מאמר שיטה

גישה חלופית עבור הכנת דוגמאות עם מספר סלולרי נמוך עבור ניתוח TEM

13.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/54724

⸱

12 באוקטובר 2016

 , 
1Division of Experimental Hematology and Cancer Biology, Cincinnati Children’s Research Foundation

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להכנת דגימות עם מספרי תאים נמוכים לניתוח מיקרוסקופ אלקטרונים שידור (TEM).

תקציר

במיקרוסקופ אלקטרוני הילוכים (TEM) ניתן פרטים על ארגון ultrastructure הסלולר. עם זאת, ניתוח TEM של אוכלוסיות תאים נדירות, במיוחד התאים בתרחיף כמו בתאי גזע hematopoietic (HSCs), נשאר מוגבל בשל הדרישה של מספר תאים גבוה במהלך הכנת המדגם. ישנן כמה גישות cytospin או בשכבה לניתוח TEM ממדגמים נדירים, אבל הגישות האלה לא מצליחות לקבל נתונים כמותיים משמעותיים מהמספר המצומצם של תאים. הנה, גישה חלופית ורומן להכנת מדגם במחקרי TEM מתוארת על אוכלוסיות תאים נדירות המאפשרות ניתוח כמוני.

מספר תאים נמוך יחסית, כלומר, 10,000 HSCs, שימש בהצלחה לניתוח TEM לעומת מיליוני תאים המשמשים בדרך כלל ללימודי TEM. בפרט, מכתים אוונס הכחול בוצע לאחר paraformaldehyde-glutaraldehyde (PFA-GA) קיבעון לדמיין את pel התא הזעירבואו, אשר הקלו מוטבע agarose. אשכולות של תאים רבים נצפו בסעיפים דקים. היו תאי מורפולוגיה השתמרה היטב, ואת הפרטים אולטרה-המבניים של המיטוכונדריה המורכב וכמה Golgi נראו. פרוטוקול יעיל, קל לשחזור זו מאפשר הכנת מדגם ממספר תא נמוך וניתן להשתמש בו לצורך ניתוח TEM איכותי וכמותיים על אוכלוסיות תאים נדירות מ דגימות ביולוגיות מוגבלות.

מבוא

Ultra-מבניים תת-אברון הפרטים של תאים נחשפו בעיקר על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים הילוכים (TEM) מחקרים מרקמות או כדורי תא 1,2. חתיכות מוצקות של רקמות יכולות בקלות להיות מנוצלות ללימודים במיקרוסקופ אלקטרונים. עם זאת, TEM מנתח 1,3 על תאים בתרחיף להישאר מאתגר להצריך מספרים סלולריים גבוהים, כלומר, מיליוני תאים. בגלל זה, ניתוחים אולטרה-מבניים של אוכלוסיות תאי נדירות השעיה, למשל, בתאי גזע hematopoietic (HSCs), אינם להעריך בקלות. ניסיונות מרובים עבור ניתוח TEM ממדגמים נדירים תוך שימוש בגישות cytospin או בשכבה מצליחים לקבל נתונים כמותיים משמעותי ממספר מצומצם של תאים. לכן, הדרישה של מספר תאים גבוהים מגבילה את השימוש של כלי רב עצמה זה כדי להבין את פרטי ultrastructural subcellular של אוכלוסיות תאים נדירות.

מגבלת מפתח ללימודי TEM עם מספר מצומצם של תאs השעיה הוא הלוקליזציה של התאים לעיבוד ולכן, מחקרי TEM מתאי מוגבל עם מידות קטנות במיוחד להישאר מאתגר. מספר גישות חלופיות אומצו כדי להתמודד עם מגבלה זו: ארגון ה- BSA / bisacrylamide (BSA-BA) פילמור בתיווך של השעיה התא, צביעת תאים עם צבע כדי לגרום להם גלוי על תמיכה סרט דק כולל coverslips, ו TEM מנתח מן ההכנות cytospin 4-6. עם זאת, הצלחה מוגבלת מאוד הושגה, כמו מעט מאוד תאים נמצאו בסעיפים לאחר חתך אולטרה. האתגר המרכזי של לזיהוי תאים דלילים נמשך משום monolayer התא אינה נראית בעיקר ג'ל הקרושה עבור חתך. יתר על כן, הכנת cytospin של תאים עשויה לשנות הארגון הסלולר שלהם בשל הפצת תא ואת השבריריות של מבנה התא. לפיכך, חסרונות הגלומים אלה מתחייבים גישה חדשנית לבצע מחקרי TEM מן אוכלוסיות תאים נדירות עם יותרעֲקֵבִיוּת. כדי להתגבר על בעיה זו, שתארנו רומן ושיטת הכנת מדגם חלופי מחקרי TEM מן אוכלוסיות תאים נדירות 7.

כאן אנו מדווחים פרוטוקול הכנת מדגם יעיל לבצע TEM מ דגימות ביולוגיות נדירות עם תוצאות איכותיות וכמותיות עקביות. כתמי כחולי אוונס בוצעו לאחר הקיבוע למקם תא גלול זעיר מתאי מספר נמוך, כלומר, 10,000 מח עצם גזע hematopoietic ו ובתאים שאחרת נותרו בלתי נראה, לבין הגלולה הייתה מוטבעת לתוך agarose לפני תהליכי הטמעת התייבשות שרף. שיטה זו אשכולות התאים יחד ומאפשר ניתוח יעיל של ultrastructure וארגון subcellular של תאי גזע hematopoietic (מזוהה לין - SCA-1 + c-Kit + FLT3 - CD34 -; HSC), 0.2 נדיר - האוכלוסייה 0.5% התא במח העצם. פרו ניסיוני זהtocol יכול להיות שימושי כדי לבצע מחקרים אולטרה-מבניים להשיג תוצאות כמותיות על אוכלוסיות נדירות רבות אבל מאוד חשובות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הפרוצדורות אושרו על ידי ועדת בעלי החיים המוסדית קרן המחקר של סינסינטי הילדים. לצורך המחקר, בתאי גזע hematopoietic בודדו ממח העצם של עכברים מולדים C57Bl / 6 בגילים 2 - 4 חודשים. מיון תאים באמצעות FACS לאחר צביעה של BM עם מקבלי משטח שונים כולל Lineage, c-Kit, SCA-1, FLT3 ו- CD34 שימש לטיהור HSC מבוסס על Lin- SCA-1 + c-kit + FLT3 - CD34 - gating אסטרטגיה כמו פרוטוקול סטנדרטי תיאר לפני 8.

זהירות: כימיקלים רעילים מספר מאוד משמשים במהלך הליך זה. אלו הם רעילים משאיפת ומגע עור. יש ללבוש כפפות וביגוד מגן. לעבוד במנדף תוך כדי עבודה עם כימיקלים אלה.

1. תאים, קיבוע, מכתים טרום הטבעה

  1. מיין 10,000 בתאי גזע hematopoietic (באמצעות לין - SCA-1 + c-kit + FLT3 - CD34 - gating האסטרטגיה; LT-HSC אוכלוסייה) בצינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge המכיל 600 μl השונה של Iscove הבינוני של Dulbecco (IMDM) עם 10% בסרום שור עוברי באמצעות FACS.
  2. ספין למטה HSCs מיון XG ב 1000 במשך 10 דקות בתוך צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge באמצעות צנטריפוגות עם דליים התנופה-אאוט. הסר בינוני על ידי שאיפה עדינה ולהשאיר 200 בינוני μl של צינורות בכל שלב. בשלב זה, התא הגלול אינו נראה בצינור.
  3. תקן את התאים על ידי הוספת 0.2 מ"ל של תמיסת מקבע 2x בטמפרטורת החדר (RT) במשך שעה 1 1,9.
    1. הפוך את הפתרון מקבע טרי לפני השימוש. בשעה 1x, הפתרון מורכב glutaraldehyde paraformaldehyde 3% ו -2.5% במאגר M 0.1 cacodylate.
  4. צנטריפוגה התאים XG ב 1000 במשך 10 דקות ב 30 ° C באמצעות צנטריפוגות עם דליים-אאוט התנופה.
  5. שטפו תאים עם 600 μl של חיץ 0.1 M cacodylateבאמצעות צנטריפוגה ולהשאיר חיץ 200 μl בצינור לאחר צנטריפוגה.
  6. הכתם התאים קבוע על ידי הוספת 200 μl של 2 פתרון מ"ג / מ"ל ​​של כחול אוונס במאגר cacodylate דגירה במשך 20 דקות ב RT. התא יהיה בצבע כחול.
  7. לשטוף התאים 3 פעמים עם 600 μl של 0.1 מ 'צנטריפוגה באמצעות חיץ cacodylate ולהשאיר חיץ 200 μl בצינור בכל פעם.
  8. Re- להשעות את התאים 200 חיץ μl ולהעביר את ההשעיה לתא צינור 0.5 מ"ל. צנטריפוגה XG ב 1000 במשך 10 דקות באמצעות צנטריפוגות בראש הטבלה. הסר חוצץ בעדינות מבלי להפריע גלולה תא זעיר נראה כעת, ולהשאיר חיץ 50 μl בצינור.
  9. הוספת 200 מ"ג התכה נמוכה agarose עד 5 מ"ל של 0.1 M חיץ cacodylate בצינור 15 מ"ל פתרון agarose 4%. ממיסים את agarose על ידי העברת צינור למים רותחים בתוך בקבוק זכוכית 100 מ"ל ולשמור פושרים עד בשימוש.
  10. הוסף 200 μl של 4% התכה נמוכה מומס agarose ב 0.1 M cacodylate חיץ ההשעיה תא צינור 0.5 מ"ל ומיד צנטריפוגות XG ב 1000 במשך 10 דקות ב 30 ° C באמצעות צנטריפוגות בראש הטבלה.
  11. לאחר אישור תאים pelleted בתחתית הצינור 0.5 מ"ל לתוך agarose חצי מוצק לאחר צנטריפוגה, מיד להעביר את הצינור עד 4 מעלות צלזיוס או קרח למשך 20 דקות כדי לחזק את agarose. שלב זה הוא קריטי מאוד, כמו תא גלול גלוי קטן תוצאות שלב זה מקבץ טוב של תאים מתחת למיקרוסקופ האלקטרונים.
  12. להעביר בזהירות את agarose הקרושה המכיל את התא גלולה מהצינור על צלחת פלסטיק 35 מ"מ פטרי המכילה חיץ באמצעות 3,10 מחט 27 G.
  13. חתוך את agarose הקרושה המכיל את התא גלולה לתוך חתיכה אחת של כ 1 - 2 מ"מ עם אזמל. מעבירים את פיסת agarose המכיל גלולה לתא צינור 1.5 מ"ל חדש.
  14. לשטוף 2 - 3 פעמים באמצעות 600 μl של חיץ 0.1 M cacodylate ידי הוספה והסרה של חיץ באמצעות פיפטה ללא צנטריפוגה. השתמש חתיכת agarose זה המכיל את התא גלול עבור לשלב הבא. בשלב זה, המדגם יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה לפני המעבר לשלב הבא.

2. Osmification, התייבשות, והטבעה

  1. הסר את חוצץ cacodylate מהצינור 1.5 מ"ל עם תא גלולה המכילה באמצעות agarose טפטפת. להוסיף 1.0 מ"ל של 1% אוסמיום ארבע-חמצני (OSO 4) פתרון במנדף, דגירה במשך שעה 1 ב 4 ° C..
  2. לשטוף שלוש פעמים עם 600 μl של 0.1 מ 'cacodylate חיץ ולהעביר את המדגם כדי בקבוקון הנצנץ זכוכית 20 מ"ל עם מכסה.
  3. לעבד את המדגם עבור התייבשות, חדירה והטבעה לתוך שרף (למשל, LX-112) עם שינויים סידוריים של הפתרונים הבאים לפי צלחת גם 6. הזז את פיסת agarose תא גלול באמצעות מלקחיים.
    1. לטבול את המדגם באתנול 25% ב RT במשך 15 דקות.
    2. לטבול את המדגם באתנול 50% ב RT במשך 15 דקות.
    3. לטבול את המדגם ב 75% אתנול ב RT במשך 15 דקות.
    4. לטבול את המדגם באתנול 95% ב RT במשך 15 דקות.
    5. לטבול את המדגם באתנול 100% ב RT במשך 15 דקות, פעמיים.
    6. לטבול את המדגם באתנול: שרף (3: 1) ב RT במשך 30 דקות.
    7. לטבול את המדגם באתנול: שרף (1: 1) ב RT במשך 30 דקות.
    8. לטבול את המדגם באתנול: שרף (1: 3) ב RT במשך 30 דקות.
    9. לטבול את המדגם שרף טהור ב RT במשך 60 דקות, פעמיים.
  4. מעבירים את המדגם לתחתית תבנית גומי בצורת קצה הפירמידה באמצעות מלקחיים בזהירות ולהוסיף שרף טהור יותר על גבי המדגם למלא את התבנית. דגירת המדגם ב 60 מעלות צלזיוס במשך 72 שעות עבור פילמור שרף.
  5. סר הפירמידה שרפה polymerized מהתבניות על ידי סיבוב עובש הגומי. אשכול שחור קטן של תאים צריך להיות גלוי בפירמידת שרף polymerized, כפי שתואר קודם לכן 7. צרף הפירמידה שרף polymerized על גליל הרכבה באמצעות cyanoacrylate.

ילדה = "jove_title"> 3. חתך במיקרוסקופ אלקטרוני הילוכים

  1. חתוך את בלוק הפירמידה עם סכין גילוח וסכין יהלומים לאחר הרכבת הבלוק על-microtome אולטרה. ליצור צורה טרפזית רחבה קצרה עם החלק העליון והחלק התחתון של מקבילי בלוק זה לזה, ועם צדדים זוויתי באופן שווה. צורה זו של הפירמידה מסייעת עבור חתך סדרתי.
  2. יתר על כן, לקצץ את הבלוק סביב התא גלול עם סכין היהלום ולהסיר את חלקי הפלסטיק סביב יצירת agarose תא הגלולה.
  3. חותכים 1 מיקרומטר חלקים באמצעות-microtome אולטרה. הזז את 1 מיקרומטר חלקים מהסירה למים לשקופית זכוכית באמצעות כלי עפעף ו כלי לולאת מתכת כפי שדווח בעבר 7. העברת חלקים בשקופיות ומגלשות העברת הצלחת החמה (37 מעלות צלזיוס) במשך ייבוש.
  4. הוסף טיפה של תמיסת toluidine הכחולה בסעיפים באמצעות מזרק מצויד 0.22 מיקרומטר מסנן דגירה במשך 3 דקות. יש לשטוף את השקופיות במים מזוקקים let בסעיפים לייבוש. בדוק עם מיקרוסקופ אור כדי לזהות את המיקום של התאים.
  5. חותכים סעיפים דקים (70 - 100 ננומטר) באמצעות סכין יהלום. זז 2 - 3 חלקים על רשתות 200-רשת מהסירה למים בכלי זכוכית פטרי באמצעות כלי עפעף.
  6. מעביר את צלחת זכוכית פטרי המכילה רשתות עם קטעים על צלחת חמה ב 30 מעלות צלזיוס לייבוש חלקים למשך 30 דקות.
  7. כתם הרשתות עם טיפות של אצטט uranyl 1% ב RT במשך 10 דקות ולאחר מכן לשטוף במים מזוקקים 6 - 8 פעמים. הכתם עם ריינולדס להוביל ציטראט, ב RT במשך 5 דקות ולשטוף במים מזוקקים 6 - 8 פעמים. מעביר את צלחת זכוכית פטרי המכילה את הרשתות על צלחת חמה ב 37 מעלות צלזיוס לייבוש חלקות.
  8. לנתח את החלקים עם מיקרוסקופ אלקטרונים, ב 80 kV 7.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

פרוטוקול יעיל ועקבי להכנת מדגם לבצע ניתוח TEM ממספר נמוך של תאים מתואר. מכתים שלאחר קיבוע עם אוונס כחול העברת התאים צינור 0.5 מ"ל microcentrifuge עזר להמחיש את התא גלולה זעירה 7. Osmification עם אוסמיום ארבע-חמצני ב agarose הביא לגילוי קל של התא גלולה כהה במהלך התייבשות והטבעה.

חלקים חצי דקה מהבלוקים המכילים תא גלול זעיר אשרו מקבץ ש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

שיטה זו מאפשרת ניתוח TEM על מספרים סלולריים נמוכים, באמצעות אוונס מכתים כחול agarose ההטבעה למקם תא גלול זעיר במהלך ההתייבשות, הטבעת השרף ו חתך תהליכים. חשוב לציין, היא שומרת צבירי תאים יחד ושומרת על אולטרה-מבנה התא, אשר רצוי לבחון מספר תאי כימות של נתונים.

במחקרי TEM, תא גלולה המכילה מיליוני תאים נדרשה לעתים קרובות עבור embedment ביותר לתוך מטריצת agarose / ג'לטין לשטיפה, התייבשות וחדירה לקבל נתונים מתאיים ר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

החוקרים אין לי מה לחשוף.

תודות

אנו מודים לליבת המחקר הפתולוגית על הסיוע במחקרי ניתוח מיקרוסקופ אלקטרונים במרכז הרפואי לילדים בסינסינטי. העבודה נתמכה על ידי NIH (פרס גשר האגודה האמריקאית להמטולוגיה ל-MDF; R01 DK102890 ל-MDF).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Paraformaldehyde 20% Aqueous SolnElectron Microscopy Sciences15713CAUTION רעיל בשאיפה, מגע בעור. ללבוש כפפות, להשתמש במכסה המנוע.
גלוטרלדהיד 70%מיקרוסקופיה אלקטרונית16350<חזק>זהירות רעיל בשאיפה, מגע עם העור. ללבוש כפפות, להשתמש במכסה המנוע.
מאגר קקודידאט מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים12300הכינו 0.1 מ' מאגר קקודילדאט (pH 7.4) במים מזוקקים, אחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס <חזק>זהירות מגרה בשאיפה או במגע עם העור, ללבוש כפפות ולעבוד במכסה אדים.
אוונס בלו SigmaE-2129
אגרוז נמס נמוך Sigma AldrichA-5030
Osmium tetraoxideElectron Microscopy Sciences191301 גרם ב 50 מ"ל של 0.1 M cacodyladate buffer להכנת 2% OsO4 מלאי, <חזק>זהירות רעיל מאוד בשאיפה או במגע עם העור, מחמצן חזק, ללבוש ביגוד מגן, הגנה על העיניים, להשתמש במכסה אדים.
ערכות הטמעה LX-112 (LADD®)
DDSA (דודצ'נילסוקסיניק אנהידריד)LADD21340מערבבים 16% DDSA; 30% NMA; 54% LX-112 יחד ולאחר מכן מוסיפים 1.4% DMP-30
NMA (Nadic methyl anhydride)LADD21350
שרפי אפוקסי Epon 812 (LX-112)LADD21310<חזק>זהירות רעיל בשאיפה, במגע עם העור. ללבוש כפפות, ביגוד מגן, להשתמש במכסה אדים.
DMP-30 (2,4,6-Tri(dimethylaminomethyl)phenol)LADD21370
Reynolds עופרת ציטראט (EM Stain II)Leica<חזק>זהירות רעיל בשאיפה, יש להימנע ממגע עם העור או העיניים.
אורניל אצטט (EM Stain I)Leica8072820<חזק>זהירות רעיל בשאיפה, יש להימנע ממגע עם העור או העיניים.
המדיום של Dulbecco (IMDM)ATCC30-2005: NaCl, NaHCO3, HEPES, Glucose, Ca, Mg, sod pyruvate etc. לפרטים https://www.atcc.org/~/media/Attachments/E/9/7/E/4893.ashx
תבנית קצה פירמידה טד פלה10585
צילינדרים הרכבהטד פלה10580
אולטרה-מיקרוטום (Leica EM UC7)
200 רשתות רשת (nikil)מדעי מיקרוסקופ אלקטרוניםG-200 Ni
מיקרוסקופ אלקטרוניםהיטאצ'י דגם H-7650 
תוכנת מנוע לכידת תמונותAMT-600 
35 מ"מ פלסטיק פטרי צלחותפישר מדעי
מהיר בונד סופר דבק ציאנואקרילט מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים72588
סכיני
בקבוקוני נצנוץ מזכוכית פישר סיינטיפיק 03-337-14
שקופיות זכוכית 
כלי
הכלי לולאת מתכת 
מימית של סולן מדעי הרכב של Iscoveגילוחריסים

מקורות

  1. Bozzola, J. J. Conventional specimen preparation techniques for transmission electron microscopy of cultured cells. Methods Mol Biol. 369, 1-18 (2007).
  2. Leapman, R. D. Novel techniques in electron microscopy. Curr Opin Neurobiol. 14, 591-598 (2004).
  3. Anderson, D. R. A method of preparing peripheral leucocytes for electron microscopy. J Ulstract Res. 13, 263-268 (1965).
  4. Taupin, P. Processing scarce biological samples for light and transmission electron microscopy. Eur J Histochem. 52, 135-139 (2008).
  5. Mather, J., Stanbridge, C. M., Butler, E. B. Method for the removal of selected cells from cytological smear preparations for transmission electron microscopy. J Clin Pathol. 34, 1355-1357 (1981).
  6. Oorschot, V., de Wit, H., Annaert, W. G., Klumperman, J. A novel flat-embedding method to prepare ultrathin cryosections from cultured cells in their in situ orientation. J Histochem Cytochem. 50, 1067-1080 (2002).
  7. Kumar, S., Ciraolo, G., Hinge, A., Filippi, M. D. An efficient and reproducible process for transmission electron microscopy (TEM) of rare cell populations. J Immunol Methods. 404, 87-90 (2014).
  8. Chen, J., et al. Enrichment of hematopoietic stem cells with SLAM and LSK markers for the detection of hematopoietic stem cell function in normal and Trp53 null mice. Exp Hematol. 36, 1236-1243 (2008).
  9. Hopwood, D. The reactions between formaldehyde, glutaraldehyde and osmium tetroxide, and their fixation effects o bovine serum albumin and on tissue blocks. Histochemistry. 24, 50-64 (1970).
  10. Saini, R., et al. Nitric oxide synthase localization in the rat neutrophils: immunocytochemical, molecular, and biochemical studies. J Leukoc Biol. 79, 519-528 (2006).
  11. Kumar, S., et al. The small GTPase Rap1b negatively regulates neutrophil chemotaxis and transcellular diapedesis by inhibiting Akt activation. J Exp Med. 211, 1741-1758 (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Evans BlueUranyl AcetateLead Citrate

מאמרים קשורים