הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

G- חלבון סלקטיבית GPCR תצורות נמדדו באמצעות סריג חיישנים ב assay fluorometer השעית תא חי

9.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/54696

⸱

10 בספטמבר 2016

 ,  , 
1Genetics, Cell Biology, and Development, University of Minnesota, 2Department of Cell and Developmental Biology, University of Michigan

במאמר זה

סיכום

שיטות פשוטות לזיהוי הפעלה סלקטיבית של חלבוני G על ידי קולטנים מצומדים לחלבון G נותרו אתגר יוצא דופן באיתות תאים. כאן, חיישנים ביולוגיים של העברת אנרגיית תהודה (FRET) של Fӧrster פותחו על ידי קשירה זוגית של פפטידי חלבון GPCR ל-G כדי לחקור שינויים קונפורמטיביים בריכוזים מבוקרים בתאים חיים.

תקציר

העברת אנרגית תהודת Fӧrster (סריג) מבוססת מחקרים הפכו נפוצים יותר ויותר בחקירת איתות GPCR. קבוצת המחקר שלנו יצרה חיישן סריג תוך מולקולרי כדי לזהות את האינטראקציה בין Gα יחידות משנה ו GPCRs בתאים חיים בעקבות גירוי אגוניסט. כאן, אנו בפירוט את הפרוטוקול לאיתור שינויים סריג בין קולטן β 2 -adrenergic ואת פפטיד C הסופית- Gαs על טיפול עם 100 מיקרומטר hydrochloride isoproterenol כפי שאפיינו 1. חיישן הסריג שלנו הוא פוליפפטיד יחיד המורכב סדרה של GPCR באורך מלא, fluorophore acceptor סריג (mCitrine), גידול ER / K עווית (אפנון כוח זיקת חלבון שיטתי) מקשר, fluorophore התורם סריג (mCerulean), וכן Gα C פפטיד -terminal. פרוטוקול זה התקנת פרט תא יהיה בהכנה, תנאי transfection, ציוד, ביצוע assay, וניתוח נתונים. עיצוב ניסיוני זה מזהה ch הקטןAnges ב הסריג מעיד על אינטראקציות בין חלבונים, והוא יכול לשמש גם כדי להשוות את עוצמת האינטראקציה ברחבי הליגנדים ואת זיווגי חלבון GPCR-G. כדי לשפר את האות לרעש במדידות שלנו, פרוטוקול זה דורש דיוק מוגבר בכל השלבים, והוא מוצג כאן כדי לאפשר ביצוע לשחזור.

מבוא

G המצומדים קולטנים (GPCRs) הם קולטנים שבע הטרנסממברני. גנום האדם לבדו מכיל כ 800 גנים המקודדים GPCRs, אשר מופעלים על ידי מגוון של הליגנדים כולל אור, ניחוחי, הורמונים, פפטידים, תרופות ומולקולות קטנות אחרות. קרוב ל -30% מכלל התרופות כיום על GPCRs היעד בשוק משום שהם ממלאים תפקיד גדול מצבי מחלה רב 2. למרות עשרות שנים של עבודה מטה מקיפה נעשתה על מש' קולטן זה, נותר שאלות מצטיינות משמעותיות בתחום, במיוחד לגבי המנגנונים המולקולריים לנהוג אינטראקציות מפעיל GPCR. נכון להיום, רק המבנה הגבישי ברזולוציה גבוהה אחד כבר פורסם, מתן תובנה אינטראקציה בין רצפטור β 2 -adrenergic (β 2 -AR) ואת חלבון G 3. יחד עם מחקר מקיף בשלושת העשורים האחרונים, זה חוזר על רכיב מבני ספציפי אחד כי הוא קריטי זהאינטראקציה: C- הסופי למקטע Gα. מבנה זה הוא חשוב עבור שתי הפעלת חלבון G על ידי מבחר חלבון GPCR 4 ו- G 5-6. לפיכך, הסופית- C Gα על זיקה מכרעת בין גירוי ליגנד של GPCR והפעלה G חלבון סלקטיבית.

מחקר בעשור האחרון מצביע על כך GPCRs לאכלס נוף קונפורמציה רחב, עם ייצוב תת-מחייב ליגנד של תצורות GPCR. בעוד מספר טכניקות, כוללים קריסטלוגרפיה, NMR ספקטרוסקופיה קרינה, ו ספקטרומטריית מסה זמינות לבחון את נוף קונפורמציה GPCR, יש מחסור של גישות להבהיר המשמעות התפקודית שלהם בבחירת מפעיל 7. הנה, הנה תיאור של העברת אנרגיה תהודה Fӧrster (סריג), גישה מבוססת על לזהות תצורות GPCR חלבון-סלקטיבית G. סריג מסתמך על הקרב וכיוון במקביל של שני fluorophores עם פליטת חופפים (תורם) אnd עירור (acceptor) ספקטרה 8. ככל fluorophores התורם acceptor להתקרב יחד כתוצאה משני של שינוי קונפורמציה בחלבון או אינטראקציה חלבון-חלבון, סריג ביניהם גדל, והוא יכול להימדד באמצעות מגוון של שיטות 8. חיישנים ביולוגיים מבוסס סריג להיות מועסקים בהרחבה בתחום GPCR 9. הם שמשו לחקר שינויים קונפורמציה של GPCR ידי החדרת תורם acceptor בלולאה התאית השלישית GPCR C- הסופית; חיישנים עוצבו כדי לחקור GPCR ואינטראקציות מפעיל ידי בנפרד תיוג GPCR ו מפעיל (יחידות משנה חלבון G / arrestins) עם זוג סריג 10; חיישנים מסוימים גם לזהות שינויי קונפורמציה חלבון G 11. חיישנים ביולוגיים אלה אפשרו בתחום לשאול המון שאלות מצטיינים כולל שינויים קונפורמציה GPCR ו מפעיל, קינטיקה אינטראקציה GPCR-מפעיל, ו ligands האלוסטריים 12. הקבוצה שלנוהתעניין במיוחד ביצירת biosensor שיכול לזהות תצורות GPCR חלבון ספציפי G בתנאים מונחה אגוניסט. Biosensor זה מסתמך על טכנולוגיה שפותחה לאחרונה בשם עווית (אפנון כוח זיקת חלבון שיטתי) 13. עווית כרוכה תחומי חלבון אינטראקצית קשירה באמצעות מקשר ER / K, שולטת הריכוזית היעילה שלהם. איגוף ומקשר עם זוג fluorophores סריג יוצר כלי שיכול ולדווח על המצב של יחסי הגומלין בין חלבוני 12. בעבר 1 מודול התכווצות שימש לקשור את C- הסופית Gα על GPCR ולפקח הגומלין שלהם עם fluorophores סריג, mCitrine (המכונה בפרוטוקול זה על ידי גרסה שלה הידוע בכינויו, חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP), עירור / פליטה לשיא 490/525 ננומטר) mCerulean (המכונה בפרוטוקול זה על ידי חלבון ציאן פלורסנט וריאנט שלו הידוע בכינויו (CFP), עירור / פליטה השיא 430/475 ננומטר). מאת N- כדי C- סופי, tפוליפפטיד היחיד שלו המקודד גנטי מכיל: באורך מלא GPCR, סריג acceptor (mCitrine / YFP), 10 ננומטר ER / מקשר K, תורם סריג (mCerulean / CFP), ואת פפטיד הסופית- C Gα. במחקר זה, חיישנים מקוצרים כמו פפטיד GPCR המקשר אורך-Gα. כל הרכיבים מופרדים על ידי מקשר בלתי מובנה (גלאי-שיר-גלאי) 4 המאפשר סיבוב חופשי של כל תחום. האפיון המפורט של חיישנים כאלה בוצע בעבר בעזרת שתי GPCRs אבטיפוס: β 2 -AR ו opsin 1.

חיישן זה הוא transfected זמני לתאי HEK-293T, ספקטרום קרינת מידת ניסויי תא חי מבוסס fluorometer של זוג הסריג ביחידות כלשהן של ספירה לשנייה (CPS) בנוכחות או בהעדר ליגנד. מדידות אלה משמשים לחישוב יחס סריג בין fluorophores (YFP מקסימום / מקס CFP). שינוי סריג (ΔFRET) לאחר מכן מחושב על ידי הפחתת יחס סריג הממוצעשל דגימות מטופל מייחס הסריג של דגימות מטופלים ליגנד. ΔFRET ניתן להשוות ברחבי בונה (β 2 -AR-10 ננומטר-Gαs פפטיד לעומת בטא 2 -AR-10 ננומטר-אף פפטיד). כאן, אנו בפירוט את הפרוטוקול להביע חיישנים אלה בתאי HEK-293T חיים, לפקח הביטוי שלהם, ואת ההתקנה, ביצוע, והניתוח של התא החי מבוסס fluorometer סריג מדידת מטופל מול תנאי מטופלים בתרופה. בעוד פרוטוקול זה הוא ספציפי עבור חיישן פפטיד β 2 -AR-10 ננומטר-Gαs שטופלו 100 מיקרומטר bitartrate isoproterenol, זה יכול להיות מותאם במיוחד בזוגות הליגנדים GPCR-Gα שונים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. DNA כן

  1. חיישן עיצוב בונה באמצעות ערכת שיבוט מודולרי. נא להפנות את עיצוב חיישן β 2 -AR כמפורט לעיל 1.
  2. הכן את ה- DNA על פי פרוטוקול ערכת miniprep מסחריים elute ב 2 mM Tris-HCl פתרון, pH 8, ב ≥ ריכוז 750 ng / μl, 260/280 של 1.7 - 1.9, 260 / A 230 של 2.0 - 2.29.

2. תא הכנת תרבות

  1. תרבות תאים HEK-293T-FLP-n ב DMEM המכיל 4.5 גר '/ ל D- גלוקוז, בתוספת 10% FBS (חום מומת) (v / v), 1% תוספת L- גלוטמין, 20 HEPES מ"מ, pH 7.5 ב 37 ° C באווירה humidified ב 5% CO 2. לטפל בתאים במנדף בטיחות ביולוגית על הצעדים הבאים.
  2. אפשר לתאים לגדול כדי בשכבה ומחוברת לפני passaging לתוך מנות שש היטב. זמן להשיג confluency תלוי צפיפות ציפוי ראשונית. צלחות השתמשולבוא confluency בתוך 1 - 2 ימים של ציפוי עבור שש גם ציפוי. A 10 ס"מ רקמה ומחוברות תרבות שטופלו יש צלחת צפיפות התאים של כ 4 x 10 6 תאים / מ"ל. ראה איור 1 עבור תמונה של צמיחת תרבית תאים.
  3. שטפו תאים עם 10 מ"ל PBS, trypsinize עם טריפסין 0.25% (ראה דיון, פסקה 2). פלייט 8 x 10 5 תאים / גם ב 2 מ"ל של התקשורת ברקמות תרבות שטופלו שש מנות היטב ולאפשר לדבוק עבור 16 - 20 שעות.

3. תנאי Transfection

  1. להתנודד transfections עבור מבנים אשר יחייבו כמויות שונות של זמן כדי להשיג ביטוי אופטימלי (בין 20 - 36 שעות). סנכרון תנאים במשך זמן ניסוי אחיד. כמו כן יש פקד untransfected היטב צפיפות התאים שווה לשמש רעשי רקע וחיסור פיזור במהלך ניתוח.
  2. תביאו ריאגנטים transfection לטמפרטורת החדר: מדיה סרום מופחת, DNA, מגיב transfection.
  3. במכסה מנוע בטיחות ביולוגי לשלב חומרים כימיים בתוך שפופרת microcentrifuge סטרילי לפי הסדר הבא: לערבב DNA 2 מיקרוגרם עם 100 μl מדיה סרום מופחתים. ספייק 6 μl של מגיב transfection לתוך תמהיל המדיה / DNA בלי לגעת פני השטח של תערובת או בצד של הצינור. הגדרת תגובת transfection אחד לכל טוב. תנאי transfection יכולים להיות מותאמים (1 - 4 מיקרוגרם של ה- DNA, 3 - 6 μl של מגיב transfection) להשיג רמות ביטוי עקביות. ראה טבלת מס '1 עבור יחסים מותאמים יותר.
  4. דגירת תערובת על RT במנדף בטיחות ביולוגי במשך 15 - 30 דקות. אין להשתמש תגובה אם נותר כדי לדגור במשך יותר מ -30 דקות.
  5. הוספת תגובה לתאים באופן טיפה חכמה על פני היטב ובעדינות לנער שש היטב כדי להבטיח ערבוב יסודי. הוספת תגובה אחת לכל טוב.
  6. לאחר 20 שעות של ביטוי, קרינה לפקח באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בתרבית רקמה. להעריך ביטוי אוכלוסייה עם 10X לוקליזציה אובייקטיבית חלבון בתא ב 40X. observe לביטוי חלבון הממברנה (PM). אם הפנמה משמעותית יצוין, לפקח transfection עד ביטוי משמעותי מזוהה ב PM.

4. מגיב והכנת הציוד

  1. הכן 100 מניות התרופות מ"מ ולאחסן ב -80 ° C: bitartrate isoproterenol (100 מ"מ ב DH 2 O המכיל 300 חומצה אסקורבית מ"מ). הפוך על הקרח / בחדר קר, להקפיא פלאש מיד. Aliquots יכול להתבצע ומשומשים עד שנה.
  2. הכן תא הצפת (~ 2 מ"ל / מצב) ולאחסן באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. הפוך טרי כל יום. טבלת עזר 2 עבור מרכיבי הצפת תא.
  3. הכן הצפת והתרופות האמריקני (10 מ"ל) ולאחסן בטמפרטורת החדר. טבלת 2 קוד עבור מרכיבי הצפה ותרופות.
  4. חומצה לשטוף cuvettes באמצעות HCl מרוכזת. לנטרל עם בסיס חלש (1 M KOH), וביסודיות לשטוף cuvettes עם DH 2 O.
  5. הכן עבודה לתחנה בסביבות fluorometer עם כמהקופסאות של 10, 200, ו -1,000 טיפים פיפטה μl, טיימר להגדיר עם ספירה לאחור 10 דקות, קו ואקום נגיש עם טיפים לניקוי קובט, מגבונים משימה עדינה, ואת בקבוק להשפריץ עם ultrapure H 2 O.
  6. מחממים באמבט מים חיצוני עבור בלוק fluorometer וחום עד 37 ° C.
  7. הפעל fluorometer; להגדיר תוכנית איסוף הקרינה לאיסוף CFP כדי עירור 430 ננומטר, bandpass 8 ננומטר; פליטת טווח 450 ננומטר - 600 ננומטר, bandpass 4 ננומטר. לקבלת אוסף YFP רק כשליטה חיישן (ראה דיון) עירור סט ל -490 ננומטר, bandpass 8 ננומטר, טווח פליטה 500 - 600 ננומטר, bandpass 4 ננומטר. הגדרות אוסף CFP ישמש לרכישת ספקטרום סריג בניסוי הזה.
  8. מניחים עשר 1.5 מ"ל צינורות microcentrifuge בבלוק חום כפי שמוצג באיור 2 להלן. צינורות אלה הם בעלי צינורות התא aliquot (500 μl צינורות microcentrifuge.) מניח חתיכה קטנה של רקמת מחזיקי 1 ו -7 לרכך את cuvettes הנכתב כאן.
    הערה: השתמש cuvettes נפרד עבור מצב לא מטופל ומצבו התרופה כדי למנוע זיהום צולב.

figure-protocol-1
Tube איור 2. Microcentrifuge הגדרה והפנית עמדה בבלוק חום קובט עבור דגימות מטופל נמצא במצב 1.; צינורות התא aliquot נמצאים בעמדות 2 - 6. קובט עבור דגימות סמי מטופלים נמצאים בעמדה 7; צינורות תא aliquot נמצאים בעמדות 8 - 12. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

  1. מלאו בעלי 2 - 6 ו 8 - 12 עם ~ 750 μl של מים כדי ליצור C אמבט מים מיני 37 מעלות.
  2. מניחים עשר 500 צינורות microcentrifuge μl עבור aliquots התא לתוך אמבטיות מיני-מים (בעלי 2 - 6, 8 - 12). כל שפופרת תהיה חוזרות פרט של המצב (5 untreateד, 5 סמים מטופלים).
  3. צג התאים לביטוי (ראה שלב 3.6).

ניסוי 5. & איסוף נתונים

figure-protocol-2
איור 3. ניסיונותיי סכמטי. מדריך צעד חכם מפורט הניסיון להגדיר וביצוע. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

  1. הפניה איור 3 עבור סכמטי ניסיוני. כאשר התאים מוכנים להיות שנקטפו, מבוסס על ביטוי חלבון מזוהה עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי (ראה דיון, פסקה 4): במנדף בטיחות ביולוגית, הסר בעדינות ~ 1 מ"ל של התקשורת, תאים resuspend בתרבות שלהם עם P1,000 ולהעביר resuspension לתוך צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge.
    הערה: הימנע משימוש טריפסין כפי שהוא עשוי לעכל את N- הסופית ו /או מחייב בכיס של החיישן GPCR.
  2. ספירת תאים על מנת להבטיח צפיפות תאים נאה resuspension. מטב נפח resuspension עבור 4 x 10 6 תאים / מ"ל.
  3. ספין תאי צנטריפוגות דלי מתנדנד בטמפרטורת חדר, 290 XG במשך 3 דקות. הסר supernatant לאחר צנטריפוגה.
  4. בעדינות resuspend תאי 1 מיליליטר תא הצפה (מאוחסנת על 37 מעלות צלזיוס) וחזור על שלב 5.3. במהלך ספין השני, לאסוף aliquot המניות התרופה 100 מ"מ מ -80 מעלות צלזיוס. הפוך 1: 100 דילול ב הצפת והתרופות 1 מ"מ המניות לעבוד ולשמור ב RT.
  5. לאחר צנטריפוגה השני, להסיר supernatant ותאי resuspend בעדינות 1 מ"ל של תא הצפת (4 x 10 6 תאים / מ"ל). OD מדוד 600 של המדגם בשנת ספקטרופוטומטר באמצעות 1 מ"ל של תאים 1 מ"ל של תא הצפת בתור ריק. לוותר תאי קובט פלסטיק חד פעמי ולהעביר בחזרה אל צינור microcentrifuge מייד לאחר spectrophotometry.
  6. במשך cel מלא untransfectedספקטרום מצב l, בעדינות resuspend תאים untransfected ב 1 מ"ל תא הצפת עם P1,000 pipet, להוסיף 90 μl של תאים כדי קובט ולרכוש ספקטרום סריג ב ננומטר עירור 430, bandpass 8 ננומטר, פליטת 450 - 600 ננומטר, bandpass 4 ננומטר. אסוף 3 - 5 ספקטרה חוזרים עם 90 μl הטרי של תאים. לשמור על מלאי של התאים ב 37 ° C בין המשקפיים, resuspend בעדינות עם P1,000 בין כל aliquot מדגם, ולשטוף קובט עם ultrapure H 2 O בין דגימות.
  7. לקבלת תנאי ניסוי, aliquot 90 μl של תאי transfected לכל אחד 500 צינורות μl בבעלים 2 - 6, 8 - 12 בבלוק החום. בעדינות resuspend המניות של תאים עם pipet P1,000 בין כל aliquot.
  8. לאחר התאים aliquoted, להוסיף 10 μl של הצפת והתרופות לצינורות 2 - 6 עבור דגימות מצב לא מטופל.
  9. בגין הניסוי על ידי הוספת 10 μl של פתרון התרופה 1 מ"מ לתוך צינור 8, להפעיל את הטיימר כדי ספירה לאחור מ 10 דק ', ו לערבב בעדינות צינור עם pipet P200. צינור והחזר קרוב 37° גוש חום C.
  10. מיד להרים שפופרת 2, ומערבבים בעדינות עם P200 (השתמש טיפ חדש), להוסיף 90 μl של ההשעיה התא קובט מצב לא מטופל, ומניחים fluorometer.
  11. רוכשת ספקטרום סריג ב ננומטר עירור 430, bandpass 8 ננומטר, פליטת 450 - 600 ננומטר, bandpass 4 ננומטר.
  12. בשעה 9 דק '- 10 שניות, ספייק צינור 9 ​​עם 10 μl של פתרון התרופה 1 מ"מ, לערבב בעדינות עם P200 (השתמש טיפ חדש), ולחזור צינור לחמם גוש.
  13. חזור על שלבים 5.10 - 5.11 עם צינור 3 ו 5.12 עם צינור 10.
  14. חזור על שלבי 5.10 - 5.13 ב 1 במרווחי דקות (08:10, 07:10, וכו ') עד ספקטרה נאסף עבור כל דגימות המצב לא המטופל, ואת התרופה נוספה לכל דגימות מצב סמים. השתמש טיפ טרי לכל שלב pipet כדי למנוע זיהום צולב.
  15. בשעה 5 דק '- 10 שניות, להתחיל ערבוב צינור 8 (מצב סמים) בעדינות עם pipet P200, להוסיף 90 μl של ההשעיה התא קובט נפרד עבור מדגם סמים מטופלים ומניחים fluorometer.
  16. רוכשת Fספקטרום RET (ראה שלב 5.11 עבור הגדרות).
  17. חזור על שלבי 5.15 - 5.16 ב 1 במרווחי דקות (04:10, 03:10, וכו ') עבור דגימות מצב תרופה נותרות (צינורות 9 - 12).
  18. לאחר הניסוי נגמר, לשמור קבצי פרויקט, ביסודיות לשטוף cuvettes עם ultrapure H 2 O, ו מחדש מניות צינורות עבור התנאי הבא. תשמור על עצמך כדי למנוע זיהום צולב בשלב לשטוף. שנה את הטיפ על בקבוק O H 2 וכן על קו הוואקום בין השוטף.

6. ניתוח נתונים

  1. שמור וקבצי נתוני יצוא SPC לפרמט כדי לשמש לניתוח. תוכניות ניתוח זמינות להורדה מאתר האינטרנט של פרסום מעבדת Sivaramakrishnan.
  2. יצירת קבצי נתיב עבור תוכנת ניתוח הכוללים תוכניות הניתוח (v9, v15), קבצי דגימות untransfected (ראה שלב 5.6 לאיסוף ספקטרום תא untransfected), קובץ נתוני תפוקה, ו ערכים מופרדים בפסיקים (CSV) קבצים עבור הזנת נתונים.
  3. זן המידע הבאלתוך קובץ CSV (ראה מדגם בטבלה 3) ולקבוע תנאים שמתאימים לכל מדגם, כולל:
    שם קובץ - קבצי גרף SPC פרט
    קולטן - המיועד אשר מבנה GPCR נבדק (למשל, Β2)
    בינדר - מיועד אשר גרסת פפטיד של המבנה נבדקה (למשל, S)
    אגוניסט - לייעד מטופל (N) או טיפול תרופתי (ד) תנאים
    מדריך - את נתיב התיקייה שבה הקבצים SPC נשמרים, בדרך כלל מאורגן לפי תאריך
    OD - רשם צפיפות אופטית של מדגם מתוך ספקטרופוטומטר
  4. זן שמות קבצים עבור דגימות untransfected (שלב 5.6) כדי להפחית חיץ ורעש פיזור ממדגמים.
  5. זן תנאי לתוך תכנית ניתוח.
  6. תוכניות הפעלה לנתח דגימות בתוך תנאי פרט (v9) ועל פני תנאים (v15).
  7. אל תכלול קבצים מדגמים שהן חריגות לכאורה בערכת הנתונים, או להתאים עבור חיסור ידי הגדלה או הקטנת ערך OD של indiviקבצים כפולים.
  8. נתוני יצוא לקובץ פלט עבור גישה מחושבת סריג יחסי (525 ננומטר / 475 ננומטר).
  9. חישוב ΔFRET על ידי הפחתת יחס הסריג הממוצע עבור מצב לא מטופל מן יחסי סריג פרט תנאי מטופלים (סמים).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

סכימטי כללי של הגדרת הניסוי וביצוע מפורט באיור 3.

כדי להבחין בשינוי סריג בטווח הדינמי הצר של החיישן, זה קריטי לדבוק הניואנסים של המערכת להיות דבק. איכות תא קיימת הכרח ביטוי חלבון וכן עקביות דגימה. איור 1 תכונות תמונות של תאים בתרבית גדלו בשכבה עקבית (10X) כי הוא אופטימלי עבור שש גם ציפוי ו transfection איור 1 (א) ותאים הגדלים בדפוסים בכבדות להוביל כי לצורות הדנדר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הטווח הדינמי החזק של מדידות סריג במערכת זו מחזק את הצורך של בקרת איכות רגישה בכל שלב של פרוטוקול זה. השלבים החשובים ביותר כדי להבטיח ניסוי סריג מוצלח הם 1) culturing תא, 2) transfection 3) ביטוי חלבון ו -4) בזמן, תיאום מדויק במהלך ביצוע assay.

Cell בריאות ואיכות תחזוקה / ציפוי יכולות להיות השפעה משמעותית על אות לרעש של המערכת הניסיונית ובריאות תא עניה יכולים לעשות את זה בלתי אפשרי לזהות כל שינוי עקבי סריג. שמרני,...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים מתחרים.

תודות

רום מומן על ידי הקרן איגוד הלב האמריקני קדם דוקטורט (14PRE18560010). המחקר מומן על ידי מענק פיתוח American Heart Association המדען (13SDG14270009) & NIH (1DP2 CA186752-01 & 1-R01-GM-105,646-01-A1) ל SS

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
B2-AR-10 ננומטר-חיישן פפטיד גזAddgene47438https://www.addgene.org/Sivaraj_Sivaramakrishnan/
GeneJET פלסמיד מיני-פרפ ערכתFermentas/Fisher SciFERK0503Elute in 2 מ"מ Tris מאגר פליטה
תאי HEK-293T-Flp-n LifeTechnologiesR78007
טריפסין (0.25%)Life Technologies25200056
DMEM- גלוקוז גבוהLife Technologies11960-044חם ב  37 מעלות; אמבט מים C לפני השימוש
FBS, מוסמך, מושבת בחום, שמקורו בארה"בLife Technologies10082147
Glutamax I 100xLife Technologies35050061
HEPESCorningMT25060CL
Opti-MEMLife Technologies31985-070מדיית סרום מופחתת; הביאו ל-RT לפני השימוש
XtremeGene HP transfection reagenetRoche6366236001מומלץ מאוד בשל העקביות שלו. הביאו ל-RT לפני השימוש
ב-FluoroMax 4Horibaעם תוכנת FluorEssence V3.8
קובטת קוורץ באורך נתיב 3 מ"מStarnaNC9729944(16.45F-Q-3/z8.5)עשוי לדרוש מחזיק/מתאם קובטה לשימוש בפלואורומטר, זמין מ-Starna
Sc100-S3 משאבת אמבט מים מחוממת במחזורפישר סיינטיפיק13-874-826חם ל-37 מעלות; C לפני השימוש
Thermomixer Heat BlockEppendorf22670000חם ל-37 מעלות; C לפני השימוש
מים נטולי DNA/RNAse טהוריםLife Technologies10977015 שימוש ב-RT
D(+)-גלוקוז,G5767
אפרוטינין מריאות בקרסיגמאA1153
לופפטין המיסולפטEMD10-897
חומצה L-אסקורבית, דרגת ריאגנטסיגמאA0278
(-)- איזופרוטרנול (+)-ביטרטרטסיגמאI2760השתמש בכל ניסוי טרי
שימוש במיוחד אסימא נטול מים

מקורות

  1. Malik, R. U., et al. Detection of G Protein-selective G Protein-coupled Receptor (GPCR) Conformations in Live Cells. J. Biol. Chem. 288, 17167-17178 (2013).
  2. Oldham, W. M., Hamm, H. E. Heterotrimeric G protein activation by G-protein-coupled receptors. Nat. Rev. Mol. Cell Bio. 9, 60-71 (2008).
  3. Rasmussen, S. G., et al. Crystal structure of the β2 adrenergic receptor-Gs protein complex. Nature. 477, 549-555 (2011).
  4. Alexander, N. S., et al. Energetic analysis of the rhodopsin-G-protein complex links the α5 helix to GDP release. Nat. Struct. Mol. Biol. 21 (1), 56-63 (2014).
  5. Conklin, B. R., Farfel, Z., Lustig, K. D., Julius, D., Bourne, H. R. Substitution of three amino acids switches receptor specificity of Gqα to that of Giα. Nature. 363, 274-276 (1993).
  6. Conklin, B. R., et al. Carboxyl-Terminal Mutations of Gqα and Gsα That Alter the Fidelity of Receptor Activation. Mol. Pharmacol. 50, 855-890 (1996).
  7. Onaran, H. O., Costa, T. Where have all the active receptor states gone. Nat. Chem. Bio. 8, 674-677 (2012).
  8. Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. FRET imaging. Nat Biotechnol. 21 (11), 1387-1395 (2003).
  9. Lohse, M. J., Nuber, S., Hoffman, C. Fluorescence/bioluminescence resonance energy transfer techniques to study G-protein-coupled receptor activation and signaling. Pharmacol Rev. 64 (2), 299-336 (2012).
  10. Vilardaga, J. P., Bünemann, M., Krasel, C., Castro, M., Lohse, M. J. Measurement of the millisecond activation switch of G protein-coupled receptors in living cells. Nat. Biotechnol. 21, 807-812 (2003).
  11. Bünemann, M., Frank, M., Lohse, M. J. Gi protein activation in intact cells involves subunit rearrangement rather than dissociation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (26), 16077-16082 (2003).
  12. Stumpf, A. D., Hoffman, C. Optical probes based on G protein-coupled receptors - added work or added value. Brit. J. Pharmacol. 173, 255-266 (2016).
  13. Sivaramakrishnan, S., Spudich, J. A. Systemic control of protein interaction using a modular ER/K α-helix linker. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108, 20467-20472 (2011).
  14. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat. Methods. 2 (12), 905-909 (2005).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

G2mCerulean mCitrineFRET
G- חלבון סלקטיבית GPCR תצורות נמדדו באמצעות סריג חיישנים ב assay fluorometer השעית תא חי
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.