מאמר שיטה

LED Thermo Flow - שילוב Optogenetics עם cytometry זרימה

DOI:

10.3791/54707

⸱

30 בדצמבר 2016

 ,  ,  , 
1Max-Planck Institute for Immunobiology und Epigenetics, 2Spemann Graduate School of Biology and Medicine (SGBM), University of Freiburg, 3Centre for Biological Signaling Studies, BIOSS, University of Freiburg, 4Albert-Ludwigs-Universität, 5Institute for Biology III (Mol. Immunology), Albert-Ludwigs-Universität

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חומרים מבוקרים אופטית הם כלים רבי עוצמה לחקר מסלולי איתות. כדי להרחיב את ספקטרום הניסויים האפשריים, פיתחנו מכשיר לחקר חומרים מבוקרים אופטית בזמן אמת באמצעות ציטומטריית זרימה: LED Thermo Flow.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כלים אופטוגנטיים מאפשרים חקירות מבודדות ופונקציונליות של כמעט כל מולקולת איתות במסלולי איתות מורכבים. מכשול מרכזי הוא אספקה מבוקרת של אור לדגימת התא ומכאן שהכלים הפופולריים ביותר למחקרים אופטוגנטיים הם ניתוחי תאים מבוססי מיקרוסקופיה וניסויים במבחנה. לציטומטר הזרימה יתרונות גדולים על פני מיקרוסקופ, כולל היכולת למדוד במהירות אלפי תאים ברזולוציית תא בודד. עם זאת, הוא עדיין לא נמצא בשימוש נרחב באופטוגנטיקה. כאן, אנו מציגים מכשיר המשלב את הכוח של אופטוגנטיקה וציטומטריית זרימה: LED Thermo Flow. מכשיר זה מאיר תאים באורכי גל ספציפיים, עוצמות אור וטמפרטורות במהלך מדידות ציטומטריות זרימה. ניתן לבנות אותו בעלות נמוכה ולהשתמש בו עם ציטומטרי הזרימה הנפוצים ביותר. כדי להדגים את התועלת שלו, אפיינו את קינטיקה של החלפת תמונות של חלבוני Dronpa in vivo ובזמן אמת. ניתן להתאים פרוטוקול זה כמעט לכל החומרים המבוקרים אופטית ומרחיב באופן משמעותי את מערך הניסויים האפשריים. חשוב מכך, זה יפשט מאוד את הגילוי והפיתוח של כלים אופטוגנטיים חדשים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כלים optogenetic כבר צובר פופולריות, בין השאר משום שהם יכולים לשמש כדי לפענח את החיווט של מסלולי איתות 1-4. הם מבוססים על היכולת של חלבונים photoactivatable לשנות זיקה קונפורמציה ומחייבת שלהם, כאשר מואר באור. פיוזינג חלבונים אלה לאלמנטי איתות מאפשר להסדרה הספציפית של שחקן יחיד בתוך מסלולי איתות תאיים מורכבים 5-12. כתוצאה מכך, מסלול איתות ניתן ללמוד עם רזולוציה של זמן ומרחב גבוה.

רוב המחקרים optogenetic מבוססי תאים לנצל שיטות מיקרוסקופיה מבוססת בשילוב עם culturing בנוכחות אור, ואחריו ניתוח ביוכימיים 11,12. לעומת זאת, cytometer זרימת singularizes תאים לאורך נימים ומודד גודל תא, גרעיניות ו עוצמות קרינה. לשיטה זו יתרונות גדולים על פני שיטות מיקרוסקופיה או ביוכימיות, כולל היכולת לנתח thousands של תאים חיים ברזולוצית תא בודד בתוך זמן קצר מאוד. לפיכך, רצוי לשלב optogenetics עם cytometry הזרימה.

למיטב ידיעתנו, אין פרוטוקול הוקם עבור cytometry זרימת optogenetic. הליך מקובל רחב הוא להאיר תאים ידניים מחוץ צינור התגובה עם התקני פנס. עם זאת, תאורה ידנית את זרימת cytometer מחייבת לאור לעבור דרך צינור התגובה, הדמית תא חייה, גלילית, תא מים מחומם. זה גורם פיזור אור משמעותי ואובדן האור. יתר על כן, את עוצמת האור שמספקת תאורת מדריך אינה לשחזור בין ניסויים (זווית, מרחק וכו ') ויש מגבלה מעשית על מספר אורכי גל בניסוי אחד.

על ידי בניית מכשיר זרימת LED Thermo, הצלחנו להתגבר על המגבלות האלה. בעזרת התקן זה, אפשר להאיר תאים עם אורכי גל ספציפיים עובד זמניerature שבשליטת בצורה במהלך המדידות תזרים cytometric. זה מאפשר כמויות מדויקות לשחזור של אור בתוך ובין ניסויים.

כדי להדגים את התועלת של המכשיר שלנו in vivo, הקלטנו את אותות הקרינה של Dronpa בתאים ראמוס B במהלך photoswitching. תאי ראמוס B נגזרים לימפומה אדם Burkitt. Dronpa הוא חלבון פלואורסצנטי שקיים בתור מונומר, דימר או tetramer. בצורתו monomeric שלה, היא פלורסנט שאינן. תאורה עם 400 ננומטר אור גורם dimerization ו tetramerization והופך את חלבון פלואורסצנטי Dronpa. תהליך זה יכול להיות הפוך על ידי תאורה עם 500 ננומטר אור. חלבון Dronpa נעשה שימוש כדי לשלוט בפונקציית ומיקום של איתות חלבונים 4,13.

כאן, הביע לנו חלבון Dronpa-לינקר-Dronpa בתאי B ראמוס ללמוד photoswitching של Dronpa ב cytometer זרימה. השימוש במכשיר שלנו, הצלחנו ביעילותreproducibly photoswitch Dronpa בעת ההקלטה עוצמת הקרינה שלה בזמן אמת. שיטה זו מספקת יתרונות משמעותיים על פני פרוטוקולי תאורה נוכחיים עם תאורה ידנית באופן משמעותי מרחיבה את רפרטואר ניסיוני כלי optogenetic ותרכובות כלוב. השימוש במכשיר שלנו תפשט בצורה משמעותית להאיץ גילוי ופיתוח של כלים optogenetic הרומן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תכנון 1. בונה את ההתקנים

  1. ניסויי פיילוט
    הערה: עוצמת האור הנדרשת עבור סוג כלי תאים ספציפי optogenetic עשויה להשתנות באופן משמעותי. ניסויי פיילוט עם טיפוס שימושיים להעריך את עוצמת האור המינימאלית הכרחית. כלי optogenetic המשמש בניסויים הבאים הוא היתוך לבנות Dronpa-לינקר-Dronpa. רצף Dronpa הושג מסחרי (ראה רשימת חומרים). מקשר ארוך שובט בין שני רצפים Dronpa לאפשר לבנות הביע לגבש intramolecular (ו מולקולאריים) הדימרים. השלבים המתוארים להלן ניתן להתאים כלים רבים optogenetic אחרים או חומרים מפוקחים אופטי.
    1. Transduce לימפוציטים ראמוס B עם מבנה המכיל Dronpa-לינקר-Dronpa בעקבות הוראות היצרן עבור התמרה באמצעות supernatant retroviral המכילים מתאי אריזות. קציר ותאי לספור על פי מראשviously שפורסם פרוטוקול 13.
    2. תאים Resuspend בריכוז של 1 x 10 6 / מ"ל במדיום (RPMI 1640, 10% חום מומת FCS, 2 מ"מ L- גלוטמין, 100 פניצילין U / mL, 100 סטרפטומיצין U / mL, ו -50 מיקרומטר 2-mercaptoethanol) ולהעבירם שפופרת זכוכית FACS.
    3. הכנס את הצינור לתוך cytometer זרימה ולמדוד את עוצמת הקרינה של Dronpa (ערוץ GFP) 14,15.
    4. יש להרכיב משקפיים מגן לכל צעדים נוספים כדי להגן על העיניים מפני אורכי גל ופעולה זו עלולה לפגום.
    5. באופן ידני למקם אור LED 500 ננומטר על החלק החיצוני של הצינור ולהמשיך מדידת עוצמת הקרינה של Dronpa.
    6. יש להעלות את מספר ו / או עוצמת נורות LED עד עוצמת הקרינה Dronpa פוחתת.
    7. באופן ידני למקם אור LED 400 ננומטר על החלק החיצוני של הצינור ולהמשיך מדידת עוצמת הקרינה של Dronpa.
    8. יש להעלות את מספר ו / או עוצמת נורות LED עד fluo Dronparescence עליות בעצמה.
    9. השתמש לפחות כמו רבים נורות LED לבניית המכשיר כפי שחזה להיות הכרחי מן photoswitching בצעדים 1.1.5 ו 1.1.7.
  2. בונה את המכשיר
    הערה: המכשיר נבנה על ידי חנות עיבוד מקצועי, Technik Arbeitsgruppe מאוניברסיטת פרייבורג. רוב החלקים עשויים מותאם אישית ולא זמין מסחרית. את המידות המדויקות של כל חלק מתוארים איורים 1 ו -2. כדי להבהיר את ההרכבה של המכשיר הזה, משלים וידאו 1 מסופק ואת הצעדים החיוניים ביותר מתוארים להלן.
    1. חתיכת מיל מ פוליוויניל כלוריד (PVC) עם המידות המדויקות מוצגות באיור 1 א.
    2. הכנס נורות LED לתוך חורים שנקדחו של פיסת A ו- לאטום כל חור עם דבק PVC כדי למנוע דליפת מים.
    3. חבר נוריות שנאי רב (כל אורך גל צריך לתפוס מקום chann נפרדאל) עם כוח תפוקה מתכווננת מ 0-29 mA.
    4. צרף המעטפת החיצונית (B) עם 3 ברגים ליצירה כמשוואה מתואר להגן על נוריות מפני נזק פיזי.
    5. כדי שניתן יהיה לחבר את המכשיר משאבת מים, דבק וידאו קליפים צינור (C) לתוך חורים שנקדחו של פיסת A (מתואר באיור 1 א, חתך Y: 9 מ"מ ו 61.5 מ"מ) באמצעות דבק PVC.
    6. חותכי צינור פרספקס 58.5 מ"מ אורך (D1).
    7. ייצור חלקים D2 ו- D3 פרספקס כמתואר באיור 2.
    8. חתיכת דבק D3 לתחתית D1 עם דבק פרספקס.
    9. צרף O-Ring גומי חתיכת D2 ודבק אותה לחלק העליון של D1 עם דבק פרספקס.
      הערה: חתיכות D1, D2 ו- D3 יחדיו פיסת ד
    10. הכנס חתיכת D לתוך חתיכת A עם 3 ברגים.
    11. בדיקת ההתקן עבור דליפת מים לפני החלת כוח השנאי.

2. מדידת קינטיקה של כלי optogenetic

  1. כן תאים
    1. התרבות תאים ראמוס B ב RPMI-בינוני (RPMI 1640, 10% חום מומת FCS, 2 מ"מ L- גלוטמין, 100 פניצילין U / mL, 100 סטרפטומיצין U / mL, ו -50 מיקרומטר 2-mercaptoethanol) בצפיפות של 3 10 x 10 6 תאים / מ"ל ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
    2. קציר ראמוס B התאים על ידי צנטריפוגה ב XG 350 ו -4 C ° למשך 5 דקות.
    3. ספירת תאים באמצעות תא ספירה נויבאואר בעקבות הוראות היצרן ו resuspend 1-5 x 10 6 תאים 600 בינוני μL.
    4. מעבירים את התאים לצינור FACS זכוכית, לשים אותם על הקרח ולהגן עליהם מפני האור עד המדידה.
  2. הכן את cytometer הזרימה ואת המכשיר.
    1. חבר את התקן משאבת מים מחוממת ולהתאים את הטמפרטורה ל -37 מעלות צלזיוס.
    2. בעת שימוש צינורות זכוכית FACS, להחליף את האטם השחור של זרימת cytometer עם גומי O-Ring ובנוסף להחיל סיליקון גרקַלוּת.
  3. מדידה
    1. בזהירות להכניס את שפופרת זכוכית FACS לתוך המכשיר ולחבר אותו cytometer את הזרימה (איור 3).
    2. התחילו את המדידה ולהקליט Dronpa עוצמת פלורסנט (ערוץ GFP).
    3. להאיר את המדגם התא עם 400 ננומטר או 500 ננומטר אור בהתאמה ולהקליט את עוצמת הקרינה Dronpa (ערוץ GFP).
  4. ניתוח נתונים
    1. לנתח נתוני ניסוי עם זרימת מתאים cytometer תוכנה. העלילה פיזור קדימה נגד פיזור הצידה ואת השער התאים החיים. מגרש את עוצמת הקרינה Dronpa לאורך זמן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

באמצעות תזרים LED Thermo עם Cytometer זרימה

הליבה התפקודית של המכשיר היא תא גלילי שבו נורה LED מסודרים באופן מעגלי מצביע פנימה. תא זה יכול להיות מחובר לאספקת מים משאבה, המאפשרת שליטה על הטמפרטורה של נוריות, כמו גם מדגם התא. הנוריות מחוברות שנאי ומכאן עוצמת האור עבור כל אורך גל ניתן לשלוט בנפרד. המרכז של המכשיר יכול להכיל צינור FACS בגודל סטנדרטי, אשר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

The Flow LED Thermo הוא מכשיר חדשני ללמוד כלי optogenetic בתוך cytometer זרימה.

עד כה, דגימות optogenetic כבר מואר רק עם לייזרים מיקרוסקופיה או מכשירים פנס 11,12. בהתאם לזווית והמרחק של הפנס המדגם, לשונות נכרתו את כמות התאורה צפויה בין ניסויים. יתר על כן, קיימת הגבלה על המספר של פנסי אדם אחד יכול לפעול ניסוי. זה מגביל את רפרטואר שחזור ניסיוני. מגבלות אלה טופלו במהלך הפיתוח של המכשיר שלנו, אשר ניתן להשת...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לג'יי שמידט מאוניברסיטת פרייבורג על בניית המכשיר. אנו מודים ל-P. Nielsen ו-D. Medgyesi על תמיכתם וקריאתם הביקורתית של כתב היד הזה. מחקר זה נתמך על ידי Deutsche Forschungsgemeinschaft באמצעות SFB746 ועל ידי יוזמת המצוינות של קרן המחקר הגרמנית (GSC-4, Spemann Graduate School).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צינור FACS מזכוכיתThermo Fisher Scientific; וולת'אם, ארה"ב14-961-26צינורות זכוכית בורוסיליקט 12x75 מ"מ
ציטומטר זרימהBD Bioscienceg; היידלברג, גרמניהFortessa IIהזמנה מיוחדת
Dronpa: pcDNA3-mNeptune2-NAddgene; קיימברידג', ארה"ב41645
PolyJetSignaGen, רוקוויל, ארה"בSL100688
LED 505 ננומטרAvago Technologies; Boeblingen, גרמניהHLMP-CE34-Y1CDD
LED 400 ננומטרAvago Technologies; Boeblingen, גרמניהUV5TZ-400-15
צינור פרספקס 15 מ"ממארטין; פרייבורג, גרמניה76999
פרספקס 3 מ"ממארטין; פרייבורג, גרמניה692230
פרספקס 2.5 מ"ממארטין; פרייבורג, גרמניה692225
פרספקס 1.5 מ"ממארטין; פרייבורג, גרמניה692215
אריחי PVC 5 מ"ממארטין; פרייבורג, גרמניה690020.005
אריחי PVC 6 מ"ממארטין; פרייבורג, גרמניה690020.006
בלוק PVC 50 מ"ממארטין; פרייבורג, גרמניה690020.050
RPMIInvitrogen, Life Technologies; דרמשטדט, גרמניה61870-010
2-מרקפטואתנולEMD; גרמניה805740
FCSPAN Biotech; איידנבך, גרמניהP30-3302
פניצילין/סטרפטומיצין (10,000 יח'/מ"ל)Invitrogen, Life Technologies; דרמשטדט, גרמניה15140-122
דבק פרספקס AcrifixEvonic Industries, אסן, גרמניה1R0192
דבק Tangit PVC-UHenkel, Dü sseldorf, גרמניה

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dugue, G. P., Akemann, W., Knopfel, T. A comprehensive concept of optogenetics. Prog Brain Res. 196, 1-28 (2012).
  2. Tischer, D., Weiner, O. D. Illuminating cell signalling with optogenetic tools. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (8), 551-558 (2014).
  3. Toettcher, J. E., Voigt, C. A., Weiner, O. D., Lim, W. A. The promise of optogenetics in cell biology: interrogating molecular circuits in space and time. Nat Methods. 8 (1), 35-38 (2011).
  4. Zhang, K., Cui, B. Optogenetic control of intracellular signaling pathways. Trends Biotechnol. 33 (2), 92-100 (2015).
  5. Bugaj, L. J., Choksi, A. T., Mesuda, C. K., Kane, R. S., Schaffer, D. V. Optogenetic protein clustering and signaling activation in mammalian cells. Nat Methods. 10 (3), 249-252 (2013).
  6. Bugaj, L. J., et al. Regulation of endogenous transmembrane receptors through optogenetic Cry2 clustering. Nat Commun. 6, 6898(2015).
  7. Strickland, D., et al. TULIPs: tunable, light-controlled interacting protein tags for cell biology. Nat Methods. 9 (4), 379-384 (2012).
  8. Taslimi, A., et al. An optimized optogenetic clustering tool for probing protein interaction and function. Nat Commun. 5, 4925(2014).
  9. Toettcher, J. E., Gong, D., Lim, W. A., Weiner, O. D. Light-based feedback for controlling intracellular signaling dynamics. Nat Methods. 8 (10), 837-839 (2011).
  10. Toettcher, J. E., Weiner, O. D., Lim, W. A. Using optogenetics to interrogate the dynamic control of signal transmission by the Ras/Erk module. Cell. 155 (6), 1422-1434 (2013).
  11. Wang, J., et al. Utilization of a photoactivatable antigen system to examine B-cell probing termination and the B-cell receptor sorting mechanisms during B-cell activation. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (5), E558-E567 (2016).
  12. Wend, S., et al. Optogenetic control of protein kinase activity in mammalian cells. ACS Synth Biol. 3 (5), 280-285 (2014).
  13. Zhou, X. X., Chung, H. K., Lam, A. J., Lin, M. Z. Optical control of protein activity by fluorescent protein domains. Science. 338 (6108), 810-814 (2012).
  14. Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. J Immunol Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
  15. Givan, A. L. Flow cytometry: an introduction. Methods Mol Biol. 699, 1-29 (2011).
  16. Brakemann, T., et al. A reversibly photoswitchable GFP-like protein with fluorescence excitation decoupled from switching. Nat Biotechnol. 29 (10), 942-947 (2011).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Optogenetics Flow CytometryLED Thermo FlowPhotoswitching KineticsDronpa ProteinsFluorescence IntensityLight IntensityWavelength LEDsFlow Cytometric MeasurementsCell Signaling PathwaysRamos B Lymphocytes

מאמרים קשורים