respirometry ברזולוציה גבוהה משמש לקביעת צריכת חמצן המיטוכונדריה. זוהי טכניקה פשוטה כדי לקבוע מתחמי שרשרת הנשימה במיטוכונדריה '(I-IV) מחירי נשימה, קיבולת מערכת תחבורת אלקטרון מקסימלי המיטוכונדריה, ויושרת הממברנה החיצונית של המיטוכונדריה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
ברזולוציה גבוהה Respirometry להעריך תפקוד מיטוכונדריאלי permeabilized ו תאים שלמים
במאמר זה
סיכום
תקציר
אוקסיגרף ברזולוציה גבוהה הוא מכשיר למדידת צריכת חמצן תאית במערכת תא סגור עם רזולוציה גבוהה מאוד ורגישות בדגימות ביולוגיות (תאים שלמים וחדירים, רקמות או מיטוכונדריה מבודדת). מכשיר האוקסיגרף ברזולוציה גבוהה מצויד בשני תאים ומשתמש בחיישני חמצן פולארוגרפיים כדי למדוד את ריכוז החמצן ולחשב את צריכת החמצן בכל תא. שיעורי צריכת החמצן מחושבים באמצעות תוכנה ומבוטאים כפיקומולים לשנייה למספר תאים. כל תא אוקסיגרף ברזולוציה גבוהה מכיל פקק עם יציאות הזרקה, מה שהופך אותו לאידיאלי עבור טיטרציות מנתק-מצמד-מעכב מצע או פרוטוקולי טיטרציה של חומרי ניקוי לקביעת ריכוזים יעילים ואופטימליים לחדירות קרום הפלזמה. ניתן ליישם את הטכניקה למדידת נשימה במגוון רחב של סוגי תאים וגם מספקת מידע על איכות ושלמות המיטוכונדריה, וקיבולת מקסימלית של מערכת הובלת אלקטרונים נשימתית מיטוכונדריאלית.
מבוא
המיטוכונדריה למלא תפקידים חשובים במטבוליזם האנרגיה בתאים, במיוחד באמצעות חמצן כדי לייצר אדנוזין אדנוזין (ATP). הם מעורבים מוות של תאים בכמה מחלות אנושיות. זרחון חמצוני מיטוכונדריאלי (OXPHOS) משלב הובלת האלקטרונים לאורך שרשרת העברת אלקטרונים עם צריכת חמצן סינתזת ATP. החומצה tricarboxylic המיטוכונדריה (TCA) מחזור מעורב ההמרה של חלבונים, פחמימות ושומנים לתרכובות עתירות אנרגיה כמו dinucleotide אדנין nicotinamide (NADH) ו dinucleotide אדנין פלבין (FADH 2). אלקטרונים של NADH ו FADH 2 ואז מועברים קומפלקסי חלבוני שרשרת העברת אלקטרוני הנשימה (I עד IV) ממוקם קרום המיטוכונדריה הפנימי. בנוסף, שני מסלולי חיזור אחרים יכ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. תרבית תאים
- תאי HepG2 תרבות hepatoma אדם 6 ב 25 סנטימטר 2 צלוחיות תרבית תאים במדיום של הנשר השונה של Dulbecco (DMEM) המכיל סרום שור עובר חום מומת 10% (FBS) ו -1%, סטרפטומיצין פניצילין ב 37 מעלות צלזיוס CO חממה (5% 2, 95% אוויר) (צפיפות זריעה: 1 x 10 6 תאים לכל 25 ס"מ 2 תאים בקבוק תרבות, זמן הדגירה בחממה 37 ° C: 48 שעות, צפיפות התאים ב confluency: 4-5 x 10 6 תאים לכל 25 ס"מ 2 תא בקבוק תרבות).
- בצע את ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
קביעת הריכוז האופטימלי digitonin לסלולאריות Permeabilization: ניסוי טיטרציה digitonin
טיטרציה digitonin מתבצעת על מנת לקבוע את הריכוז האופטימלי עבור permeabilization של תאי HepG2. בניסויים אלה, digitonin הוא טיטרציה בתאים שלמים בנוכחות rotenone, succinate (המיטוכונדריה מורכבים השנייה המצע) וכמות להרוות של ADP (להשרות מורכבים השנייה תלויי מצב 3), ומערכ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
מטרת הפרוטוקול הנוכחי הייתה להשתמש respirometry ברזולוציה גבוהה כדי למדוד מתחמי שרשרת הנשימה במיטוכונדריה '(I-IV) מחירי נשימה, קיבולת מערכת תחבורת אלקטרון מקסימלי המיטוכונדריה שלמות הממברנה החיצונית של המיטוכונדריה.
ישנם כמה צעדים קריטיים בתוך הפרוטוקול הנוכחי. ראשית, שיעורי צריכת חמצן הסלולר בדרך כלל הם מנורמלים למספר התאים (pmol / [מספר x שניות של תאים]). לכן, לפני צריכת חמצן הסלולר הניטור, זה קריטי להשתמש .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
מחקר זה נתמך על ידי הקרן הלאומית למדע של שווייץ (Grant nº 32003B_127619).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| ADP | Sigma | A 4386 | |
| אנטימיצין כימי A | Sigma | A 8674 | כימיקל, מתמוסס באתנול |
| Ascorbate | Merck | 1.00127 | כימי |
| BSA | Sigma | A 6003 | כימי |
| FCCP | Sigma | C 2920 | כימי, מתמוסס באתנול |
| Countess אוטומטי מונה תאים | Thermo Fisher Scientific | n/a | מכשיר אוטומטי לספירת תאים |
| Cytochrome c | Sigma | C 7752 | Chemical |
| Digitonin | Sigma | D 5628 | Chemical, מתמוסס ב-DMSO |
| DMEM | Gibco | 31966021 | Medium |
| EGTA | fluka | 3779 | Chemical |
| FBS | Gibco | 26010-074 | רכיב בינוני |
| גלוטמט | סיגמא | G 1626 | כימי |
| Hepes Sigma | H 7523 | כימי | |
| KCl | Merck | 1.04936 | כימי |
| KH2PO4 | Merck | 1.04873 | כימי |
| K-לקטוביונאט | סיגמא | L 2398 | כימי |
| MgCl2 | Sigma | M 9272 | ליבת |
| O2k כימית: Oxygraph-2k | Oroboros Instruments | 10000-02 | מכשיר רספירומטריה ברזולוציה גבוהה |
| אוליגומיצין | סיגמא | O 4876 | כימי, מתמוסס באתנול |
| פניצילין-סטרפטומיצין | Gibco | 15140122 | כימי |
| נתרן אזיד | Sigma | S2002 | כימי |
| רוטנון | סיגמא | R 8875 | כימי, מתמוסס באתנול |
| סוקסינט | סיגמא | S 2378 | כימי |
| טאורין | סיגמא | T 8691 | כימי |
| TMPD | סיגמא | T 3134 | כימי |
| טריפסין | סיגמא | T 4674 | כימי |
מקורות
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem J. 435 (2), 297-312 (2011).
- Lanza, I. R., Nair, K. S. Functional assessment of isolated mitochondria in vitro. Methods Enzymol. 457, 349-372 (2009).
- Zhang, J., et al.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
