ברזולוציה גבוהה Respirometry להעריך תפקוד מיטוכונדריאלי permeabilized ו תאים שלמים

Summary

respirometry ברזולוציה גבוהה משמש לקביעת צריכת חמצן המיטוכונדריה. זוהי טכניקה פשוטה כדי לקבוע מתחמי שרשרת הנשימה במיטוכונדריה '(I-IV) מחירי נשימה, קיבולת מערכת תחבורת אלקטרון מקסימלי המיטוכונדריה, ויושרת הממברנה החיצונית של המיטוכונדריה.

Abstract

אוקסיגרף ברזולוציה גבוהה הוא מכשיר למדידת צריכת חמצן תאית במערכת תא סגור עם רזולוציה גבוהה מאוד ורגישות בדגימות ביולוגיות (תאים שלמים וחדירים, רקמות או מיטוכונדריה מבודדת). מכשיר האוקסיגרף ברזולוציה גבוהה מצויד בשני תאים ומשתמש בחיישני חמצן פולארוגרפיים כדי למדוד את ריכוז החמצן ולחשב את צריכת החמצן בכל תא. שיעורי צריכת החמצן מחושבים באמצעות תוכנה ומבוטאים כפיקומולים לשנייה למספר תאים. כל תא אוקסיגרף ברזולוציה גבוהה מכיל פקק עם יציאות הזרקה, מה שהופך אותו לאידיאלי עבור טיטרציות מנתק-מצמד-מעכב מצע או פרוטוקולי טיטרציה של חומרי ניקוי לקביעת ריכוזים יעילים ואופטימליים לחדירות קרום הפלזמה. ניתן ליישם את הטכניקה למדידת נשימה במגוון רחב של סוגי תאים וגם מספקת מידע על איכות ושלמות המיטוכונדריה, וקיבולת מקסימלית של מערכת הובלת אלקטרונים נשימתית מיטוכונדריאלית.

Introduction

המיטוכונדריה למלא תפקידים חשובים במטבוליזם האנרגיה בתאים, במיוחד באמצעות חמצן כדי לייצר אדנוזין אדנוזין (ATP). הם מעורבים מוות של תאים בכמה מחלות אנושיות. זרחון חמצוני מיטוכונדריאלי (OXPHOS) משלב הובלת האלקטרונים לאורך שרשרת העברת אלקטרונים עם צריכת חמצן סינתזת ATP. החומצה tricarboxylic המיטוכונדריה (TCA) מחזור מעורב ההמרה של חלבונים, פחמימות ושומנים לתרכובות עתירות אנרגיה כמו dinucleotide אדנין nicotinamide (NADH) ו dinucleotide אדנין פלבין (FADH _2). אלקטרונים של NADH ו FADH ₂ ואז מועברים קומפלקסי חלבוני שרשרת העברת אלקטרוני הנשימה (I עד IV) ממוקם קרום המיטוכונדריה הפנימי. בנוסף, שני מסלולי חיזור אחרים יכולים להעביר אלקטרוני אלקטרונים שרשרת תחבורה: i) המיטוכונדריה אלקטרון-העברת flavoprotein (ETF) הנמצא על פני המטריצה ​​של מיטו הפנימיאלקטרוני קרום chondrial, ואספקת β-חמצון חומצות שומן; ו ii) dehydrogenase glycerophosphate המיטוכונדריה אשר מתחמצנים glycerophosphate כדי דהידרוקסיאצטון פוספט ומזינה אלקטרונים לשרשרת הובלת האלקטרונים המיטוכונדריה. IV המורכב (את מקבל אלקטרונים האולטימטיבי) מעביר את אלקטרוני מולקולת חמצן אחד, המרת חמצן שתי מולקולות של מים. העברת האלקטרונים מתסביך שרשרת העברת אלקטרוני נשימת I עד IV מצמידה עם תזרים פרוטון מן מטריקס המיטוכונדריה למרחב intermembrane הקובע שיפוע אלקטרוכימי על פני הקרום הפנימי של המיטוכונדריה. לאחר מכן, V מורכב המיטוכונדריה (synthase ATP) בהסעות יוני מימן בחזרה לתוך מטריקס המיטוכונדריה ו מסנתז מולקולות ATP. פונקצית OXPHOS ניתן להעריכם vivo ו במבחנה תוך שימוש בטכניקות שונות ומצבי נשימה המיטוכונדריאלי שונים ניתן לקבל. במיטוכונדריה בודדה את respirato הבאניתן למדוד מדינות ר"י: i) נשימה המיטוכונדריאלי הבזליים (מדינת 1), ii) צריכת חמצן לאחר התוספת של מצעים ספציפיים של מתחמי שרשרת הנשימה במיטוכונדריה (מצב 2), iii) צריכת חמצן מרבית המיטוכונדריה לאחר התוספת של להרוות ריכוזי diphosphate אדנוזין (ADP) (מצב 3) ו, ד) נשימה במנוחה לאחר צריכת ADP (המרה ל ATP) (מצב 4). בשנת תאי שלמי מדינות הנשימה הבאה ניתן למדוד: i) צריכת חמצן הסלולר הבזליים בנוכחות מצעי אנדוגני ADP, ii) צריכת חמצן הסלולר הבזליים בנוכחות oligomycin (oligomycin רישיות נשימה) ו oligomycin רגיש נשימה (ATP ממחזור), iii) FCCP נשימה זוגית, ו- IV) נשימה הלא המיטוכונדריה לאחר התוספת של antimycin ו rotenone. בתאי permeabilized, מצעים ספציפיים של מתחמי שרשרת העברת אלקטרונים ו ADP ניתן להוסיף s שיעורי נשימה המקסימאלי תלויה מורכבuch אני- מורכב כמו, II- ושיעורי הנשימה IV תלויי ניתן למדוד.

מדידות של הנשימה התאית לספק תובנות חשובות קיבולת הנשימה במיטוכונדריה ספציפי מתחמי I-IV, יושרה המיטוכונדריה ואת חילוף החומרים האנרגיה ^{1, 2, 3.} אחד המכשירים המאפשרים מדידות של צריכת חמצן המיטוכונדריה עם רגישות דיוק, ברזולוציה גבוהה הוא oxygraph ⁴ ברזולוציה הגבוהה. מכשיר oxygraph ברזולוציה גבוהה מכיל שני תאים עם יציאות הזרקה וכל תא מצויד חיישן חמצן polarographic. השעיות המיטוכונדריה ניידות או מבודדות הם עוררו ברציפות respirometer. כדי להעריך המיטוכונדריה פונקציה, מצעים ומעכבים עבור פעילות מורכבת המיטוכונדריה ניתן להוסיף באי פרוטוקולים סטנדרטיים. מצעים ומעכבים ניתן טיטרציה ידי int הזרקהo לתאי של oxygraph, ושיעורי צריכת החמצן מחושבים באמצעות תוכנה כפי שבא לידי ביטוי picomoles לשנייה לכל מספר התאים. respirometry ברזולוציה גבוהה מציע מספר יתרונות על פני התקני אלקטרודה חמצן polarographic מסורתיים קונבנציונליים כולל רגישות מוגברת ואת היכולת לעבוד עם מספר קטן של דגימות ביולוגיות כגון תאים שלמים או permeabilized. בנוסף, כל התקן מכיל שני תאים, ושיעורי נשימה ניתן להקליט בו זמנית להשוואות של ריכוזי חמצן. Oxygraph ברזולוציה גבוהה גם יש את היתרון של דליפה המופחתת של חמצן מתאי המכשיר לעומת מכשירי אלקטרודה חמצן polarographic מסורתיים. מכשיר נוסף שפותח לאחרונה למדוד צריכת חמצן הסלולר הוא מנתח השטף התאי 96-גם ^5. מנתח השטף התאי מצויד קרינה במקום חיישני polarographic. היתרונות של תאימנתח שטף לעומת oxygraph ברזולוציה הגבוהה הם i) הוא מכשיר אוטומטי במידה רבה, ii) ניתן למדוד צריכת חמצן 24- ו 96-גם צלחות להקרנת תפוקה גבוהה, ולכן דורש כמויות נמוכות של דגימות ביולוגיות, ו- III) מדידה נוספת של שטף הסלולר glycolytic אפשרית. החסרונות של הנתח השטף תאיים בהשוואה oxygraph ברזולוציה גבוהה הם i) העלויות הגבוהות של המכשיר ושל מתכלים כגון צלחות פלורסנט, רציפות שאינן לשימוש חוזר, ו-ב '), רק ארבע תרכובות לכל assay / גם הם להזרקה לכן, המערכת אינה ישימה עבור פרוטוקולי טיטרציה מצע-uncoupler-מעכב.

במחקר הנוכחי, אנו משתמשים respirometry ברזולוציה גבוהה כדי לקבוע נשימה המיטוכונדריאלי. בניסויים צריכת החמצן הסלולר, התאים permeabilized כדי לאפשר כניסת ADP אקסוגניים מצעים המיטוכונדריה oxidizable האכלה אלקטרונים לתוך Complexeים של מערכת הנשימה. גישה זו מאפשרת לנתיחה קיבולות הנשימה מתחמי המיטוכונדריה הפרט, המהווה יתרון בולט לעומת תאים שלמים (מצעים רבים הם תאים impermeant). עם זאת, קרום התא permeabilization ישבש את המחסום בין cytosol והמרחב תאי והבינוני (לשטוף החוצה של מומסי cytosolic) והרכב של המרחב התאי הוא equilibrated עם המדיום התאי. אחד החסרונות של תאי permeabilized על תאים שלמים הוא כי הממברנה החיצונית של המיטוכונדריה יכולה להינזק אם כמויות עודפות של חומר ניקוי מועסקות במהלך permeabilization תא. בשנת תאים שלמים, הבזליים, מצמיד ונשימה זוגית של תאי שלמים ניתן למדוד. שיטה זו מעריכה צריכת חמצן של תאים שלמים בלי התוספת של מצעים אקסוגניים ADP, לשחזר את תפקודי הנשימה בתא המשולב גם מתן מידע על transpo אלקטרון המקסימאלי המיטוכונדריהקיבולת ^{6 rt, 7.} אחד היתרונות של תאים שלמים מעל תא permeabilized הוא כי הסביבה הסלולר אינה מופרת המיטוכונדריה נמצאת בקשר עם הרכיבים השלמים של התאים. כדי permeabilize הממברנה התאית, דטרגנטים כגון digitonin שימשו ^8. עם זאת, שלמות הממברנה החיצונית של המיטוכונדריה יכולה להיפגע אם כמויות עודפות של digitonin מועסקות. כדי לאשר שלמות הממברנה החיצונית של המיטוכונדריה לא נפגעת בתאי permeabilized, טיטרציה digitonin מתבצעת על מנת לקבוע את הריכוז האופטימלי עבור permeabilization הסלולר. בניסויים אלה, תאי resuspended במדיום נשימה וריכוז digitonin הוא טיטרציה ידי respirometry בנוכחות מצעים המיטוכונדריה ADP, ושיעורי נשימה נמדדים. נשימה של שלם, שאינו permeabilized תאים אינו מגורה בנוכחות mitochoמצעי ADP ndrial. עם זאת, טיטרציה digitonin בשלבים הבאה תניב permeabilization ההדרגתית של ממברנות פלזמה, וריכוז digitonin אופטימלי מתקבל. זו מוצגת על ידי הגידול של נשימה עד permeabilization מלא. איכות מיטוכונדריאלי ויושרת קרום חיצונית יכולים להיות מאומתת על ידי הוספת ג ² ציטוכרום ^{אקסוגניים, 9.} ציטוכרום C הוא חלבון נושאת אלקטרון 12 kDa של שרשרת העברת אלקטרונים המיטוכונדריה ^{10, 11, 12.} זה הוא מקומי במרחב intermembrane המיטוכונדריה, והוא מעורב צריכת חמצן, נושאת אלקטרונים מורכב III ל- IV המורכב. לאחר הממברנה החיצונית של המיטוכונדריה פגומה, ציטוכרום C הוא שוחרר, וצריכת חמצן המיטוכונדריה מצטמצמת. עם התוספת של ציטוכרום C אקסוגניים, הגדלה שום נשימה המיטוכונדריאלי היא מעידה עלשיבשו הממברנה החיצונית של המיטוכונדריה.

בתאי permeabilized, מצעים ומעכבים של פעילות מורכבת המיטוכונדריה מתווספים הבאים פרוטוקולים שונים ^{3, 9.} לדוגמה כדי לחקור שיעורי נשימה מונחה מורכב המיטוכונדריה, הפרוטוקול הבא יכול לשמש. לאחר permeabilization של תאים, אני המתחם הראשון הוא מגורה על ידי malate מצעים ו גלוטמט, אשר יוצרים NADH כמו מצע לשרשרת הנשימה לעורר את ההפעלה של I. מורכבים לאחר מכן, ADP מתווסף לגיור ל- ATP (המדינה 3, פעיל אני תלוי מורכב נשימה). לאחר אות יציבה הוא הגיע, rotenone (מורכב המיטוכונדריה שאני מעכב) מנוהל לעכב I. מורכב Rotenone ואחריו succinate כדי FADH ₂ וכדי להפעיל מורכבים שניים (מדינת 3, השני תלויה נשימה מורכבת פעילה). על מנת למדוד מורכבות נשימת IV תלוי, המתחם ראשון IIIנשימה תלויה מעוכבת על ידי הוספת antimycin (מעכב המורכב III המיטוכונדריה). לאחר מכן, נשימת IV התלוי מורכבת היא מגורה על ידי מתן ascorbate ו tetramethylphenylendiamine (TMPD). TMPD יכול אוטומטי לחמצן למאגר הנשימה, ולכן קצב נשימת IV התלוי המורכב המקסימאלי (המדינה 3) מחושב על ידי הפחתת שיעורי נשימה לפני ואחרי התוספת של אזיד הנתרן, מעכב IV המורכב המיטוכונדריה. ניסויי הנשימה יכולים להתבצע בשני תאים של oxygraph במקביל-מנה אחת כביקורת (תאי unstimulated), את מכיל אחרים התאים המגורים. ברור, התאים ניתן מראש לטפל בדרכים שונות, למשל, עם תרופות המשפיעות פונקציות המיטוכונדריה, לפני צריכת החמצן שלהם נמדדה בתא oxygraph. פרוטוקול זה מאפשר בדיקה תפקודית של מתחמי שרשרת הנשימה במיטוכונדריה הפרט. בנוסף, אפשר למדוד ADP מגורה מקסימלינשימה (מדינה 3) של תאי permeabilized, באמצעות חומצת שומן אקסוגניים בצורת palmitate. בפרוטוקול זה, מניות מרוכזות של palmitate נתרן מצומדות עם אלבומין בסרום שור חינם חומצת שומן אולטרה (BSA) (6: palmitate יחס 1 הטוחן: BSA). לאחר מכן, התאים הראשונים הם permeabilized עם הנשימה digitonin ואת המיטוכונדריה נבחנת על ידי תוספת של קרניטין palmitate ואחריו תוספת של ADP (מצב 3, הנשימה מקסימלי). לאחר מכן, מתווסף oligomycin לחקות מדינה 4 (4O מדינה) ויחס מלא נשימה (ערך RCR) מחושב מדינה 3 / מדינה 4O. β-חמצון מקדם ייצור של אצטיל COA (אשר נכנס במחזור TCA) ויצירת FADH ₂ ו NADH, האלקטרונים הם צולח לשרשרת הובלת אלקטרונים על ידי flavoprotein העביר-אלקטרוני dehydrogenase β-hydroxyacyl-CoA reductase. המיטוכונדריה הם במרכז מטבוליזם חומצות שומן ותיאר פרוטוקול palmitate-BSA יכול לשמש את החוקרים לבחון שומןחמצון חומצה ty. בשנת תאים שלמים, activators ומעכבים של פעילות מורכבת המיטוכונדריה מתווספים הבא בפרוטוקול אחר ^{6, 9.} בניסויים אלה, צריכת החמצן הראשונה של תאים שאינם permeabilized בהעדר מצעים אקסוגניים נמדדת (phosphorylating קצב הנשימה). לאחר מכן, קצב הנשימה הלא phosphorylating נמדד לאחר תוספת של oligomycin, שהוא מעכב של ה- ATP synthase המיטוכונדריה. לאחר מכן, ציאניד קרבוניל protonophore p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) מנוהל בריכוזים שונים ואת קצב הנשימה הזוגי המקסימאלי המיטוכונדריה נמדד. Protonophores כגון FCCP יכול להשרות הגדלה בחדירות פרוטון של הקרום הפנימי, המאפשר תנועה פסיבית של פרוטונים כדי להפיג את שיפוע chemiosmotic. גידול חדיר פרוטון uncouples נשימת חמצונים (לא מבוצע ייצור ATP) ומשרת גידול oצריכת xygen. לאחר מכן, rotenone ו- A antimycin מתווספים לעכב נשימה המיטוכונדריאלי, והנשימה הלא המיטוכונדריה מופחתת מכל שיעורי הנשימה האחרים.

שיעורי צריכת החמצן יכולים לבוא לידי ביטוי ₂ IO [pmol x שניות ^-1 x 10 ^-6 תאים] (זרימת חמצן למיליון תאים) המחושבות על ידי חלוקת שטף חמצן ספציפי נפח (בתא החמצן הסגור), JV, O ₂ [sec x pmol ^-1 x מ"ל ^-1] על ידי ריכוז תא לתא הסלולרי (מספר התאים לכל נפח [10 ⁶ תאים ∙ מ"ל ^{1]) 15.} Cell-מסת שטף חמצן ספציפי, ₂ JO [sec x pmol ^-1 x מ"ג ^-1], היא זרימה לכל תא, IO ₂ [sec x pmol ^-1 x 10 ^-6 תאים], מחולק המוני לכל תא [מ"ג ∙ 10 ⁶ תאים]; או נפח ספציפי השטף, JV, O ₂ [sec x pmol ^-1 x מ"ל ^-1], מחולק המוני לכל כרךume [מ"ג ∙ מ"ל ^1]. JO ₂ הוא שטף החמצן לכל חלבון תא, משקל יבש או נפח תא.

במחקר הנוכחי באמצעות respirometry ברזולוציה גבוהה, אנו מתארים פרוטוקולים לקבוע i) digitonin הריכוז האופטימלי עבור permeabilization קרום הפלזמה הסלולר שלם (assay טיטרציה digitonin), ii) שלמות הממברנה החיצונית של המיטוכונדריה באמצעות ציטוכרום C אקסוגניים, iii) מתחמי שרשרת הנשימה במיטוכונדריה לי , שיעורי נשימה מקסימאליים II ו- IV בתאי HepG2-permeabilized digitonin בנוכחות ADP אקסוגניים מצעי שרשרת נשימה במיטוכונדריה, ו- IV) הבזליים, מצמיד ונשימה מקסימלי זוגית (קיבולת העברת אלקטרונים מקסימלי) של תאים שלמים בלי התוספת של מצעים אקסוגניים ו ADP, לשחזר את תפקודי נשימה בתא המשולב.

Protocol

1. תרבית תאים

1. תאי HepG2 תרבות hepatoma אדם ⁶ ב 25 סנטימטר ² צלוחיות תרבית תאים במדיום של הנשר השונה של Dulbecco (DMEM) המכיל סרום שור עובר חום מומת 10% (FBS) ו -1%, סטרפטומיצין פניצילין ב 37 מעלות צלזיוס CO חממה (5% _2, 95% אוויר) (צפיפות זריעה: 1 x 10 ⁶ תאים לכל 25 ס"מ ² תאים בקבוק תרבות, זמן הדגירה בחממה 37 ° C: 48 שעות, צפיפות התאים ב confluency: 4-5 x 10 ⁶ תאים לכל 25 ס"מ ² תא בקבוק תרבות).
2. בצע את הניסויים כאשר תאים הם 90% עד 95% ומחוברות.

2. ברזולוציה גבוהה כיול Respirometry חיישני חמצן Polarographic

1. פיפטה 2.1 מ"ל של חיץ הנשימה לתוך תא oxygraph ומערבבים למאגר ברציפות באמצעות בר בחישה מגנטית הנוכחי בתא (700 סל"ד) בשעה 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 עד אות השטף חמצן יציבה שלחיישן חמצן polarographic מתקבל.
   הערה: אלקטרודות חמצן Polarographic בתוך כל ריכוז חמצן מידת oxygraph קאמרי לחשב צריכת חמצן (שטף) בתוך כל תא. ריכוז החמצן ושיעורי צריכת חמצן (שטף) מוצגים בזמן אמת באינטרנט במחשב באמצעות תוכנה עבור רכישת נתונים וניתוח.
2. בצע כיול אוויר של חיישן חמצן polarographic פי הפרוטוקולים של יצרן ^14.
   הערה: כיול של חיישני חמצן polarographic בתקשורת נשימה וריכוז חמצן בתקשורת בטמפרטורת ניסיוני הרוויה אוויר מבוצע רק פעם ביום בבוקר. לאחר מכן בתקשורת ניתן להסיר מתאי התאים resuspended בתוך תקשורת נשימה טריה מתווספים תא oxygraph ושיעורי נשימה נמדדים. אחרי הניסוי הראשון, התא ניתן לכבס סדרות נוספות של ניסויים ניתן לבצע tהוא באותו חדר ללא כיולים נוספים.

3. trypsinization של תאים חסידים, תאי ספירה

1. ביום הניסוי, לשאוב DMEM מהבקבוק התרבות ² תא 25 ס"מ.
2. שוטפים את monolayer תרבית תאים בבקבוק תרבות עם 5 מ"ל של בופר פוספט (PBS).
3. פיפטה 0.5 מ"ל של 25 מ"ג / מ"ל של תמיסת טריפסין (prewarmed עד 37 ° צלזיוס באמבט מים 37 ° C) לתוך monolayer תא בבקבוק תרבות דגירה במשך 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור (5% CO ₂ אוויר, 95%).
4. פיפטה 5 מ"ל של DMEM המכיל 10% FBS לתוך התאים מנותקים בבקבוק תרבית תאים להשעות את התאים על ידי pipetting.
5. העברת resuspended התאים לצינור צנטריפוגות 15 מ"ל ו צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 350 XG בטמפרטורת החדר למזוג supernatant.
6. Resuspend התא גלולה ב 1 מ"ל של הנשימה חיץ ¹³ (T מסוגל 1).
i> ספירת התאים באמצעות דלפק תא resuspend אותם למאגר הנשימה לצפיפות סופית של 1 x 10 ⁶ תאים / מ"ל. מאחר ששיעורי נשימה תאיים יהיו מנורמלים למספר תאים, לספור את התאים עם דלפק תא דירה ומדויק.

4. ברזולוציה גבוהה Respirometry

1. לאחר כיול אוויר (מבוצע רק פעם ביום, על שלבים 2.1-2.2), לשאוב את המדיום הנשימה מאחד מחדרי של oxygraph ולהוסיף 2.1 מ"ל של תרחיף תאים (1 x 10 ⁶ תאים / מ"ל) משלב 3.7 לתא.
2. סגור את תא oxygraph ידי החדרת את הפקק.
3. מערבב את התאים באופן רציף באמצעות בר בחישה מגנטי נוכחי בתא (700 סל"ד) בשעה 37 ° C ולהקליט נשימה תאית עבור דק '5-10 עד אות שטף חמצן יציבה מושגת.
   הערה: ריכוז החמצן ואת אות שטף חמצן מוצג בזמן אמת באינטרנט במחשב באמצעות תוכנה עבור רכישת נתונים וניתוחs = "Xref"> 14.
4. לאחר מכן, להזריק מצעים ומעכבים לנשימת המיטוכונדריה דרך יציאות הזרקה טיטניום של הפקקים באמצעות הפרוטוקולים הבאים.

5. טיטרציה digitonin ב תאים שלמים ידי Respirometry

1. הכין תא oxygraph השעית תא המכיל (1 x 10 ⁶ / ml) הנוהל המתואר בצעדים 4.1 עד 4.3 של הפרוטוקול.
2. להזריק 2 μl של rotenone 0.2 מ"מ (0.2 מיקרומטר) 'זהירות' החדרת oxygraph המכילה השעית תא דרך נמל הזרקת טיטניום של הפקק הקאמרי באמצעות מזרק ולהקליט נשימה תאית למשך 5-10 דקות עד אות שטף חמצן יציבה מושגת .
   הערה: כל הזריקות בשלבים הבאים מבוצעות דרך יציאות הזרקה טיטניום של פקקים באמצעות מזרקים. תוספת של rotenone היא אופציונלית (הוא מונע זרימת אלקטרונים הפוכה) וניתן להשמיט לניסויי טיטרציה digitonin, ראהצעד 6.3.
3. להזריק 20 μl של 1 succinate M (10 מ"מ) לתוך תא oxygraph ולהקליט הנשימה התאית למשך 5-10 דקות עד אות השטף חמצן יציב מושגת.
4. להזריק 10 μl של 0.5 M ADP (2.5 מ"מ) לתוך תא oxygraph ולהקליט נשימה תאית עבור דק '5-10 עד אות שטף חמצן יציבה מושגת.
5. להזריק 2 μl של 2 מ"מ digitonin (2 מיקרומטר) לתוך תא oxygraph ולהקליט הנשימה התאית עבור דק '2-5 עד אות חמצן יציב מושגת.
6. שוב להזריק 2 μl של 2 מ"מ digitonin החדרת oxygraph ולהקליט נשימה תאית במשך 2-5 דקות עד אות חמצן יציבה מושגת.
   הערה: צעדיים תוספת של digitonin לתאי תניע לעלייה בצריכת חמצן הסלולר אות שטף החמצן תגדל.
7. המשך הזרקת 2-4 μl של 2 מ"מ בשלבי digitonin (2-4 מיקרומטר כל שלב) לתוך התא. לאחר כל שלב, להקליט נשימה תאית במשך 2-5 מ 'ב עד אות שטף חמצן יציבה מושגת.
   הערה: להפסיק הזרקת digitonin כאשר אות שטף החמצן מגיע לרמת מירבית זריקות נוספות של digitonin לא להגדיל את קצב הנשימה. הקוראים צריכים לקבוע ריכוז digitonin אופטימלי במעבדות שלהם באמצעות ריאגנטים וריכוז digitonin האופטימלי המתקבל שימוש שלהם בשלבי 6.2 ו -7.2 של הפרוטוקולים הבאים עבור הניסויים שלהם.

6. הערכת Integrity הממברנה החיצונית מיטוכונדריאלי: ציטוכרום C

1. הכין תא oxygraph השעית תא המכיל (1 x 10 ⁶ / ml) הנוהל המתואר בצעדים 4.1 עד 4.3 של הפרוטוקול.
2. להזריק 2 μl של 8 מ"מ digitonin (8 מיקרומטר) לתוך תא oxygraph המכיל את ההשעיה תא (1 x 10 ⁶ / ml) ו permeabilize התאים למשך 5 דקות.
3. להזריק 20 μl של 1 succinate M (10 מ"מ) לתוך תא oxygraph ולהקליט respirat הסלולריון למשך 5-10 דקות עד אות שטף חמצן יציבה מושגת.
4. להזריק 10 μl של 0.5 M ADP (2.5 מ"מ) לתוך תא oxygraph ולהקליט נשימה תאית עבור דק '5-10 עד אות שטף חמצן יציבה מושגת.
   הערה: תוספת של ADP לתאי תעודד שאני מורכב לגרום לעלייה בצריכת חמצן, ואת אות שטף החמצן תגדל ולייצב.
5. להזריק 5 μl של ציטוכרום C 4 מ"מ (10 מיקרומטר) לתוך תא oxygraph ולהקליט נשימה תאית למשך 5-10 דקות עד אות שטף חמצן יציבה מושגת.
6. לבסוף להזריק 1 μl של 4 מ"ג / מיליליטר oligomycin (2 מיקרוגרם / מיליליטר) ולהקליט נשימה תאית עד אות שטף חמצן יציבה מושגת.

7. נשימה מגורה ADP מקסימאלי (המדינה 3) של תאים permeabilized HepG2

1. הכין תא oxygraph השעית תא המכיל (1 x 10 ⁶ / ml) הנוהל המתואר בצעדים 4.1 עד 4.3 של הפרוטוקול.
2. להזריק 2 μl של 8 מ"מ digitonin (8 מיקרומטר) לתוך תא oxygraph המכיל את ההשעיה תא permeabilize התאים למשך 5 דקות.
3. להזריק 12.5 μl של 0.8 M של malate (5 מ"מ) ו -10 μl של 2 M של גלוטמט (10 מ"מ) לתוך תא oxygraph. נשימה תאית שיא עד אות שטף חמצן יציבה מושגת.
4. להזריק 10 μl של 0.5 M ADP (2.5 מ"מ) לתוך תא oxygraph ולהקליט נשימה תאית עד מגביר אות שטף החמצן ומייצב.
   הערה: תוספת של ADP לתאי תניע לעלייה בצריכת חמצן ואת אות שטף החמצן תגדל.
5. להזריק 2 μl של rotenone 0.2 מ"מ (0.2 מיקרומטר) 'זהירות' החדרת oxygraph ולהקליט נשימה תאית עד ירידות אות שטף חמצן ומייצבת.
6. לאחר מכן, להזריק 20 μl של 1 succinate M (10 מ"מ) לתוך תא oxygraph ולהקליט הנשימה התאית עד מגביר אות השטף חמצןומייצב.
7. לאחר מכן, להזריק 2 μl של 5 מ"מ antimycin A (5 מיקרומטר) 'זהירות' החדרת oxygraph ולהקליט נשימה תאית עד ירידות אות שטף חמצן ומייצבת.
8. ואז להזריק 2.5 μl של ascorbate 0.8 מ"מ (1 מ"מ) ומיד לאחר להזריק 2.5 μl של 0.2 מ"מ TMPD (0.25 מ"מ) לתוך תא oxygraph ולהקליט הנשימה התאית עד מגביר אות השטף חמצן ומייצב.
9. לבסוף להזריק 10 μl של 1 M יזיד הנתרן (5 מ"מ) 'זהירות' החדרת oxygraph ולהקליט נשימה תאית עד ירידות אות שטף חמצן ומייצבת.

צריכת חמצן 8. של תאים שלמים

1. הכין תא oxygraph השעית תא המכיל (1 x 10 ⁶ / ml) הנוהל המתואר בצעדים 4.1 עד 4.3 של הפרוטוקול.
2. להזריק 1 μl של 4 מ"ג / מ"ל ​​oligomycin (2 מיקרוגרם / מ"ל) לתוך תא oxygraph השעייה התא המכילנשימה תאית שיא ד עד אות חמצן שטף יציבה מושגת.
3. לאחר מכן להזריק 1 μl של 0.2 מ"מ של FCCP (0.1 מיקרומטר) 'זהירות' החדרת oxygraph ולהקליט נשימה תאית עד מגביר אות שטף החמצן ומייצב.
4. להזריק 3 μl של 0.2 מ"מ של FCCP (0.4 מיקרומטר) לתוך תא oxygraph ולהקליט נשימה תאית עד מגביר אות שטף חמצן נוסף ומייצב.
5. לכייל FCCP 0.1 כדי 0.3 מיקרומטר צעדים על ידי הזרקת 1-3 μl של 0.2 1 המ"מ FCCP (0.1 כדי 2 מיקרומטר ריכוז סופי בתא) לתוך תא oxygraph עד אות שטף החמצן מגיעה לרמות מקסימליים ולא עליות נוספות ולאחר מכן מתחיל בירידה.
   הערה: להפסיק הזרקת FCCP כאשר אות החמצן מגיעה לרמה מקסימלי ומתחילה בירידה.
6. לאחר מכן, להזריק 2 μl של 0.2 rotenone מ"מ (0.2 מיקרומטר) ו -2 μl של 5 מ"מ antimycin A (5 מיקרומטר) לתוך תא. נשימת שיא עד tהוא ירידות אות שטף החמצן ומייצב.

Results

קביעת הריכוז האופטימלי digitonin לסלולאריות Permeabilization: ניסוי טיטרציה digitonin

טיטרציה digitonin מתבצעת על מנת לקבוע את הריכוז האופטימלי עבור permeabilization של תאי HepG2. בניסויים אלה, digitonin הוא טיטרציה בתאים שלמים בנוכחות rotenone, succinate (המיטוכונדריה מורכבים השנייה המצע) וכמות להרוות של ADP (להשרות מורכבים השנייה תלויי מצב 3), ומערכ...

Discussion

מטרת הפרוטוקול הנוכחי הייתה להשתמש respirometry ברזולוציה גבוהה כדי למדוד מתחמי שרשרת הנשימה במיטוכונדריה '(I-IV) מחירי נשימה, קיבולת מערכת תחבורת אלקטרון מקסימלי המיטוכונדריה שלמות הממברנה החיצונית של המיטוכונדריה.

ישנם כמה צעדים קריטיים בתוך הפרוטוקול הנוכחי. ראשית, שיעורי צריכת חמצן הסלולר בדרך כלל הם מנורמלים למספר התאים (pmol / [מספר x שניות של תאים]). לכן, לפני צריכת חמצן הסלולר הניטור, זה קריטי להשתמש ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ADP	Sigma	A 4386
אנטימיצין כימי A	Sigma	A 8674	כימיקל, מתמוסס באתנול
Ascorbate	Merck	1.00127	כימי
BSA	Sigma	A 6003	כימי
FCCP	Sigma	C 2920	כימי, מתמוסס באתנול
Countess אוטומטי מונה תאים	Thermo Fisher Scientific	n/a	מכשיר אוטומטי לספירת תאים
Cytochrome c	Sigma	C 7752	Chemical
Digitonin	Sigma	D 5628	Chemical, מתמוסס ב-DMSO
DMEM	Gibco	31966021	Medium
EGTA	fluka	3779	Chemical
FBS	Gibco	26010-074	רכיב בינוני
גלוטמט	סיגמא	G 1626	כימי
	Hepes Sigma	H 7523	כימי
KCl	Merck	1.04936	כימי
KH2PO4	Merck	1.04873	כימי
K-לקטוביונאט	סיגמא	L 2398	כימי
MgCl2	Sigma	M 9272	ליבת
O2k כימית: Oxygraph-2k	Oroboros Instruments	10000-02	מכשיר רספירומטריה ברזולוציה גבוהה
אוליגומיצין	סיגמא	O 4876	כימי, מתמוסס באתנול
פניצילין-סטרפטומיצין	Gibco	15140122	כימי
נתרן אזיד	Sigma	S2002	כימי
רוטנון	סיגמא	R 8875	כימי, מתמוסס באתנול
סוקסינט	סיגמא	S 2378	כימי
טאורין	סיגמא	T 8691	כימי
TMPD	סיגמא	T 3134	כימי
טריפסין	סיגמא	T 4674	כימי