזית (CNS) NCAM180, 140 ו-120 שימשה להערכת החשיבות של NCAM לקשירה ל-HIgM12. עיכול אנזימטי נוסף של רקמת מערכת העצבים המרכזית ותאי מערכת העצבים המרכזית המתורבתים באמצעות אנדונורמינידאזות הוביל אותנו לזהות PSA כאפיטופ המקשר הספציפי ל-HIgM12.

מבוא

נוגדנים של אלוטיפ IgM להפגין פוטנציאל טיפולי רב לטיפול במחלות שונות, כולל סרטן והפרעות במערכת העצבים המרכזית ^1-7. הקבוצה 'Vollmers זיהתה נוגדנים רבים בקרב חולי סרטן לשימוש פוטנציאל לשמש כסמנים ביולוגיים או רפוי פעיל-גידולים ספציפיים המסוגלים להרוג תאים ממאירים על ידי גרימת מסלולי אפופטוטיים ^4,8,9. המעניין לשים לב שכל הנוגדנים המזוהים עם פוטנציאל טיפולי הם של אלוטיפ IgM ולהשתייך לקבוצה "נוגדנים עצמיים טבעיים" (חטיף).

בדומה לכך, הקבוצה של רודריגז מזוהה עכבר נוגדנים אנושיים המעודדים מיאלין מחדש בנגעי חוט שדרת demyelinated הכרוני במודלים של טרשת נפוצה (MS). זהה נוגדנים עם השפעות נוגדות סרטן, כל הנוגדנים לקידום מיאלין מחדש הם nabs ושל אלוטיפ IgM ^1,6,7,10. אנטיגנים המדויק IgMs המזוהה ביותר עדיין undetermineד כולל נוגדן אנושי לקידום מיאלין מחדש rHIgM22, כרגע בשלב הראשון של הניסויים הקליניים של חולים בטרשת נפוצה ^11. למרות מאמצים חוזרים ונשנים על ידי מומחים בתחום של מחקר שומנים פחמימות הן את ההגדרה האקדמית בשיתוף עם התעשייה ^11, מנסה לזהות אנטיגן של rHIgM22 לא הוכתרו בהצלחה. הכישלון של טכניקות סטנדרטיות המשמשות לזיהוי אנטיגנים של נוגדני IgG לעבוד עם נוגדני IgM מזהה צורך קריטי כדי לחדד שיטות ספציפיות נוגדנים אלה כי היעד הסביר ביותר אנטיגנים פחמימות או שומנים.

ההתמקדות של כתב היד הזה היא נוגדן משובי אדם HIgM12 ואת הפרוצדורות המשמשות לזיהוי אנטיגן שלה. נוגדן HIgM12 זוהה מחולים עם macroglobulinemia של Waldenstrom, מגרה תולדה neurite במבחנה ^12-14 וממקד חומצה polysialic (PSA) מחוברת מולקולת הידבקות התא העצבי (PSA-NCAM) ^15,16. HIgM12 ומאריכה את תוחלת חיים במודל של עכברים של ALS ¹⁷ ומשפרת תוצאה תפקודית בנגיף encephalomyelitis בעכברים של Theiler (TMEV) עכברי -infected. באופן ספציפי, HIgM12 מגרה פעילות מוטורית אופקית ואנכית ספונטנית demyelinated כרוני מספרי עכברים ועליות של אקסונים בחוט השדרה בקוטר קטן ובינוני שמונה שבועות לאחר מנה אחת, נמוכה של intraperitoneal מוזרקת נוגדן ^18.

מולקולת הידבקות תא העצבית (NCAM) היא גליקופרוטאין של אימונוגלובולינים (איג) הביעו superfamily על פני התא של הנוירונים, גליה, שרירי שלד, תאי הרג טבעי ^19-25. השלושה isoforms NCAM הגדול כינת NCAM180, NCAM140, ו NCAM120, הם וריאנטים אחוי חלופה של תמליל עיקרי להשתנות רק בתחום ציטופלסמית שלהם. בתוך מערכת העצבים המרכזית, NCAM היא מולקולת polysialylated הגדולות (> 95%) עם ארוך, homopolymers חומצה sialic טעונים שלילית. PolysialicCID עם n> 10 נקרא PSA אבל מבני oligomeric קצרים קיימים כי הם גם ביולוגיים רלוונטיים. חלבונים polysialylated אחרים הביעו במערכת העצבים המרכזית הם SynCAM1 ^26, Neuropilin-2 (מפד"ל-2) ^27,28 ו למקטע ערוץ נתרן ²⁵ (לסקירה ראה ^29).

השיטות שתוארו כאן ניתן לזהות אנטיגן עבור אימונוגלובולינים האדם והעכבר המכיל ספציפי קאפה (Vκ) שרשראות אור (VκI, VκIII או VκIV שרשראות אור עבור נוגדנים אנושיים ורשתות אור VκI נוגדנים העכבר) אינו מותנה של אלוטיפ של נוגדן (למשל, IgG, IgM , IgA, IGD או IgE). מגבלה זו מבוססת על שימוש של agarose L חלבון עבור immunoprecipitations עם נוגדנים של אלוטיפ IgM. אסטרטגיות חלופיות יכולות לכלול לקטינים מחייב מנוז ונוגדנים אנטי-IgM IgG משני קשור קוולנטית agarose חרוזים, אשר עשוי להרחיב את תחולת בשיטה זו כדי נוגדנים יותר IgM including אלה עם למבדה (λ) שרשראות אור (ראה דיון). יחסי חלק מרשתות אור בסרום IgM Vκ לעומת שרשראות אור λ IgM נגזר אנשים בריאים הם 1.5: 1 ^30.

בהתבסס על המתודולוגיה chromatographic משמשת כאן כדי להפריד, להעשיר אימונולוגית לזהות מולקולות מסוימות ^31, כל אנטיגנים נדרשים לכלול לפחות תחום חלבון קטן אחד. את epitope מחייב הספציפי של הנוגדן יכול להיות בתוך או מחוץ לתחום החלבון (לדוגמא, ב גליקופרוטאינים, ליפופרוטאינים). צעדים ביוכימיים ראשוני המשמש לזיהוי אנטיגן ספציפי עבור HIgM12, בהתאמה כדי לצמצם את רשימת המועמדים הפוטנציאליים, הם הצעדים החשובים ביותר בשיטה זו. סוג תא הכנות ספציפיות אפיונים מבוססי תאי מורפולוגיה מתוארות ביחס ותאי גלייה אבל מתודולוגיה זו ניתן להסיק על להכיל סוגי תאים אחרים בתוך או מחוץ למערכת העצבים המרכזית.

ישן דחוףצריך לפתח טכניקות חדשות או שונות ישימות עבור המספר הולך וגדל של נוגדני IgM עם פוטנציאל טיפולי להפרעות אנושיות שונות במיוחד באותם מקרים (רוב אנטיגנים IgM) שבו הנוגדן המכוון הם מבני פחמימות או שומנים.

פרוטוקול

פרוטוקולים ונהלים בעלי חיים בוצעו בהתאם המכונים הלאומיים הנחיות בריאות אושרו על ידי הוועדה לטיפול ולשימוש בבעלי חיים המוסדית של Mayo Clinic (מספר פרוטוקול מאיו IACUC # A51912).

1. הכנת רקמות הכללית CNS

1. צור לקוי NCAM (KO) עכברים על רקע C57 / BL6 (בתנאי בחביבות על ידי ד"ר לין Landmesser, אוניברסיטת קייס ווסטרן ריזרב, קליבלנד, אוהיו), עכברים NCAM הטרוזיגוטיים וסוג בר (WT) להמלטה (C57 / BL6) על ידי חציית heterozygotes. Genotyping של עכברי NCAM KO תואר בעבר ^32-34 ולא יהיה סביר בפירוט נוסף.

הערה: שלבי 1.2 - 1.6 הם אופציונליים.

2. לפני הניתוח, לנהל פתרון pentobarbital (במלאי: 25 מ"ג / מ"ל; 50/100 μl של pentobarbital לשלבים בוגרים בהתאמה לאחר הלידה המוקדמת) באמצעות זריקה intraperitoneal (מחט מד 27 ו 1 מ"למַזרֵק).
3. חכה 2 דקות או עד שהחיה הגיע במטוס כירורגית של הרדמה. נהל הרדמה נוספת לפי צורך במהלך כל פעולה כדי לשמור על מטוס של הרדמה כירורגית. השתמש בשיטת בוהן קמצוץ-בתגובה לקבוע עומק ההרדמה. בעלי החיים חייבים להיות מגיבים לפני שתמשיך.
4. הכן 0.5 - חתך לרוחב 1 ס"מ דרך integument ואת דופן הבטן ממש מתחת לצלעות. בזהירות להפריד את הכבד מן הסרעפת. ביצוע חתך קטן הסרעפת באמצעות מספריים מעוקלים, בוטים. המשך החתך הסרעפת לאורך כל אורכו של בית החזה כדי לחשוף את חלל פלאורלי.
5. מניחים מעוקל, מספריים קהים לאורך צד אחד של כלוב הצלעות, דחקו את הריאות בזהירות, ולעשות חתך דרך עד לצלעות על עצם הבריח. ביצוע חתך דומה בצד הנגדי. הרמת החזה משם, בזהירות לקצץ את כל רקמת חיבור זה ללב.
6. עושים חתך לבעל החיים'S עלייה ימנית באמצעות מספרי איריס ליצור כמו גדול לשקע ככל האפשר. לאט לאט להזריק 10 מ"ל של בופר פוספט (PBS) לתוך החדר השמאלי של בעל החיים (אור אדום; קצב הזרימה: 1 מ"ל / דקה) באמצעות מזרק 10 מ"ל מצויד במחט 27-מד. אין להגדיל את זרימת לחץ / PBS במהלך זלוף כדי למנוע הרס רקמות.
7. לערוף עכברים בילוד באמצעות מספריים כירורגיות.
8. הסר את המוח על ידי גרירה של ארובות עיניים עם מלקחיים על ידי החדרת מספריים קטנים לתוך עמוד השדרה. חותכים את הגולגולת לכיוון חזית בגובה האוזניים. לקלף בחזרה את הגולגולת ומניחים בעדינות את המוח לתוך צלחת פטרי 60 מ"מ מלא 10 מ"ל של מדיום לנתח קר כקרח על הקרח (טבלה 1). מניחים כל המוח בתוך שפופרת microcentrifuge 1.5 מ"ל ומיד לאחסן על קרח יבש (-79 ºC).
9. לחתוך את גזע המוח הקטן והמוח מן המוח הקפוא באמצעות סכין גילוח נקי על קרח. לעבוד במהירות כדי למנוע הפשרת הרקמה.
10. לשקול אתהמוח הגדול קפוא, להכניס צינור 15 מ"ל על קרח להוסיף למאגר תמוגה קר כקרח (ראו טבלה 1) לריכוז סופי של 150 מיקרוגרם ברקמת המוח לכל מאגר μl תמוגה. חזור על הפעולה עבור הנותרים cerebra. שומר את המוח על קרח בכל העת לצעדים 1.9 - 1.11.
11. Homogenize המוח חיץ תמוגה על ידי טחינה דקה באמצעות קצה פיפטה 1 מ"ל (10 פעמים) ואחריו טחינה דקה באמצעות מזרק 5 מ"ל מצויד במחט 27-מד (10 פעמים). דגירה lysates המוח למשך 30 דקות נוספות על הקרח כדי לאפשר תמוגה רקמה שלמה.
12. הסר שומנים חומר דטרגנט-מסיס והמוח דרך צנטריפוגה סדרתי (ארבעה סיבובים 19,000 XG במשך 10 דקות ב 4 ° C). מחק (לבנה) המיאלין ופסולת תא המכילה גלולה, אך נשמר supernatant אחרי כל צעד צנטריפוגה. lysates המוח Aliquot ולאחסן ב -80 ºC.

2. Immunoprecipitations שימוש אדם IgMs (HIgM12 ו isotype שליטת IgM) בתור סוכן "נפתח" מ Cerebral Lysates של WT ו NCAM KO עכברים

1. L חלבון Agarose ביד הכנה ^9,35,36
   1. הכן 200 מ"ל של חיץ IP כולל BSA (ראו טבלה 1). הכן עוד 200 מ"ל של חיץ אותו IP ללא BSA.
   2. לכל העברה התגובה immunoprecipitation 100 μl של slurry חלבון L Agarose בעזרת פיפטה 200 μl לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מ"ל. האם לא חרוזים agarose מערבולת חלבון L! הוסף 1 מ"ל של חיץ IP (ראו טבלה 1) על צינור אחד. מערבבים חלבון agarose L חיץ IP באופן ידני באמצעות היפוך (חמש פעמים).
   3. חרוזים agarose חלבון L לשטוף ארבע פעמים על ידי צנטריפוגה בצנטריפוגה benchtop (1,000 XG, 2 דקות, 25 ºC). תוריד supernatant בעזרת פיפטה 200 μl מבלי להפריע גלולה agarose. שטיפה חוזר על שלבי 2.1.2 עד 2.1.3 שלוש פעמים נוספות.
   4. לאזן agarose L חלבון ב 1 מ"ל של חיץ IP הוסיף טרי על מכבש לילה ב 4 מעלות צלזיוס.
2. גיבוש הרכב נוגדן-אנטיגן-Agarose L וזיהוי Antigen ב כתמים מערביים
   1. דגירה 30 מ"ג של רקמת המוח lysed (~ 200 lysate μl) ב 1 מ"ל של חיץ IP קר כקרח עם 20 מיקרוגרם של נוגדנים IgM (HIgM12) בצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל לילה על מכבש ב 4 ºC.
   2. ספין למטה חרוזים חלבון L agarose (משלב 2.1.4) בצנטריפוגה benchtop למשך 2 דקות XG ב 1000, 4 ºC. בטל supernatant בעזרת פיפטה 200 μl מבלי להפריע גלולה agarose. מוסיפים את פתרון lysate נוגדן-המוח צונן (משלב 2.2.1) אל agarose חלבון L בעזרת פיפטה 1 מ"ל.
   3. לדגור על השעיית agarose נוגדן-אנטיגן חלבון L עבור שעה 2 על מכבש ב 4 ºC. שטוף את הרכב הנוגדן-אנטיגן המצורף agarose L באמצעות צנטריפוגה XG ב 1000 למשך 2 דקות, 4 ºC. בזהירות להתעלמות supernatant מבלי להפריע גלולה ולהוסיף 1 מ"ל של חיץ IP קר כקרח המכיל 0.2% BSA.
   4. חזור על שלב הכביסה עוד פעם אחת באמצעות חיץ IP קר כקרח המכיל BSA 0.2% ושתי פעמים נוספות באמצעות חיץ IP קר כקרח ללא BSA.
   5. ספין למטה הרכב נוגדן-אנטיגן המצורף agarose L XG ב 1000 למשך 2 דקות, 4 ºC. בטל supernatant לחלוטין ראשון בעזרת פיפטה 200 μl עד ~ 50 μl של פתרון נותרים על גבי גלולת agarose חלבון L ואחריו פיפטה 10 μl. שמור על דגימות קרח.
   6. הוסף 40 μl של חיץ elution IP (ראה טבלה 1) לכל 1.5 מיליליטר צינורות microcentrifuge, צינורות קפיצים אצבע 6 פעמים וחומות במשך 5 דקות ב 95 מעלות צלזיוס. שימו דגימות קרח למשך 2 דקות ו ספין למטה במשך 30 שניות 13,000 XG, 4 ºC.
   7. העברת supernatant בעזרת פיפטה 10 μl (~ 35 סך μl) לתוך צינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge טרי מבלי להפריע הגלולה. אשר בהעדר חרוזים agarose חלבון L ידי שטיפה למטה כמות קטנה של המדגם eluted בכותל אבוב.
      הערה: "גרגירים"חרוזי חלבון L agarose גלויים לעין אם הוא קיים.
   8. אם חרוזים agarose חלבון L נוכחים, ספין למטה מדגם למשך 30 שניות ב -13,000 XG ולהעביר supernatant לנקות צינור. חזור על שלב עד אין חרוזי agarose ניתנים לזיהוי.
   9. טען 10 - 20 μl של דגימות eluted לכל טוב על ג'ל SDS-polyacrylamide במערכת חיץ טריס / גליצין / SDS (ראו טבלה 1).
      הערה: השתמש 7.5% או 4 - 20% ג'ל שיפוע עם נפח העמסה 50 μl לכל טוב לצורך זיהוי של PSA-NCAM או isoforms NCAM (מידות ג'ל (עובי x L x W: 8.6 x 6.7 x 0.1 ס"מ).
   10. ג'ל לרוץ ~ 1 שעות ב -100 V (1.74 V / ² ס"מ) על benchtop. קירור נוסף אינו נדרש בשלב זה ^37,38.
   11. חלבוני העברת PVDF (פלואוריד polyvinylidene) קרום (הגודל נקבובי 0.45 מיקרומטר) עבור 2.5 שעות בחדר הקר ב -100 V (1.74 V / ² סנטימטר) באמצעות חיץ העברה קר (5 - 10 ºC) (ראה טבלה 1).
   12. ממברנות חסומות wה- i 10% (w / v) אבקת חלב יבש ב PBS-T עבור שעה 1 ב 25 ºC על שייקר המעבדתיים מסלולית, לשטוף ממברנות פעמיים במשך 10 דקות עם PBS-T ו- החללית לילה עם הנוגדן העיקרי BSA 5% PBS- T על שייקר מסלולית בחדר הקר.
   13. השעה אחת ממברנות לשטוף למחרת בבוקר בקצרה עם עודף PBS-T ב -25 ºC (כולל מכסה מיכל) ואחריו 3 שוטף עם PBS-T במשך 10 דקות כל אחד על שייקר מסלולית (80 סל"ד) (כל שלבי הכביסה מתבצעים בבית 25 ºC).
   14. הוספת נוגדנים משני (peroxidase חזרת (HRP), מצומדות אנטי אנושי נוגדנים נגד IgM (עבור HIgM12) (דילול 1: 30,000) ב 5% אבקת חלב יבש ב PBS-T עבור 1 שעות בשעה 25 ºC על שייקר מסלולית (70 סל"ד ).
   15. ממברנות לשטוף בהרחבה פעם אחת בקצרה עם עודף PBS-T ב -25 ºC (כולל מכסה מיכל) ואחריו 3 שוטף עם PBS-T במשך 10 דקות כל אחד על שייקר מסלולית (80 סל"ד) (כל שלבי הכביסה מבוצעים במהירות של 25 ºC) .
   16. מערבבים 1 מ"ל של chemiluminescen משופרת מצונןרכיב המצע ce HRP (מגיב לומינול משופר) עם 1 מ"ל של B רכיב (מגיב חמצון) (מחיר כתם מיני) ב 25 ºC.
   17. שימוש במלקחיים פלסטיק להעביר את הקרום על מגבת נייר כדי להסיר עודפי נוזלים (להחזיק אותם בקצוות מאוד). מכולות יבשות עם מגבות נייר ממברנות לשים בחזרה המכולות (אחד לכל ממברנה). מיד להוסיף 2 מ"ל של המצע HRP chemiluminescence משופרת טרום מעורבת (מתחם A + B) (שלב 2.2.16.) לכל הממברנה דגירה במשך 2 דקות ב 25 מעלות צלזיוס על שייקר מסלולית (90 סל"ד). הפכו ממברנות בטוח הם טבולה אחידה על ידי הגיב chemiluminescence.
   18. העברת ממברנות לתוך שרוול פלסטיק שקוף להסיר בועות נוזל ואוויר עודפות במגבות נייר. שים ממברנות בשרוול פלסטיק קלטת סרט ובסופו של דבר ידביק את שרוול הפלסטיק לתוך הקלטת. סגור את הקלטת.
   19. קח את הקלטת, סרט, טיימר ומספריים לתוך החושך. חותכים בפינה הימנית העליונה מכל fiLM למטרות אורינטציה, לחשוף סרטים (שונים) לתקופות זמן שונות (10 שניות, 1 דקות, 10 דקות) ולפתח סרטי מפתח בסרט.

3. Endoneuraminidase-NF עיכול של PSA מצורף NCAM ³⁹

1. תקציר lysed המוח רקמות מיום הלידה (P) 7 עכברים WT ו P7 NCAM KO עכברים (שהוכן צעד 1.12) עבור 2 שעות על הקרח באמצעות endoneuraminidase-NF (Endo-NF) כפי שמודגם בטבלה 2 ^39.
2. הוסף 5 μl של חיץ מדגם 4x Laemmli על צינור אחד (1 - 6) משלב 3.1 (טבלה 2).
3. דגימות טענו על 4 - ג'ל SDS-polyacrylamide שיפוע 20% וחזרו על שלבי 2.2.10 עד 2.2.19. ממברנות Probe עם HIgM12 (1 מיקרוגרם / מ"ל), זמינים מסחרית מב אנטי PSA (שיבוט 2-2B) (1 מיקרוגרם / מ"ל) ו β-אקטין נוגדן (טעינה מלאה) (1 מיקרוגרם / מ"ל) BSA 5% ב PBS -T.

4. הכנת עכברוש ותרבויות עכבר CNS

1. הכנת זכוכית Coverslips
   1. coverslips זכוכית חומצה לשטוף 25 מ"מ 1 M HCl ב 50 - 60 ºC 4 - 16 שעות במנדף באמצעות מיכל זכוכית. להתסיס coverslips לעיתים דרך מתערבל עדין.
   2. לשטוף כוס coverslips בהרחבה במים מזוקקים (3x). הקפד לשטוף את החומצה בין coverslips המוערם.
   3. יש לשטוף coverslips באתנול 100% ולייבש אותם על Parafilm במנדף תרבית תאים. יום אחד לפני השימוש, לחמם את coverslips זכוכית למשך 24 שעות במיכל זכוכית עם מכסה ב -100 ºC בתנור.
   4. שים coverslips זכוכית בצלחת 6-היטב מעיל עם 3 מ"ל של 40 מיקרוגרם / מ"ל ​​פולי- D- ליזין במים סטריליים עבור שעה 1 ב 37 ºC.
   5. פעמיים לשטוף עם מים סטריליים, להתייבש לחלוטין מתחת למכסה המנוע תרבית תאים ולהחיל אור UV במשך 20 דקות.
2. הכנת פלסטיק בתרבית רקמה תאים CNS
   1. מעיל 60 מ"מ צלחות תרבית תאים או 75 ס"מ ² רקמות התרבות צלוחיות עם 3מ"ל מ"ל או 10, בהתאמה, של 40 מיקרוגרם / פולי-D- ליזין מ"ל מים סטריליים עבור שעה 1 ב 37 ºC.
   2. שטפו פעמיים עם מים, להתייבש לחלוטין מתחת למכסה המנוע תרבית תאים ולהחיל אור UV במשך 20 דקות.
3. מעורבב עכברוש בידוד גליה ⁴⁰
   1. להרדים חולדות ילודות ב IACUC אושר קאמרי המתת חסד מכרסמת עם תחילת אספקה _​​2 CO (מלא automatized). השתמש בשיטת בוהן קמצוץ-בתגובה לקבוע את בעיית חוסר התגובה של החיה. לערוף עכברוש ספראג Dawley בילוד (P0P1) (6 - 10 גורים בכל פעם).
   2. הסר את המוח על ידי גרירה של ארובות עיניים עם מלקחיים על ידי החדרת מספריים קטנים לתוך עמוד השדרה. חותכים את הגולגולת לכיוון חזית בגובה האוזניים. לקלף בחזרה את הגולגולת ומניחים בעדינות את המוח לתוך צלחת פטרי 60 מ"מ מלא 10 מ"ל של מדיום לנתח קר כקרח על הקרח (ראו טבלה 1).
   3. חזור על הפעולה עבור הנותרים גורי חולדה (6 - 10 גורים). שמור רקמות על קרח למשך צעדים 4.3.2 - 4.3.7.
   4. מחלקים את המוח הגדול לאורך קו האמצע לשתי אונות המוח ובהמשך לנתק נורות חוש הריח, הגרעינים הבזליים מתחת קליפת המוח ואת ההיפוקמפוס עם מלקחיים דומון. מניח את קליפת המוח המבודדת בצלחת פטרי המכילה נקיה לנתח בינוני על קרח.
   5. קח קליפה אחד. הסר את קרומי המוח עם מלקחיים עם עצות קנס תחת מיקרוסקופ לנתיחה.
   6. חזור עם הקורטקס הנותר. מניחים את כל הקורטקס ללא קרומי המוח לתוך אחד צלחת נקייה פטרי על הקרח.
   7. שלב ההמיספרות קליפת המוח מכל הגורים בצלחת פטרי 60 מ"מ ולהשתמש סכין גילוח סטרילי לקוביות רקמת המוח לתוך 1 מ"מ טחון חתיכות.
   8. מעבירים את רקמת המוח טחון בעזרת פיפטה 10 מ"ל לתוך בקבוק זכוכית סטרילית, ללא ציפוי 500 מ"ל ולהוסיף 10 מ"ל של מדיום לנתח קר כקרח לכל המוח עכברוש. מערבולת בעדינות את הבקבוק תוך הוספת 1 מ"ל של תמיסת טריפסין ב HBSS (תמיסת מלח מאוזן של האנק) (5 מ"ג / מ"ל ​​טריפסין) עד 9 מ"ל של HBSS לכל המוח עכברוש. מוסיפים 2% מהנפח הכולל בתמיסה DNase אני (1 מ"ג / מ"ל) ו -2% מכלל נפח בתמיסה MgSO ₄ (3.82% MgSO ₄ ב HBSS (w / v)) על השעיית המוח רקמות לערבל בעדינות.
   9. Trypsinize רקמה תחת רעד עדין על שייקר סיבוב למשך 30 דקות ב 37 ºC. הפוך פיסות רקמה בטוחות צפות במהלך שלב זה ואינו משקעת לתחתית. הגדל מסתובבת במהירות במידת הצורך.
   10. להוסיף בסרום שור העובר (FBS) לריכוז סופי של 10% (v / v) ומערבבים על ידי מתערבל את הבקבוק 10 פעמים במשך 10 שניות. להתקרר השעית רקמות במי קרח למשך 15 דקות. מערבולת בקבוקון בעדינות חמש פעמים במהלך כל דקות שניות.
   11. בעדינות להעביר את ההשעיה רקמה לתוך צינורות סטרילי 50 מ"ל באמצעות 25 מ"ל או 50 מ"ל טפטפות ו צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 200 XG, 4 ºC.
   12. בטל supernatant בעדינות resuspend מתעכל רקמת מערכת העצבים המרכזית ב 15 מ"ל של מדיום לנתח קר כקרח בתוספת 5 מ"ל של סרום שור העובר, 0.4 מ"ל פתרון MgSO ₄ (3.82%MgSO ₄ ב HBSS) ו -1.6 מ"ל של DNase אני (1 מ"ג / מ"ל).
   13. ההשעיה רקמות להתחלק שווה בשווה לשני צינורות סטרילי 15 מ"ל (~ 10 מ"ל כל אחד) ולאט לאט triturate בעזרת פיפטה 10 מ"ל (10 פעמים) עד ההשעיה הופך / חלבי עכור. שמור את התא מושעה על קרח בעת עיבוד הצינור הבא. חכה 3 דקות עד נותרים מתעכל CNS רקמות משקעים לתחתית של התחתית. supernatant העברת לנקות שפופרת 50 מ"ל מבלי להפריע את החלק היחסי גלולה.
   14. לחלופין, לעבור supernatants עכור דרך מסננת תא 40 מיקרון ולשלב את ההשעיה תא בודד שנוצר לתוך 50 סטרילי מ"ל הצינורות על הקרח.
   15. ספין תא סלארי במשך 5 דקות ב 200 XG, 4 ºC.
   16. הוצא בעדינות את supernatant בעזרת פיפטה 10 מ"ל עד ~ 2 מ"ל של ביתור בינוני נותרים על גבי התא גלולה.
   17. תא קפיץ אצבע כדורי ב 50 מ"ל צינורות (~ 10 פעמים). לאט לאט מוסיפים 5 מ"ל של מדיום הגידול חם (ראו טבלה 1) על השעיית התא תוך בעדינותיד מתערבלת הצינור.
   18. לחלופין, חזור על שלב DNase 4.3.12 עבור 10 דקות נוספות על קרח עם פתרון שאני DNase טרי MgSO ₄ -solution במקרה של אשכולות רקמות גלויים או גושי DNA. צינור מערבולת ידני 5 פעמים בכל דקה שנייה.
   19. פלייט 50,000 תאים לכל coverslip זכוכית 25 מ"מ בתוך שלולית של מדיום גידול 400 μl בצלחת 6-היטב ולתת תאים לצרף למשך 30 דקות בתוך חממת תרבית תאים (5% CO _2, 37 ºC).
   20. לקבלת ומחוברות (בתוך 24 - 48 שעות לאחר ציפוי) 60 מ"מ בתא תרבות מנות ו -75 ס"מ ² צלוחיות בתרבית רקמה, צלחת 500,000 תאים (60 מ"מ צלחת) או 2 מיליון תאים (75 ס"מ ² צלוחיות).
   21. בעדינות להוסיף 2 מ"ל (מחיר טוב, 25 מ"מ זכוכית coverslips בצלחת 6-היטב), 3 מ"ל (60 מנות מ"מ) או 10 מ"ל (75 ס"מ ² צלוחיות) של מדיום הגידול חם זה טוב. דגירת תאי הלילה ולשנות בינוני לחלוטין למחרת בבוקר. ואז לשנות בינוני בכל יום אחר (יום 3, יום 5, יום 7, וכו ').
       לאטה: תרבויות גליה מעורבת עכברוש מוכנות לשימוש עבור immunocytochemistry או ביוכימיה 24 - 48 שעות לאחר הציפוי.
4. העכבר מעורב תרבויות גליה
   1. זהה דיסקציה של המוח עכברוש בילוד בסעיפים 4.3.1 עד 4.3.6, לערוף P0 בילוד WT ו NCAM KO עכברים עם C57 / BL6 רקע, להסיר את המוח ולשים אותם במדיום לנתח קר כקרח (ראו טבלה 1). שמור רקמות על קרח בכל העת.
   2. מחלקים את המוח הגדול לאורך קו האמצע לשתי אונות המוח ובהמשך לנתק נורות חוש הריח, הגרעינים הבזליים מתחת קליפת המוח ואת ההיפוקמפוס עם מלקחיים דומון. מניח את קליפת המוח המבודדת בצלחת נקיה פטרי המכילה HBSS על קרח.
   3. קח קליפה אחד. הסר את קרומי המוח עם מלקחיים עם עצות קנס תחת מיקרוסקופ לנתיחה. חזור עם הקורטקס הנותר. מניחים את כל הקורטקס ללא קרומי המוח לתוך אחד צלחת נקייה פטרי על הקרח.
   4. העבר hemisphe קליפת המוחמיל עם פיפטה 1 מ"ל כל עכבר לתוך צינורות נפרדים, סטרילי 15 מ"ל. להוסיף 1.2 מ"ל בינוני לנתח קר כקרח לכל המוח מכנית לשבש את רקמת המוח על ידי pipetting זה 2 פעמים למעלה ולמטה באמצעות קצה פיפטה 1 מ"ל.
   5. להוסיף 150 פתרון פפאין μl (10 מ"ג / מ"ל PBS), 100 μl DNase לי פתרון (1 מ"ג / מ"ל ב HBSS) ו -50 μl ₄ MgSO (3.82% ב HBSS) לכל המוח ומערבבים ידי מצליף אצבע.
   6. לדגור על השעיית המוח למשך 30 דקות ב 37 ºC באמבט מים ומערבבים השעיות המוח מכל רגע השני על ידי מצליף אצבע. הוסף 1 מ"ל של FBS לכל צינור, לערבב לצנן את ההשעיה רקמות במשך 10 דקות על הקרח.
   7. ספין למטה רקמת המוח במשך 4 דקות ב 200 XG, 4 ºC ו resuspend גלולה רקמת ב 1 מ"ל של חיץ לנתח קר כקרח השלימו עם 70 μl של פתרון DNase אני (1 מ"ג / מ"ל ב HBSS) ו -30 μl MgSO ₄ פתרון (3.82% ב HBSS).
   8. Triturate רקמת המוח באמצעות קצה פיפטה מ"ל 1 מצופה FBS(~ 5 פעמים) עד supernatant הופך עכור. להעביר את supernatant דרך מסננת תא 40 מיקרון ולהעביר לתוך צינור נקי על קרח.
   9. גלולה ותאי גלייה מעורבים באמצעות צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 200 XG, 4 ºC. לשאוב supernatant עד ~ 100 μl של המדיום נותרים על גבי התא גלולה. גלולה תא גלולה ידי אצבע מצליף (~ 5 פעמים) ולהוסיף 1 מ"ל של מדיום הגידול העכבר חם (ראו טבלה 1).
   10. לחלופין, לפזר צבירי תאים גלויים ותאי lysed / זירז DNA על ידי pipetting למעלה ההשעיה תא בעדינות מעלה ומטה (חמש פעמים).
   11. עכבר פלייט ותאי גלייה מעורבת על coverslips זכוכית PDL מצופים או 60 מנות מ"מ כמתואר בשלבים 4.3.19 - 4.3.21. שטוף תאים למחרת בבוקר עם מדיום גידול עכבר חמים ולאחר מכן בכל יום אחר. עכבר גליה מעורבת מוכנה לשימוש עבור 48 immunocytochemistry - 72 שעות לאחר הציפוי.
5. בידוד עכברוש Microglia
   1. עכברוש תרבות מעורבגליה צלוחיות תרבות 75 ס"מ ² רקמות במדיום הגידול (ראו טבלה 1) במשך 10 ימים. להתנער צבירי תאי microglial מתרבויות גליה מעורבות על שייקר סיבוב בתוך תרבית תאי חממה (5% CO _2, 37 ºC) ב 140 סל"ד במשך שעה 1.
   2. תוריד את supernatant המכילים microglia מתרבויות גליה מעורבת, להעביר אותו דרך מסננת תא 40 מיקרון ולשמור ההשעיה תא צינורות סטרילי 50 מ"ל.
      הערה: תרבויות microglial הן בדרך כלל> 95% טהורים לאחר שלב זה עם כמה זיהום OPCs ומעטים מאוד האסטרוציטים.
   3. לחלופין, להחליף מדיום גידול על תרבויות גליה מעורבות למחיקת שייק microglial בעתיד. בדרך כלל לבצע ניעור offs microglial המרובה (פעם בשבוע) מתרבויות גליה מעורבות.
   4. לחלופין, כדי לקבל purities צלחת 95% יותר 10 מ"ל של supernatant המכילים microglia (שלב 4.5.2) לכל 100 מ"מ צלחות פטרי דגירה של תרבית תאים חממה למשך 30 דקות ב 37 ºC. רק microglIA יצרף צלחות פטרי, בעוד אסטרוציטים OPCs להישאר supernatant.
   5. נער בעדינות צלחות פטרי בכיוון השעון נגד כיוון השעון (חמש פעמים כל אחד) ב למכסה המנוע תרבית תאים. תרבית תאים בינוניים לשאוב לחלוטין ולהחליף עם 10 מ"ל של מדיום הגידול. תרבויות microglia וכתוצאה מכך הן> 98% טהורים.
   6. microglia תרבות עד 7 ימים DMEM בתוספת FBS 1% ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין.
6. OPC עכברוש / בידוד oligodendrocyte
   1. כדי להשיג תרבויות OPC מועשר להתנער תאים microglial הראשון מ -10 תרבויות גליה מעורבת יממה שגודלו 75 ס"מ ² צלוחיות על שייקר הסיבוב בתוך תרבית תאים חממה (5% CO _2, 37 ºC) ב 140 סל"ד במשך שעה 1. בטל microglia המכילים רק supernatant או להשתמש לניסויים ספציפיים microglia (ראה שלב 5.5).
   2. החזר את supernatant המכיל microglial עם מדיום גידול 10 מ"ל ולהתנער תרבויות גליה מעורבותעוד 18 שעות על שייקר הסיבוב בסל"ד 200 (5% CO _2, 37 ºC).
   3. אסוף את microglia- ו supernatant OPC המכיל מתרבויות גליה מעורבות ולהעביר דרך מסננת תא 40 מיקרון. אסוף את ההשעיה תא 50 סטרילי צינורות מ"ל.
   4. לחלופין, להחליף מדיום גידול על תרבויות גליה מעורבות למחיקת שייק OPC בעתיד.
      הערה: OPCs ממשיך להתרבות על שכבות מזין astrocytic ויכול להתערער פעמי זמן שני ושלישי (פעם בשבוע), אם כי עם תשואות נמוכות.
   5. פלייט 10 מיליליטר של microglia- ו OPC המכיל supernatant לתוך 100 מ"מ צלחות פטרי דגירת תרבית תאי חממה למשך 30 דקות ב 37 ºC. Microglia יצרף צלחות פטרי, בעוד OPCs האסטרוציטים להישאר supernatant.
   6. נער בעדינות צלחות פטרי בכיוון השעון נגד כיוון השעון (5 פעמים כל אחד) במנדף תרבית תאים. להוציא רק כמה צלחות פטרי בכל פעם מן החממה תרבית תאים (מיקרוגליאה יתחיל פירוק מחיית המחמדמנות רי כאשר מטלטלים אותם נמרצות במדיום קריר).
   7. אסוף ולשלב את supernatant המכיל OPC ב 50 מ"ל צינורות. בנוסף, אפשר להוסיף בינוני תרבות צלחות פטרי לשימוש בניסויים microglia ספציפית.
   8. לחלופין, כדי להגביר עוד יותר את הטוהר של תרבויות OPC לחזור על שלבים 5.6.5 ו 5.6.6 פעם עם מנות טריות פטרי להוריד את היקף microglia בהכנות OPC.
   9. ספין למטה supernatant OPC המכילים מועשר ב צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 250 XG, 4 ºC. בעדינות לשאוב supernatant מבלי להפריע גלולת התא. השאירו 3 מ"ל של supernatant על גבי גלולה ולהתחיל resuspending OPCs ידי מצליף אצבע (10 פעמים).
   10. בעדינות triturate צבירי תאים OPC באמצעות פיפטה 10 מ"ל (5 - 10 פעמים).
   11. ספירת תאי צלחת 50,000 OPCs לכל 25 coverslip זכוכית מ"מ (PDL מצופה) בתוך שלולית של מדיום גידול 400 μl בצלחת 6-היטב ולתת תאים לצרף למשך 30 דקות בתוך חממת תרבית תאים (5% CO _2, 376: C). בעדינות להוסיף 2 מיליליטר של מדיום הפצה חם (ראה טבלה 1) זה טוב. לקבלת PDL מצופה מנות תרבית תאים 60 מ"מ לוח 1 - 1.5 מיליון OPCs ב 3 מ"ל של מדיום הפצת נשק גרעיני.
   12. בזהירות להחליף המכיל FBS בינוני התפשטות עם hr בינוני 3 התפשטות טריה לאחר ציפוי OPCs (להפוך OPCs בטוח המחובר כהלכה ואינו לסלק במהלך שינוי בינוני). המרת בינוני כל שני וחמישי.
       הערה: תרבויות החולדה OPC מוכנות באמצעות פרוטוקול זה הם בדרך כלל 90% טהורים עם microglia כסוג תא מזהם המרכזי, ואחריו האסטרוציטים.

5. Immunocytochemistry שימוש HIgM12 בתאים ראשוניים גלייה

1. Immunofluorescence Triple-תווית באמצעות HIgM12, מב אנטי PSA, וסוג תא סמנים ספציפיים בתאי גלייה ראשיים מ WT ו NCAM KO עכברים
   1. בתנאי תא חיים, עכבר ומחוברות תווית 60% מעורבבים תרבויות גליה מעכברי WT ו NCAM KO גדלו על PDL מצופה25 coverslips מ"מ זכוכית עם HIgM12 (10 מיקרוגרם / מ"ל) ו מב אנטי PSA (שיבוט 2-2B) (10 מיקרוגרם / מ"ל) ב- PBS השלימו עם FBS 10% ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
   2. שטפו תאים שלוש פעמים במשך 20 שניות כל אחד עם PBS קר כקרח השלימו עם FBS 10% ולתקן עם paraformaldehyde 4% ב- ​​PBS, pH 7.4 במשך 15 דקות ב 25 ºC.
   3. שטפו תאים קבועים פעמים עבור 1 דקות כל אחד עם PBS בתוספת 10% FBS ו permeabilize תאים עם 0.1% Triton-X100 ב PBS, pH 7.4 ל -2 דקות ב 25 ºC. שטפו תאים פעמיים דקות 1 ותווית עם GFAP סמנים גליה (האסטרוציטים) או IBA-1 (מיקרוגליאה) (1 מיקרוגרם / מ"ל) ב- PBS בתוספת 10% FBS לילה ב 4 מעלות צלזיוס בחדר קר.
   4. המשך עם תנאי immunofluorescence סטנדרטיים כולל DAPI המכיל הרכבה בינונית ^31.
      הערה: שימוש שכותרתו fluorescently Fab ₂ שברים כמו נוגדנים משני עבור אדם (HIgM12) ועכבר (אנטי-PSA מב, שיבוט 2 - 2B) IgMs מומלץ בחום.
   5. קח flתמונות uorescent ב 60X או הגדלה 100X. השתמש באותן גדרות מכשירות עבור כל תמונות ותמונות תהליך זהה.
2. תיוג immunofluorescence של תאי גליה Endo-NF שטופל WT באמצעות HIgM12 כמו נוגדן ראשוני
   1. עכבר התרבות WT גליה מעורב גדל במשך 3 ימים Neurobasal השלימו עם 10% FBS ו תוסף B27 (1:50) על-מצופה PDL 25 coverslips מ"מ זכוכית. להוסיף Endo-NF (30 מיקרוגרם / מ"ל) עד בינוני תרבות 1 מ"ל ו דגירה לילה חממה תרבית תאים (37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2).
   2. תאים תווית לחיות בקור עם HIgM12 ו GFAP סמן astrocytic פנימי לאחר קיבוע ו permeabilization כמתואר בשלבים 5.1.1 ל 5.1.5. קח תמונות ניאון ב 60X או הגדלה 100X. השתמש באותן הגדרות מכשירות עבור כל התמונות ולעבד זהה.

תוצאות

סעיף זה ממחיש דוגמאות של התוצאות ניתן להשיג על ידי לימוד האדם IgM ספציפיים PSA-אנטיגנים של מערכת העצבים המרכזית. שימוש נוגדנים אנושיים IgM המכילים שרשרות אור ספציפיות Vκ במסגרות ביוכימיות ידי immunocytochemistry ניאון מוצג.

HIgM12 immunoprecipitates אנטיגן שלה מ lysates מוח המוחין ופועל כסוכן גילוי (נוגדן ראשוני) ב כתמים מערביים. לא נוגדן אלוטיפ ולא חרוזים L agarose immunoprecipitate אנטיגן דומה, אשר מביא לידי ביטוי את הספציפיות של לנתץ (איור 1). כתמים מערביים באמצעות lysates CNS מעכברי WT ו NCAM KO להפגין את הספציפיות של HIgM12-קשירת PSA המכיל NCAM (איור 2 א). עיכול אנזימתי של רקמת מערכת עצבים מרכזית מעכברי WT באמצעות Endo-NF מזהה PSA מצורפת NCAM כמו epitope מחייב הספציפי HIgM12 (תרשים 2B). בשיטה שהותוותה לעיל, תרבויות microglial עכברוש IBA-1-החיובי של טוהר גבוה מתקבלות (איור 3). זמין מסחרי נוגדן אנטי PSA (שיבוט 2-2B) לא לתייג פני תא או ברכות PSA פנימיות קבוע permeabilized תאי microglial IBA-1-חיוביים על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. בקנה אחד עם מחקרים שפורסמו בעבר, שמדווח אין ביטוי על פני קרום התא של PSA-NCAM ב microglia ^16,41 HIgM12 לא לתייג אנטיגנים פני התא ב microglia עכברוש מטוהרים. מעניין, תיוג HIgM12 של תוצאות microglia קבועים permeabilized בתוך תאיים, דפוס perinuclear כי אינו מוגבל אברונים ספציפי (איור 3). תוצאות הן בניגוד לאלה שהושגו באמצעות נוגדן אנטי PSA IgG (שיבוט 735) ^26, אשר מטרות PSA-SynCAM ב microglia ברמה של Golgi ^41.

בניגוד microglia, HIgM12ותא A2B5 יעד אנטיגנים משטח בתרבויות OPC העכברוש מועשרות בתנאי תא חיים (איור 4). תרבויות OPC מכילים ~ 5% מזהם תאים microglial. איור 5 מדגים דפוס מכתים פני קרום התא כמעט זהה בין HIgM12 ואנטי-PSA מב (שיבוט 2-2B) האסטרוציטים GFAP חיובי (איור 5 א). תיוג Immunofluorescent של האסטרוציטים Endo-NF-מתעכל WT לעומת חיץ האסטרוציטים WT שטופלו שליטה באמצעות HIgM12 מדגים את הנוכחות של PSA astrocytic (איור 5). הנוכחות של האסטרוציטים PSA חיובי in vivo עדיין יש לקבל אישור.

איור 1: HIgM12 מעשים כמו "נפתח" סוכן ב Immunoprecipitations Immunoprecipitations מ lysate המוח הכולל של עכברים שלושה חודשים ישנים באמצעות HIgM12, בקרת isotype אדם HIgM.חרוזים L 126 או agarose רק בתור "לנתץ" סוכנים. חלבוני eluted נוהלו כתמים מערביים עם ממברנות נחקרו נגד HIgM12. משקולות מולקולרית של חלבונים eluted מן חרוזים מצופים HIgM12 היו בטווח של 160 - 200 kDa בנוסף שרשרת כבדה IgMs (~ 65 - 73 KDA). נתון זה יש הבדל בין J. Neurochem. ^15. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2: HIgM12 מטרות חומצת Polysialic (PSA) מחצית על NCAM. Homogenates מוח א 'מבית P7, P13, P16 ו P27 NCAM להסתכם עכברי KO ובקרות להמלטת הטרוזיגוטיים נוהלו כתמים מערביים עם ממברנות נחקרו נגד HIgM12, PSA ו- β-יקטין כמו טעינה מלאה. J. Neurochem. ^15. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3: בהעדר PSA על עכברוש Microglia משתקף בחוסר HIgM12 תיוג microglia עכברוש היו בתרבית למשך 48 שעות על coverslips זכוכית מצופה poly-D- ליזין ואו שכותרתו חי על קרח עם HIgM12 או לאחר קיבוע עם HIgM12 או אנטי. -PSA מב (שיבוט 2-2B). התאים היו triple שכותרתו עם microglia סמן IBA-1 (ירוק), HIgM12 / PSA (אדום) ו DAPI (כחול). תמונות להראות חוסר פני התא microglial מחייב שימוש HIgM12 (בשורה העליונה) וחוסר אנטי PSA מחייב (שיבוט 2-2B) אל פני התא וחנויות הפנימית microglia עכברוש הראשי (בשורה התחתונה). בהתבסס על מורפולוגיה בהעדר דו קוטביות של מכתים IBA-1, תא PSA החיובי הקטן (בשורה תחתונה) הוצע להיות OPC. בתאים קבוע, מכתים HIgM12 הביא לדפוס punctated, perinuclear כי לא הוגבל אברונים ספציפיים ונחשב הלא ספציפית מחייב (בשורה האמצעית). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4: HIgM12 מטרות Cell Surface PSA-NCAM על עכברוש OPCs עכברוש OPCs ו microglia היו cultu.אדום עבור 4 ימים במדיום התפשטות על coverslips זכוכית מצופה poly-D- ליזין ומשולשים שכותרתו חי על קרח עם HIgM12 או A2B5 (ירוק), CD68 סמן מקרופאג / מונוציטים פנימי (שיבוט ED-1) (אדום) ו DAPI (כחול) . תמונות להראות אוכלוסיות תאים חיובית majorly עבור OPC סמן A2B5 (בשורה העליונה) ו HIgM12 (בשורה התחתונה) עם כמה microglia CD68 חיובי (~ 5%). בניגוד שלב ותמונות DAPI נוספו לחשוף שלמות התא מספרים סלולריים עבור כל האוכלוסייה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5: HIgM12 ו מב אנטי PSA שיתוף לסימון subpopulation astrocytic עכבר מעורבת גליה. א מאוס מעורבים ותאי גלייה מ WT ו NCAM להסתכם חיות KO המכילות האסטרוציטים, תאי שושלת oligodendrocyte ו מיקרוגרםליה היו בתרבית במשך 3 ימים ומסומן חי על קרח עם HIgM12 (ירוק), אנטי-PSA מב (שיבוט 2-2B) (אדום), ובהמשך עבור סמן astrocytic GFAP (סגול) ו DAPI (כחול). HIgM12 ו-PSA אנטי לחשוף דפוס מכתים זהה ווירטואלי על האסטרוציטים WT GFAP חיוביים, אך עדיין חסרי מחייב האסטרוציטים תרבותיים מעכברי KO NCAM. נתון זה יש הבדל בין J. Neurochem. ^15. ב מעורבת גליה היו בתרבית זהה כמתואר תחת א והתייחסו לילה עם endoneuraminidase-NF (בתנאי בחביבות על ידי ד"ר מרטינה Muehlenhoff) או שליטה PBS. תאים תויגו חי על קרח עם HIgM12 (ירוק) ובהמשך מוכתם עבור GFAP סמנים פנימי (אדום) ו DAPI (כחול). HIgM12 מטרות אנטיגנים פני תא על שליטת PBS שטופל תרבויות גליה מעורבות אבל לא endoneuraminidase-NF מטופלי גליה מעורבת. נתון זה יש הבדל בין ¹⁶ JNSCI. Plלהקל לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

כל התמונות צולמו בהגדלה 60X באמצעות אותן הגדרות מכשירות ומעובד באופן זהה.

טבלה 1:. הצפת פתרון מתכונים אנא לחץ כאן כדי להוריד את הטבלה.

	רקמת מערכת העצבים המרכזית	Endo-NF / PBS	חיץ תמוגה	נפח כולל
1. עכבר WT	67 מיקרוגרם (0.45 μl)	2 μl (12 מיקרוגרם) Endo-NF	7.55 μl	10 μl
2. עכבר WT	67 מיקרוגרם (0.45 μl)	2 μl PBS	7.55 μl	10 μl
3. עכבר WT	67 מיקרוגרם (0.45 μl)	לא PBS או Endo-NF	9.55 μl	10 μl
4. NCAM KO העכבר	67 מיקרוגרם (0.45 μl)	2 μl (12 מיקרוגרם) Endo-NF	7.55 μl	10 μl
5. NCAM KO העכבר	67 מיקרוגרם (0.45 μl)	2 μl PBS	7.55 μl	10 μl
6. NCAM KO העכבר	67 מיקרוגרם (0.45 μl)	לא PBS או Endo-NF	9.55 μl	10 μl

טבלה 2: Endo-NF העיכול של רקמת מערכת העצבים המרכזית מ P7 WT ו NCAM KO עכברים.

דיון

נוגדנים עצמיים IgM טבעיים אדם פונים מועמדי immunotherapies ו הוכיחו פוטנציאל טיפולי לטיפול במחלות שונות, כולל סרטן והפרעות במערכת עצבים מרכזיים ^1-7. לתועלתו, נוגדנים אלה לא לעורר תגובה חיסונית אשר הדור של נוגדנים מנטרלים מפחית את המינון טיפולי האפקטיבי משמעותי ויעילות. חשוב לציין, כל הנוגדנים עם פוטנציאל טיפולי היו של אלוטיפ IgM ושייכים הרפרטואר NAB ^{3-5,8,9,37,40,42-45.} משוכה גדולה עבור היישום הקליני הפוטנציאל של נוגדני IgM היא זיהוי של אנטיגנים שלהם, אשר לא ידועים במקרים רבים. טכניקות סטנדרטיות מועסקות נוגדני IgG הן בדרך כלל לא ישים לזהות אנטיגן של IgM.

פרוטוקול זה מתאר את זיהוי של PSA-NCAM כמו אנטיגן עבור HIgM12 נוגדני IgM אדם רגנרטיבית, יעיל במודלים של בעלי חייםשל MS ו- ALS ^15-18. המתודולוגיה בשימוש ישימה בעיקר לכל נוגדנים אנושיים עם שרשראות אור Vκ ספציפיים VκI, VκIII ו VκIV ונוגדנים העכבר עם שרשראות אור VκI, ללא קשר אלוטיפ של נוגדן.

השלב הקריטי ביותר בפרוטוקול זה הוא השימוש נוגדני IgM ביישומי כרומטוגרפיה זיקה. באופן ספציפי יותר, נוגדנים מוצלחים נדרשים לפעול כסוכנים הנפתח ב immunoprecipitations לבודד או להעשיר אנטיגן מתוך lysates רקמות או תרבית תאים המורכב. שברי אנטיגן מועשרים ניתן להשוות immunoprecipitations מ נוגדנים לשלוט אלוטיפ ובהמשך נתחו להבדלים ידי ספקטרומטריית מסה. אחת דרישה הכרחית או הגבלה של שלב זה היא הנוכחות של שרשרת אור מארח הנכון נוגדן Vκ (אדם, העכבר) כדי לאפשר נוגדן מחייב agarose חלבון L. שימוש חלבון mannan מחייב בהכרח agarose (גם Calleד מנוז מחייב לקטינים) במקום agarose חלבון L היא אלטרנטיבה פוטנציאל immunoprecipitate IgMs ללא שרשראות אור ספציפי Vκ. עם זאת, כאמור על ידי ארנולד et al. ^35, נוגדנים IgM הנכנס אנטיגן לא להיקשר לחלבון mannan מחייב, כמו glycan היעד נראה הופכים נגישים פעם IgM הכפיף אותו אנטיגן שלה. בהתבסס על ממצאים אלו mannan מחייב חלבון לא ניתן להשתמש כמטריצה ​​מחייב immunoprecipitate טעון אנטיגן IgM מולקולות ^35. חלופות אפשריות אחרות עשויות להיות שימוש נוגדנים אנטי-IgM agarose הנכנס משני IgG ^46,47 או שימוש חרוזים מגנטיים המופעל משטח ^48. נוגדני IgG מכוונים נגד IgMs יכולים להיות crosslinked כימי agarose A או agarose G על מנת לצמצם את היקף נוגדן eluted יחד עם האנטיגן של עניין. השוואה נכונה בין גרסאות שונות של immunoprecipitation IgM ביחס אנטיגנים זיהו בהצלחה iזה קשה כי רוב immunoprecipitations בוצע כדי לבודד או לרוקן IgMs ללא ריבית נוספת אנטיגנים שלהם. בנוסף, immunoprecipitations באמצעות IgMs שמש בעיקר כדי לאשר אנטיגן כבר ידוע או צפוי יחיד עם חשיפת נוגדנים לאנטיגנים מטוהרים ^49. חסרון של IgGs מצמיד agarose מכוון נגד אדם IgMs הוא תשואה נמוכה מאוד (10 - 15%) של מולקולות immunoprecipitated בסרום IgM כשמשווה את החומר המוצא ^50. לעומת זאת, חרוזים מגנטיים המופעל משטח יושמו בהצלחה לנוגדנים של isotypes השונה כולל IgM כדי immunoprecipitate סיבים הקשורים scrapie ^48. שיטה זו אינה מצטמצמת אך קאפה ספציפי (Vκ) או למבדה (λ) שרשרות או שורה מסוימת ועשויה להרחיב בצורה ניכרת את הספקטרום של נוגדני IgM המשמשים immunoprecipitations.

צעד חשוב נוסף בפרוטוקול הוא היכולת של הנוגדן לתפקד בתור detecting נוגדן (נוגדן ראשוני) ב כתמים מערביים או פלטפורמות סריקה אחרות. נוגדנים מוצלחים חייבים למקד אנטיגן שלהם עם זיקה גבוהה מספיק כדי לאפשר אנטיגן מחייב בנוכחות דטרגנטים שאינם יונים או אולי יוניים. נוגדני זיקה גבוהים נפוצים בקרב נוגדני IgG-maturated זיקה, אבל פחות נפוצים בקרב נוגדנים של אלוטיפ IgM, שהיא אחת הסיבות מדוע יש יחסית מעט נוגדני IgM זמינים מסחרי כמו גילוי סוכנים במסגרות ביוכימיים. זיקה גבוהה המחייבת של נוגדנים מהווה דרישה immunoprecipitations של אנטיגנים מולקולרי עבור מערבי סופג. הפחתת ריכוזי חומר ניקוי או ההעדר המוחלט של דטרגנטים מאגרי IP או מאגר תמוגה מאפשרת אנטיגן מיקוד ידי נוגדנים נמוך זיקה באמצעות תחום Fab שלה. לעומת זאת, היכולת של הנוגדן למקד agarose חלבון L באמצעות חלק Fc שלו אינה מושפעת באופן משמעותי בקרב שולטת אלוטיפ על פני טווח של concen חומר ניקוי השונהtrations. עם זאת, ריכוז חומר ניקוי נמוך במאגר תמוגה חיץ IP מונע הפרעת קרום תא ובידוד של מולקולות ספציפיות. באופן דומה, ריכוז חומר ניקוי נמוך מאגרי כביסת כתם מערביים (למשל, PBS-T) מאפשר אנטיגן מחייב של נוגדנים בעלת זיקה נמוכה אך בעת ובעונה האחת מגדיל את הלא ספציפי מחייב ולכן הוא לא אופציה.

הנוכחות של ליבת חלבון אנטיגן היא דרישה נוספת עבור שיטה זו. חלבונים עם שינויי posttranslational (למשל, גליקופרוטאינים, ליפופרוטאינים) וחלבונים ללא שינוי, אך לא שומנים בלעדיים או פחמימות, ניתנים לזיהוי ב כתמים מערביים. זה לא ניתן immunoprecipitate שומנים (למשל, ספינגוליפיד) מ lysates רקמות או תאים בנוכחות או בהיעדר דטרגנטים. מאפייני physicochemical של דטרגנטים ושומנים דומים מכדי לאפשר אינטראקציות שומנים-נוגדן סלקטיבי, בעוד באותו הזמן דטרגנטים חיוניים לשבשממברנות כדי לאפשר בידוד סלקטיבי של מולקולות ספציפיות. למיטב ידיעתנו, immunoprecipitations המורכב אך ורק של פחמימות, בהעדר גרעין חלבון, לא דווח בעבר. זה הופך רלוונטי במיוחד בגלל נוגדנים IgM לעתים קרובות למקד פחמימות glycolipids, אשר אינן צמודות בהכרח ליחידת חלבון. טכניקות chromatographic אחרות נדרשות לזיהוי ההפרדה אימונולוגית של שומנים ופחמימות בהיעדר גרעין חלבון. לדוגמא, כרומטוגרפיה בשכבה דקה (TLC) של שומנים הסלולר עם זיהוי נוגדן עוקב על צלחת TLC (החיסונית TLC) ניתן ליישם ^51,52.

נוגדנים נגד ה- PSA אחרים תוארו במחקרים קודמים ותוצאות לעומת HIgM12 וכן IgM אנטי PSA הזמין המסחרי (שיבוט 2-2B). הנוגדן הנפוץ ביותר בתחום ה- PSA הוא נוגדן IgG (שיבוט 735) זמין עכבר monoclonal או ארנב polyclonal נוגדן ^53. נוגדן אנטי PSA IgG זה מזהה PSA על SynCAM ו NCAM על תאים מסוגים שונים במערכת העצבים המרכזית כולל תאים microglial ^41. בניגוד הנוגדן IgG אנטי PSA, נוגדנים IgM האדם HIgM12, HIgM42 ואת IgM העכבר אנטי PSA (שיבוט 2-2B) אינם מסוגלים למקד PSA על SynCAM (אבל על NCAM) בשעה שלבי הלידה העוברית המוקדמת שונים בעכברים ואילו SynCAM הלא polysialylated ניתן לזהות בקלות ^15. הנוגדנים IgM בהם נעשה שימוש הם גם לא מסוגל לזהות PSA על תאים microglial (איורים 3 + 4). הסבר אפשרי ההבדלים שנצפו בין isotypes נוגדנים עשוי להיות רמות נמוכות PSA-SynCAM לעומת רמות של PSA-NCAM בשילוב עם זיקה פוטנציאלית נמוכה יותר מחייב של נוגדנים IgM לעומת IgG אנטי-PSA. כדי לבחון השערה זו, ביצענו immunoprecipitations בחיות NCAM KO בשלב העוברי E17 עם כמויות עצומות של ההווה SynCAM והשתמשו HIgM12 בתור "סוכן הנפתח" ^{15. בשנת להמלטה WT E17 שולטת HIgM12 immunoprecipitated PSA-NCAM במידה שהראו בעוצמות דומות של "הוריד" PSA-NCAM לעומת שרשרת IgMs כבד כפי שזוהו על ידי צפיפות ב כתם המערבי לאחר מכן באמצעות אנטיגנים eluted. תוצאה זו הציעה לפחות זיקה מספקת של HIgM12 כדי PSA היעד שלה. בניגוד להמלטה WT שולט HIgM12 לא לזהות PSA המצורפת SynCAM בחיות KO NCAM. תוצאות זהות התקבלו immunoprecipitations באמצעות IgM HIgM42 אנטי PSA האדם. HIgM12 ו HIgM42, כמו גם את העכבר אנטי PSA IgM (שיבוט 2-2B) לא הצליחו למקד PSA על SynCAM ב כתמים המערבי מחיות WT ו NCAM KO בשלבים התפתחותיים עובריים לאחר הלידה. בהתחשב בכמות הנמוכה של HIgM12 נדרשה (0.1 מיקרוגרם / מיליליטר) כדי לזהות PSA מצורפת NCAM דווקא כתמים מערביים באמצעות כמויות קטנות של רקמת מערכת עצבים המרכזית (CNS 0.1 מיקרוגרם רקמה לכל טוב) 15 זה נראה סביר כי זיקות נמוכות לבד הםאחראי חוסר מוחלט של זיהוי PSA-SynCAM ידי HIgM12 בשלוש שיטות שונות.}

אנו מסיקים כי ישנם הבדלים משמעותיים בין נוגדנים נגד ה- PSA IgM ואת נוגדן IgG אנטי PSA המפורסם התדיר (שיבוט 735). לא ברור מדוע זמינים מסחרי נוגדנים נגד ה- PSA IgM לא היו רגילים בתדירות גבוהה יותר בעבר לאשר את תוצאות שהושגו עם antiPSA IgG נוגדנים 735. זה מעניין במיוחד משום HIgM12 כבר הוכיח יעיל במודלי מחלה שונים. בעוד נוגדנים נגד ה- PSA IgM אחרים עשויים להיות השפעות טיפוליות דומות עדיין לא ברור האם נוגדן IgG אנטי PSA (שיבוט 735) יש תוצאה טיפולית דומה במודלים של טרשת הנפוצה ALS.

בקיצור, השיטות שתוארו כאן שימשו בעיקר כדי לזהות את האנטיגן של HIgM12 נוגדן אנושי משובי לתמוך בניסויים קליניים פוטנציאל MS ואולי מחלות ניווניות אחרות. זיהוי של נמלהigens נוגדנים בעלי פעילות ביולוגית הוא צעד חיוני כדי להבין את מנגנון הפעולה שלהם. זה הופך רלוונטי במיוחד בהקשר של נוגדנים חד שבטיים רבים בימים אלה נבדקים על בטיחות ויעילות בניסויים בבני אדם. בעוד מספר נוגדנים IgM נבדק קלינית עד כה הוא קטן, השיפורים האחרונים בטכנולוגיה hybridoma יחד עם מספר גדל והולך של מחקרים המדגיש את הפוטנציאל הטיפולי של הכיתה נוגדן זה ^{1-10,37,40,42-45} קורא מפיתוח מוצרים חדשים וחדשניים או שיטות שונות ישים לזהות אנטיגנים IgM הלא חלבון.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
DMEM	Fisher Scientific	MT-10-013-CVRF	גלוקוז גבוה, עם גלוטמין, עם נתרן פירובט, 500 מ"ל
DMEM/F-12, HEPES	Life Technologies	11330-032	500 מ"ל, L-גלוטמין, סודיום פירובט, גלוקוז גבוה
פניצילין-סטרפטומיצין	Life Technologies	15140-122	10,000 יח'/מ"ל, 100 מ"ל
תוסף N-2 (100x)	Life Technologies	17502-048	5 מ"ל
תוסף B-27 (50x)	Life Technologies	17504-044	ללא סרום, 10 מ"ל
סרום בקר עוברי - אופטימה	אטלנטה ביולוגיקס	S12450	500 מ"ל
מים סטריליים להשקיה	בקסטר בריאות	#2F7114	USP-1,000 מ"ל, 12/CA
פולי-די-ליזין הידרוברומיד	סיגמא	P7886-50 מ"ג	D-Lys-(D-Lys)n-D-Lys · xHBr, משקל מולקולרי 30,000-70,000 גרם/מול, 50 מ"ג
שבר אלבומין בסרום בקר V	סיגמא	A-3294-100G	מקטע הלם חום, ללא פרוטאז, pH 7,  טוהר 98%, 100 גרם
D-(+)-גלוקוז	סיגמא	G5767-500G	C<תת>6H12O6, משקל מולקולרי: 180.16 גרם/מול, מגיב ACS, 500 גרם
טריפסין מלבלב בקר	סיגמא	T9935-100 מ"ג	אבקה נטולת מלח, ליופיליזציה, 9,000 יחידות BAEE/מ"ג חלבון
דאוקסיריבונוקלאז I מלבלב בקר	סיגמא	D5025-150KU	סוג IV, אבקה ליופילית, 2,000 יחידות קוניץ/מ"ג חלבון
רקומביננטי חולדה FGF חלבון בסיסי	R& מערכות D	3339-FB-025	BSA כחלבון נשא, 25 & #181; גרם, ליופיליזציה, > 95%, 16.2 kDa
חולדה רקומביננטית PDGF-AA חלבון	R& מערכות D	1055-AA-50	ללא מנשא, 50 ו-#181; גרם, ליופיליזציה, > 97%, E. coli-נגזר, 12.5 kDa
Neurobasal-A	Life Technologies	10888-022	500 מ"ל, ללא גלוטמין, ללא חומצה אספרטית, ללא חומצה גלוטמית
Paraformaldehyde	Sigma	P6148-1KG	גבישי, 1 ק"ג, בדרגת ריאגנט, משקל מולקולרי 30.03 גרם/מול (כמונומר)
Tris[hydroxymethyl]aminomethane (Tris bas	Biorad	#1610719	1 ק"ג, 99.8% טהור, אבקת
נתרן דודציל סולפט (SDS)	Biorad	#1610302	1 ק"ג, אבקה
גליצין	פישר סיינטיפיק	BP-381-5	C2H5NO2, משקל מולקולרי: 75.07 גרם/מול, אבקה גבישית לבנה, 5 ק"ג
נתרן כלורי	Sigma	S7653-5KG	NaCl, משקל מולקולרי: 58.44 גרם/מול, 5 ק"ג
נתרן פוספט מונו-בסיסי	סיגמא	S0751-500G	NaH2PO4, משקל מולקולרי: 119.98 גרם/מול, 500 גרם
תמיסה חוצצת פוספט 1x (PBS)	Cellgro	MT-21-040-CV	ללא סידן ומגנזיום, 6 x 500 מ"ל
פלקון 60 מ"מ צלחת תרבית תאים מטופלת TC	קורנינג מדעי החיים	#353002	צלחת תרבית תאים 60 מ"מ, פוליסטירן שטופל ב-TC, 20/אריזה, בז סטרילי
60 מ"מ x 15 מ"מ צלחת פטרי	קורנינג מדעי החיים	#351007	צלחת פטרי בקטריולוגית לא מטופלת TC, 20/חבילה
6 צלחות תרבית תאים	קורנינג קוסטאר	CLS3516	6 בארות, תחתית שטוחה (עטופה בנפרד), מוקרנת גמא, שטח גידול 9.5 ג
75 ס"מ&סופ2; בקבוק תרבית רקמות	קורנינג מדעי החיים	430720U	75 ס"מ² בקבוק תרבית תאי צוואר משומר בצורת U עם כובע חותם תקע
Pierce™ חלבון L Plus אגרוז	ThermoFisher Scientific	#20520	2 מ"ל, צולב 6% אגרוז חרוזים (CL-6B), יכולת קשירה: 10 עד 20 מ"ג IgG
4 - 20% Mini-PROTEAN TGX ג'ל טרומי	Biorad	456-1094	10 בארות, 50 ומיקרו; l, לשימוש עם תאי אלקטרופורזה Mini-PROTEAN
Immobilon-P ממברנה	Millipore	IPVH00010	PVDF, 0.45 ומיקרו; M, 26.5 ס"מ x 3.75 מ'
גליל נוגדן חומצה אנטי-פוליסיאלית-NCAM, שיבוט	Millipore	MAB5324	50 מיקרוליטר, מארח: עכבר, IgM חד-שבטי
4x Laemmli מאגר דגימה	Biorad	#1610747	10 מ"ל, 4x מאגר דגימת חלבון מעורבב
מראש 2-מרקפטואתנול	Biorad	#1610710	25 מ"ל, 98% טהור, 14.2 מ'
אנדונאורמינידאז-N (Endo-N)	ABC Scientific	ABC0020	50 מיקרוליטר, 200 ומיקרו; גרם/מ"ל, 3,500 U/mg
25 מ"מ כיסויי זכוכית	Fisher Scientific	12-545-102	Circles No. 1; עובי: 0.13 עד 0.17 מ"מ; גודל: 25 מ"מ
תמיסת חיץ HEPES	ThermoFisher Scientific	15630-080	100 מ"ל, 1 מ'
תמיסת מלח מאוזנת של הנקס 1x (HBSS)	Cellgro	MT-21-022-CV	500 מ"ל, ללא סידן, מגנזיום, פנול אדום
פפאין	וורת'ינגטון שיתוף פעולה ביוכימי	LS003119	אבקה ליופילית, 100 מ"ג
מגנזיום סולפט	סיגמא	M-2643-500G	אבקה, 500 גרם
L-גלוטמין	Gibco	#25030-081	100 מ"ל, 200 מ"מ