Method Article

ניתוח תוכן גבוה קוד פתוח ניצול מיקרוסקופי הדמית חי קרינה האוטומטית

DOI:

10.3791/55119

⸱

January 18th, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Photonics Group, Department of Physics, Imperial College London, 2Institute for Chemical Biology, Department of Chemistry, Imperial College London, 3MRC Clinical Sciences Centre, Hammersmith Hospital, 4Chemical Biology Section, Department of Chemistry, Imperial College London, 5Retroscreen Virology Ltd, 6Pfizer Global Research and Development, Pfizer Limited, Sandwich, Kent, UK, 7Centre for Histopathology, Imperial College London

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מציגים ניתוח תוכן בקוד פתוח גבוה (HCA) מכשיר ניצול הדמית חי קרינה אוטומטי (FLIM) עבור assaying אינטראקציות חלבון באמצעות תהודת העברת אנרגית פורסטר (סריג) readouts המבוסס. רכישת נתונים עבור מכשיר openFLIM-HCA זו נשלטת על ידי תוכנות שנכתבו ב μManager וניתוח נתונים מבוצע FLIMfit.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מציגים מכשיר ניתוח תוכן גבוה בקוד פתוח המשתמש בהדמיה אוטומטית של אורך חיים פלואורסצנטי (FLIM) לבדיקת אינטראקציות חלבון באמצעות קריאות מבוססות העברת אנרגיית תהודה של Förster (FRET) של תאים קבועים או חיים בצלחות מרובות בארות. זה מספק אמצעי לסינון תהליכי איתות תאים הנקראים באמצעות חיישני FRET תוך-מולקולריים או FRET בין-מולקולרי של אינטראקציות חלבון כגון אוליגומריזציה או הטרודימריזציה, שניתן להשתמש בהם לזיהוי שותפי קשירה. אנו מתארים כאן את הפונקציונליות של מכשור FLIM אוטומטי זה ומציגים נתונים לדוגמה מהמחקרים שלנו על אוליגומריזציה של חלבון HIV Gag ומהלך זמן של חיישן ביולוגי FRET בתאים חיים. לאחר מכן מסופק תיאור מפורט של היישום המעשי תוך התייחסות לרשימה של רכיבי חומרה ותיאור של תוכנת רכישת הנתונים בקוד פתוח שנכתבה ב-μManager. מוצג גם היישום של FLIMfit, לקוח מבוסס MATLAB בקוד פתוח עבור פלטפורמת OMERO, לניתוח מערכים של נתוני FLIM מרובי בארות. הפרוטוקולים להדמיית תאים קבועים וחיים מתוארים ומוצגת הדגמה של ניסוי FLIM אוטומטי בצלחת מרובת בארות באמצעות תאים המבטאים מבני FRET מבוססי חלבון פלואורסצנטי. זה משלים על ידי הדרכה בניתוח הנתונים עבור מערך הנתונים הספציפי הזה של FLIM FRET.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השימוש הגובר של ניתוח תוכן גבוה אוטומטי (HCA) גילוי סמים 1 לספריות מתחמות assay הוא השלים את המגמה במחקר בסיסי במדעי חיים לקראת ניסויי הדמיה אוטומטיים מחקרים שיטתיים, למשל, עבור מסך פנוטיפי של ספריות siRNA. HCA האוטומטית גם הופכת חשובה יותר ויותר עבור מחקרים ביולוגיים בקנה מידה קטן יותר, כי בדרך כלל יושמו עם ניסויים ידניים עם עשרות מנות של תאים צלמו עם מיקרוסקופים קונבנציונליים. כוחה הסטטיסטי שמעניק את היכולת assay ולנתח מאה לאלפי שדות מבט מאפשר מיצוע של רעש ניסיוני (כולל "רעש ביולוגי") ואת האוטומציה של איסוף נתוני תמונה וניתוח של מערכי מדגם גדולים יכול לסייע במיגור הטיה מפעילה ולעתים קרובות עשוי להיות מנוצל כדי לזהות את המופע של שגיאות שיטתיות, כגון שינוי פרופיל IRF במהלך רכישה. מבחני קרינה מבוססותמיושמים נרחב HCA, עם מכשור HCA ביותר זמין המסחריים שמציע הדמיה עוצמת קרינה בערוצי רפאים אחת או יותר כדי למפות את ההתפלגות ושיתוף לוקליזציה היחסית של חלבונים שכותרתו. עוד שיטות הדמית קרינה מתוחכמות, כגון הדמית חי קרינה (FLIM), הדמית אנאיזוטרופיה קיטוב והדמית אנאיזוטרופיה קרינת זמן נפתר, הם לא נצלו נרחבים במכשירי HCA מסחריים, אם כי הם מציעים readouts כמותית עצמה, למשל, של אינטראקציות חלבון. כאן אנו מציגים גישת קוד פתוחה ליישום FLIM ב מיקרוסקופ אוטומטית HCA.

חי קרינה מספקים readout ספקטרוסקופיות ratiometric מטבעו, שניתן להשתמש בם כדי להבחין מינים מולקולריים שונים או כדי לחקור את הסביבה המולקולרית המקומית של fluorophore והוא רגיש ריכוז fluorophore, יעילות עירור / זיהוי, ואת השפעת scatteקליטת טבעת מדגם 2. יתר על כן, מאז מדידות חי קרינה יכולות להתבצע ערוץ רפאים אחת, הם להשוואה ישירה בין מכשירים שונים ודוגמאות ללא כיול. הם יכולים להיות מיושמים כדי fluorophores אנדוגני, כולל כמה מטבוליטים הסלולר, שומנים ורכיבים תאי מטריקס, כדי לספק readouts הפנימי של תהליכים ביולוגיים פתולוגיות. לפיכך FLIM ללא תווית ניתן למפות שינויים מטבוליים בתאים 3,4 ו יושם לפקח תאי גזע בידול 5,6 ואת הצמיחה של פיגומים קולגן 7. אנחנו הוכחנו לאחרונה כי FLIM HCA יכול לשמש מבחנים ללא תווית אוטומטית של חילוף חומרים תאיים ניצול autofluorescence 8. נפוץ יותר, עם זאת, מדידות חי קרינת FLIM מוחלים fluorophores החיצוני בעלות תווית ביומולקולות ספציפית, מיושמים לעתים קרובות באמצעות צבעים כי להכתים תאים סלולריים, באמצעות צבעים מצמידי antibodieהים כי יעד חלבונים ספציפיים בתאים קבועים, או באמצעות fluorophores גנטית הביעה מצמידי חלבונים ספציפיים. חי קרינה יכולים לשמש כדי לספק readouts כמותיים החזק של בדיקות ניאון חישת הסביבה הפיסית או כימית שלהם. לדוגמאות, נפרסו צבעי לחוש בשלב השומנים המקומי של קרום התא 9 או צמיגות תא 10 ו biosensors חלבון מבוססי פלורסנט גנטית הביע פותחו לדווח ריכוזי התא מולקולות איתות לרבות IP3 11, PIP2 12 ו calpain 13 או יונים כגון סידן 14,15, אשלגן 16 כלוריד 17.

חיישנים ביולוגיים כגון רבים לנצל העברת אנרגיה פורסטר תהודה (סריג) 18,19 לספק מונה המציין לשינויים קונפורמציה biosensor. סריג בין "התורם" ו "acceptor" fluorophores מתרחשת דרך אינטראקציה דיפול דיפול ישיר טווח קצרעבורו fluorophores בדרך כלל מופרדת על ידי פחות מ ~ 10 ננומטר. לכן זיהוי של סריג מציין את בסמיכות של חלבונים שכותרתו כראוי ולכן מספק אמצעי הקריא אינטראקציות חלבון-חלבון 20, כגון מחייב או oligomerization - גם כנקודות קצה בתאים קבועים או כאירועים דינמיים במדידות מהלך זמן של חיה תאים. על ידי תיוג הוא מבנה מולקולרי מתאים בשני תורם fluorophores acceptor, אפשר גם לקרוא את שינויים קונפורמציה - או מחשוף - של המבנה באמצעות שינוי סריג וזה בסיס חיישנים ביולוגיים רבים 21. מדידות של הסריג יעילות יכולות לספק מידע על מרחק acceptor התורם ואת חלק אוכלוסיית fluorophores התורם עובר סריג. לפיכך, טכניקות הדמיה מבוססות סריג יכולות לשמש למיפוי לכמת אינטראקציות מולקולריות במרחב ובזמן, למשל, על מנת להבהיר איתות תא מעבדת 22. אוטומטing טכניקות הדמיה כזו יכולה לספק מבחני תפוקה גבוהה המבוססת על מונה המציין מסלולי איתות או רשתות.

בשנת HCA, את הודעת הסריג מיושמת לרוב היא הדמית ratiometric רפאים, שבו שינויים ביחס של acceptor לעוצמת תורם ממופים. בעוד גישה זו מיושמת בקלות - והוא זמין קוראי צלחת multiwell רבים זמינים מסחרי - כמוני נפתרו ספקטרלית מדידות סריג דורשות כיול של התגובה הספקטרלית של המערכת 23. זה כולל הצטלבות ספקטרלי הנובעת לדמם דרך רפאי עירור ישיר של acceptor וכן מאפייני ההולכה של המכשיר ואת המדגם (אפקט מסנן פנימי). באופן עקרוני, זה כרוך מדידה של דגימות "שליטה" נוספות מסומנות עם או תורם בלבד או acceptor בלבד.

ממדידות ספקטרלי ratiometric סריג כאלה, סריג יעיליעילות (התוצר של הסריג היעיל בפועל ופרופורציית המולקולות התורמות / acceptor FRETing) ניתן להשיג יחד עם חלקם היחסי של מולקולות תורם acceptor 24. סריג ratiometric ספקטרלית משמש לעתים קרובות עם biosensors סריג unimolecular, שבו והרכב תורם / acceptor ניתן להניח להיות ידוע. כדי לקבוע את שברי אוכלוסיית תורם FRETing ו acceptor, למשל, כדי לקבל עקומת מנת תגובה, ידע של הסריג היעיל בפועל נדרש. זה ניתן להשיג על ידי מדידת מדגם מלא סריג חיובי עם מאפיינים ידועים או באמצעות שיטה אחרת למדידת יעילות הסריג, כגון photobleaching acceptor או FLIM.

שימוש readouts בחי קרינה, סריג ניתן לאתר לכמת ידי מדידות של פליטת התורם לבד - הסרת צורך כיול ספקטרלי ודגימות בקרה נוספות. לפיכך, readouts סריג FLIM ניתן להשוות בין מכשיריםובין מדגמים שונים - נתונים המאפשרים מן אנדוסקופיה או טומוגרפיה של מודלי מחלה חיים 25 עד להיות השווה נגד מדידות של מבחנים מבוססי תאים. על ידי התאמת פרופילי ריקבון תורם קרינת מודל רב-מעריכי ריקבון מתאים המתאים FRETing והלא FRETing אוכלוסיות תורמות, סריג יעילות ושברי אוכלוסייה יכולות, באופן עקרוני, ניתן לקבל ישירות בלי מדידות נוספות. יתרונות משמעותיים אלו, לעומת זאת, מגיעים במחיר של FLIM מחייב פוטונים מזוהים יותר לפיקסל מאשר הדמיה עוצמת נפתרה ספקטרלית - בדרך כלל מאה פוטונים נדרשים להשיג דיוק בחי קביעת 10% כאשר הולם מודל דעיכה מעריכית יחיד ומתי פרופילי ריקבון קרינה הולמים מורכבים (ריקבון multiexponential) מודלים, מספר הפוטונים זוהו נדרשו מגדיל לאלפי. זה הוביל כמקובל לזמני רכישה ארוכים (עשרות עד מאות שניות לכל שדה של viEW) עבור FLIM, במיוחד בעת שימוש זמן בקורלציה ספירת פוטון יחיד (TCSPC) מיושם עם רכישת פיקסל רציפים מיקרוסקופים סריקת לייזר. ניסיונות להגדיל את מהירות ההדמיה באמצעות עוצמות עירור גבוהות יכול להוביל photobleaching ו / או phototoxicity המשמעותיים. יחד עם מחסור בכלי מכשור ותוכנה מתאימים זמינים מסחרי, זה הפריע FLIM מלהיות מנוצל HCA לביולוגית גילוי או מערכות תרופה, שבו מאה אלף שדות מבט הן להיות צלמו. סריקת ליזר TCSPC FLIM יושמה מיקרוסקופ צלחת multiwell אוטומטית 26 למדידות משניות בעקבות זיהוי של "להיטים" על ידי הדמית אנאיזוטרופיה הקרינה היציבה נפתר קיטוב 27, אשר יכול להגיע למהירות הדמיה דומה הדמית ratiometric רפאי 28 שבה הוא שותף יתרונות וחסרונות רבים. הדמית אנאיזוטרופיה הקרינה מנצלת את הירידהב אנאיזוטרופיה הקרינה של acceptor בנוכחות סריג והיא רגישה גם הצטלבות ספקטרלי (למשל, עירור ישיר של acceptor). זה דורש כיול לתת דין וחשבון על דיבורי קיטוב צלב אינו מספק מדידה ישירה של סריג יעיל.

כדי לממש את היתרונות של FLIM עבור HCA, עבדנו כדי לטפל בבעיות של מהירות של רכישת תמונת גישה רחבה יותר את הטכנולוגיה. כאן, אנו מספקים רשימה מלאה של רכיבי תוכנה וחומרת קוד פתוחים שיכול להיות מנוצל כדי ליישם את קורא צלחת multiwell FLIM המהיר האוטומטי המתואר להלן, יחד עם מבוסס מבחני סריג מופת. בגישתנו 29, FLIM מתממשת באמצעות הדמיה רחב בתחום מגודר זמן באמצעות מגבר תמונה אופטית מגודר (ממשלת ישראל), אשר מתואר באיור 1 שיכול לספק שיעורי הדמיה מהר photobleaching הנמוך יותר TCSPC לסריקת קרן יחידה בשל לקבור בה פיקסל במקבילogation. מכשיר openFLIM-HCA שלנו יכול לספק FLIM ללא השגחה, המחייב רק כמה שניות כדי לרכוש נתוני FLIM באיתור כמה 100 פוטונים לפיקסל (תלוי הבהיר של המדגם). בשילוב עם הזמן הנדרש כדי להעביר את המדגם מהשדה הקודם של תצוגה, כדי להתאים את גדרות רכישה ועל מנת לשמור על המדגם בפוקוס, זה בדרך כלל תוצאות פעמי רכישת צלחת multiwell של ~ 10 שניות לכל שדה הראיה 25,28. חתך אופטי יכול להיות מיושם באמצעות מעין-רחב בתחום ניפקוב ( "דיסק מסתובב") סורק 30.

לניתוח נתונים FLIM, פיתחנו כלי תוכנת קוד פתוח בשם FLIMfit 31 כי הוא מסוגל לנתח מערכי נתונים FLIM צלחת multiwell במהירות על תחנות עבודה PC קונבנציונאלי הוא תוסף עבור OMERO 32. FLIMfit מספק יכולות ניתוח הגלובליות (דנו בסעיף 1.2) המאפשרים נתוני FLIM להיות מצוידים צורות מורכבות only כמה 100 פוטונים לפיקסל בהנחת רכיבי חי הקרינה משתנים על פני תמונה או באזור של (ROI) ריבית, ולכן הפחתת מספר הפוטונים זוהו הנדרש, החשיפה לאור בפעם רכישת המדגם ותמונה. ריצת FLIMfit במחשב שולחני רגיל, דורש רק 10s של שניות של זמן חישובית לנתח ערכות נתונים המורכב מ מאות FOVs. כך הוא רכישת נתוני FLIM והניתוח יכולים להתבצע על לוחות זמנים כי הם מעשיים HCA.

חומרת openFLIM-HCA

יישום FLIM HCA שלנו כוללת שישה מרכיבים מרכזיים: (i) מסגרת מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם פוקוס אוטומטי אופטי; (Ii) הבמה מיקרוסקופ ממונע (xyz); (Iii) מקור לייזר עירור; (Iv) מערכת FLIM רחב בתחום מגודר זמן עם מגבר אופטי מגודר (ממשלת ישראל), גנרטור עיכוב מצלמה; (נ) מחשב לרכישת נתונים וניתוח (vi) סורק גלגל ניפקויחידת הדמיה מחולקת אופטי לדכא את האור להתמקד. זה יכול להיות חשוב כאשר הדמית אותות חלשים, למשל, מן biosensors סריג על הממברנה פלזמת תא, שיכול להיות מוצף על ידי תרומות קרינת cytoplasmic או רקע coverslips או בינוני תרבות. נתוני FLIM מגודר זמן נרכשו על-ידי הארת המדגם עם קרינת עירור פעמיו ultrashort, הדמית פליטת הקרינה אל photocathode של הממשלה ישראל ורכישת סדרה של תמונות CCD של זרחן של הממשלה ישראל עבור מגוון של הגדרות של השהיית זמן של שער המגבר האופטי לאחר הגעתו של פולסים העירור. כמו עיכוב השער בפעם הבא עירור הוא גדל, אות הקרינה נתפסה להקטין ואת סדרת תמונות עוצמות קרינה מגודרת זמן רכשו ב- CCD ליצור את סדרת הנתונים הדרושות כדי לנתח את פרופילי הדעיכה של כל fluorophores ב שדה הראייה . Gating של הממשלה ישראל מסונכרן עם פולסים העירורו, עבור סדרה של רכישות CCD, העיכוב של יחסי השער זמן פולסים עירור מוגדר סדרה של הגדלת ערכים מעל הטווח הרצוי. סנכרון זו מושג באמצעות גנרטור העיכוב שמהם מורכבים "תיבת עיכוב מהר" (מתן עיכובים עד 20 ננו-שניות ב 1 צעדי ps) לבין "תיבת עיכוב גסה" המספקת עיכובים בצעד מינימום של 25 ps.

עבור FLIM, עירור יכול להינתן על ידי כל ליזר מהיר. לנוחיותכם, אנו בדרך כלל להעסיק מקור supercontinuum שאוב-סיב לייזר המספק מתכונן פולסים picosecond על פני הספקטרום הנראה שממנו הקרינה עירור המתאים ניתן לבחור עבור כל fluorophore באמצעות גלגל לסנן ממונע עם מסננים הלהקה עוברים שונים. בדרך כלל, אנו משתמשים הספק ממוצע של ~ 100-200 μW על המדגם עם פעימות ב שיעור החזרה 40 או 60 MHz. סמכויות עירור כאלה יוכלו גם להיות מסופק על ידי מקורות לייזר מהירים מבוסס על הכפלת תדר שלבמצב נעול לייזרי ספיר מסומם טיטניום. שימו לב כי משך דופק עירור מתחת ps ~ 100 מספיק עבור רוב הניסויים. גלגל מסנן ממונע שני מצויד במסנני צפיפות ניטראליים משמש כדי לווסת את עוצמת העירור. עבור בטיחות ונוחות, קרינת העירור עשויה להיות מועברת באמצעות סיבים אופטיים מצב יחיד. התצורות עבור FLIM רחב בתחום ואת FLIM המחולק אופטי מוצגות איורים 2 ו -3 בהתאמה. לפרטים נוספים של הרכיבים המדויקים בשימוש, בקר ויקי openFLIM-HCA 33. העתק של רשימת החלקים הנוכחית ניתן החומר המשלים.

עבור FLIM רחב בתחום, קרינת העירור נדרשת כדי להאיר את כל השדה של נוף כמו אחיד ככל האפשר. לשם כך אנו מפנים את קרן הלייזר עירור מפזר הולוגרפית "המגבעת" כי הוא הסתובב בבית 10-50 הרץ לעת-הממוצע את לייזר רבב, עם המטוס של DIFfuser להיות הדמיה למישור המוקד האחורי של העדשה מיקרוסקופ האובייקטיבית. תמונת הקרינה מן יציאת הפלט של המיקרוסקופ מועברת על photocathode של הממשלה ישראל ואת זרחן של (האזור הפעיל אלכסון 18 מ"מ) ממשלת ישראל היא הדמיה על החיישן של CCD המדעי מקורר (גודל שבב 10.2 מ"מ x 8.3 מ"מ) מצלמה בעזרת זוג עדשות מצלמת מתן בהגדלה של 0.7. המערכת נשלטת על ידי מחשב רגיל כי הוא להתממשק המכשור באמצעות פרוטוקולים RS232. בנוסף, המיקרו Arduino משמש לשליטה על תריס נתיב אור העירור כי סגור למעט כאשר מצלמת CCD רוכשת נתוני FLIM וכדי לתעד את האות מ פוטודיודה כי משמשת למדידת ההספק הממוצע מן supercontinuum המסונן ספקטרלית מקור עירור. עבור FLIM המחולק אופטי, את קרינת ליזר העירור מצמידה לתוך במצב יחיד קיטוב שמירת סיב אופטי המתחבר ישירות יחיד סורק הגלגל נפק, כמו יםhown באיור 3. תמונת קרינת פלט מיחידת סורק ניפקוב מועברת על photocathode של הממשלה ישראל ואת שאר המערכת זהה עבור FLIM רחב בתחום.

תוכנת openFLIM-HCA

תוכנת רכישת נתונים כתובה μManager 34. הוא מספק פונקציונלי רכישת נתונים מלא HCA כולל אופציות לשנות את הרצף שבו בארות הצלחת הם צלמו, לרכוש קורסי עת ומכל FOV, לשמור על פוקוס אוטומטי במהלך מדידות ולשלוט גלגלי העירור ופליטה מסננים ואת מחליף dichroic עבור הדמיה ססגונית אוטומטית. אפשר גם להפעיל רכישה "prescan" של עוצמת קרינה על מנת לזהות באופן אוטומטי להקליט את העמדות של FOVs מתאים רכישה עוקבת FLIM פי קריטריונים, למשל, מבוססים על עצמה. נתוני HCA FLIM ניתן לשמור כסדרהשל קבצי TIFF, כסדרה של קבצים שת-TIFF (כלומר, אחד לכל FOV) או כקובץ שת-TIFF יחיד המשלב את כל הנתונים מתוך צלחת multiwell. מידע נוסף ותיאור מפורט של התוכנה μManager ניתן למצוא בוויקי openFLIM-HCA 33.

תוכנת ניתוח נתונים, FLIMfit 31, קוד פתוח MATLAB מבוסס לקוח עבור פלטפורמת ניהול נתוני תמונת OMERO 32, הוא מסוגל לקרוא נתוני FLIM משרת OMERO או מדיסק מחשב, כמצוין באיור 4. זה תוכנן כדי לנתח נתונים מ TCSPC או רחב בתחום מגודר זמן מכשירי FLIM ומספק יכולות רבות כדי להתאים נתוני openFLIM-HCA כולל הולם monoexponential פרופילי ריקבון, להכפיל מעריכים גבוהים פרופילי ריקבון מורכבים, כוללים דגמים כמו פרופילי קרינת ריקבון נפתר קיטוב. זה יכול גם לקחת בחשבון של אותות רקע קבועים המשתנה עם זמן ויכול UTILize פונקציה בתגובת מכשיר במרחב ובזמן נמדד (IRF) או יכול להתאים באמצעות IRF אידיאליזציה שעשויה להיות מוזז על בסיס פיקסל חכם בסכום שנקבע ממדידת IRF מלאת ניסיוני. פרש זמן עולמי (t0) בין IRF ו מדגם ניאון ניתן לקבוע ממדידה של תקן קרינה. וריאציות המרחבי אותות הרקע IRF יכול גם להילקח בחשבון. FLIMfit הוא מסוגל להשתלב נתוני FLIM על בסיס פיקסל-חכם או באמצעות "binning העולמי" או "הולם העולמי" כדי להקל על התאמת נתוני FLIM עם צנועים (מאה) פוטון מספרים למודלי ריקבון מורכבים.

Binning גלובל כרוך צבירה כל הפוטונים להבחין בין הפיקסלים בתוך ROI המוגדר על ידי המשתמש בכל נקודת זמן לספק מספרי פוטון מספיק כדי לאפשר התאמה למודלי ריקבון מורכבים. את ההחזר על ההשקעה יכולה להיות כל השדה של תצוגה (FOV), זה יכול להיות ידני דefined על ידי המשתמש, או שזה ניתן לקבוע באמצעות כלי פילוח התמונה. את ההחזר על ההשקעה יכולה גם להיות מוגדר באמצעות מסכות מיובאות לתוך FLIMfit מתוכנת פילוח תמונה אחרת. עבור יישומי סריג, המקובל להשתמש binning העולמי כדי להתאים למודל ריקבון כפול מעריכים כדי לקבוע את מרכיבי חי קרינה המתאימים FRETing ו fluorophores תורם הלא FRETing כי הם הניחו להיות משתנים מרחבית ברחבי ROI ולאחר מכן כדי לשפץ על בסיס פיקסל חכם עם vales מרכיב בחיים האלה קבוע על מנת לקבל את החלק היחסי באוכלוסייה התורם FRETing בכל פיקסל.

הולם עולמי כרוך התאמת רכיבים בחיים זמני ושברי אוכלוסייה תורמת FRETing חכם-פיקסל על פני כולה FOV- או על פני סט נתוני FLIM שיכול מהווה FOVs המרובה, למשל, מניסוי צלחת multiwell או סדרה עתית של תמונות לכל חי קרינה. הולם גלובל הוא מסוגל לנצל את variati מרחביתעל שברי אוכלוסייה על פני התמונה כי הוא אבד את גישת binning העולמית לספק אילוצים חזקים על הערכת חי רכיב - ולכן תוצאות אמינות יותר - אם כי במחיר של חישוב יותר באופן משמעותי 35. FLIMfit יכול במהירות לנתח מערכי נתונים FLIM צלחת multiwell עם הולם העולמי על תחנות עבודה מחשב קונבנציונאלי עם, למשל, ערכת נתונים multiwell זמן מגודרת FLIM, רכשה עם חמישה שערים הזמן שכל אחד 394 FOV כל אחת מ 672 x 512 פיקסלים, המחייב רק 32 שניות ו -2 GB של זיכרון כדי להתאים למודל דעיכה מעריכית כפול 31. זו הושגה על ידי ניצול קוי להפרדה לפחות אלגוריתם מרובע הולם מיושם באמצעות אלגוריתמים מקבילים מרובה הליכי כדי לאפשר שינוי גודל אפקטיבי על מעבדים מרובי-ליבות ואת קוד FLIMfit עבר אופטימיזציה כדי למזער את השימוש בזיכרון. איור 5 מציג תמונת מצב של ממשק המשתמש הגרפי של FLIMfitניתן למצוא את פרטים ועוד בדף האינטרנט הנתון התייחסות 36. מידע נוסף על הולם העולמי binning העולמי ניתן למצוא התייחסות 31.

הפרוטוקול הבא עבור HCA FLIM באמצעות מכשור openFLIM-HCA והתוכנה שלנו ניתן להתאים למגוון רחב של ניסויי הדמית התא מוצא במידע FLIM. באופן כללי, צלחת multiwell סריג ניסויים צריכים להיות מתוכננים לכלול בארות לשכפל בקרות ביולוגיות חיוביות ושליליות בנוסף לתנאים נלמדים. כאן, אנו מתארים את יישום ספציפי לבצע FLIM אופטית מחולק (ראה איור 3) של תאים Cos להביע סריג בונה המורכב של חלבון mTurquoise פלורסנט חלבון פלואורסצנטי ונוס מצטרפים מקשר פפטיד קצר. כאן mTq32V, mTq17V ו mTq5V הסריג בונה (דן בסעיף נציג תוצאות) מספקים נמוך, בינוני יעילות סריג גבוהה יחד עם הלא-FRETing mTq5A לבנות.שני המושגים הללו ואת החומרים אחרים הנדרשים לעקוב פרוטוקול זה מפורטים חומרי הרשימה.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת מערך צלחת multiwell

  1. הכן תמיסה של 75 מיקרומטר Coumarin 6 באתנול (τ ~ 2.43 NS) למדידות התייחסות לאפשר קביעת t 0.
  2. זרע 150,000 תאים Cos לארבע בארות צלחת 6 היטב ולאפשר לצרף לילה במדיום תרבות (ראה רשימת חומרים).
  3. Transfect אחד טוב כל אחד עם mTq5A, mTq5V, mTq17V ו mTq32V באמצעות מגיב transfection מסחרי בהתאם להוראות והתרבות של היצרן עבור 24 שעות.
  4. ניתוק תאים באמצעות פתרון מסחרי טריפסין / EDTA על פי הפרוטוקול של היצרן.
  5. תאים פיפטה 5,000 Cos המרחפים מאוזן של האנק מלח פתרון (HBSS) להביע mTq5A לתוך כל אחד בארות A1-G3 של צלחת multiwell 96 זכוכית בעל תחתית עובי 1.5 # אשר טופלו קודם לכן עם פולי- L- ליזין. חזור על הפעולה עבור mTq5V לבטא בתאי לתוך בארות A4-G6, mTq17V לתוך בארות A5-G9 ו mTq32V לתוך בארות A10-G12.
  6. השאר גם H1 ריק (כדי לספק מדידה של כל רקע סטטי מצלחת multiwell).
  7. פיפטה 200 μL של HBSS רק לתוך H2 היטב (כדי לספק מדידה של כל אות רקע ממדיום תרבית התאים).
  8. פיפטה 5,000 תאים שאינם transfected ב HBSS לתוך H3 היטב (כדי לספק מדידה של כל אות הרקע מ autofluorescence הסלולר).
  9. פיפטה 200 μL של פתרון צבע 75 מיקרומטר Coumarin לתוך היטב H4 (לספק המחאה על כל וריאציה של t 0 במהלך רכישת צלחת multiwell, למשל, עקב שינויים בטמפרטורת סביבה או לתנודות מעגלי ליזר או עיתוי.

2. קליטת נתונים openFLIM-HCA

הערה: מידע מפורט ניתן למצוא בוויקי openFLIM-HCA 33.

  1. התחל μManager ואת תוסף OpenFLIM-HCA
  2. בחר בקובץ הכיול עבור שילוב הספציפי של יחידת גנרטור עיכובשיעור החזרה לייזר תחת "שליטה FLIM: קובץ כיול תיבת עיכוב: קבצים כיול".
  3. הגדר את התיקייה שבה הנתונים יישמרו תחת "קובץ: תיקיות בסיס גדר".
  4. בדוק את נתיב קרן עירור על מנת להבטיח כי צימוד לתוך הסיב האופטי משלוח יציב וכי יעילות צימוד מוגדל על ידי מדידת הכוח המועבר באמצעות סיבים משלוח באמצעות מד כוח. תנודות נמוכות מ -5% כשרים.
  5. בדוק כי הממשלה ישראל מפעילה הנה יציבה מוצג אות פלט מסך ממחשב הממשלה ישראל על אוסילוסקופ מופעלת על ידי אות הדק קלט ממשלת ישראל.
  6. בדוק את ההדמיה של זרחן ממשלת ישראל על חיישן CCD על ידי כיסוי photocathode של הממשלה ישראל, קביעת הרווח שלה ל -750 V והתמקדות אחת עדשות הממסר כך תמונות של אירועי פוטון יחידים דלילים (בשל אור הרקע הדולף למרות עטיפת ממשלת ישראל ) רשם על CCD חד ככל האפשר.
  7. בדוק כי המדגםשדה הראייה הוא מואר באופן אחיד על ידי הדמית מדגם ניאון אחיד, כגון ירידה של הפתרון לצבוע הפניה על coverslip, באמצעות כוח עירור נמוך מספיק (<1 μW) על מנת להבטיח כי הממשלה ישראל לא רוויה.
  8. בחר את קובץ הגדרת הצלחת המתאים, כלומר, בחר באפשרות עבור 96-גם צלחות ( "קובץ: תכונות פלייט טען").
  9. באמצעות GUI μManager, להבטיח שאין קוביית קרן splitter dichroic בפריים מיקרוסקופ על ידי בחירת עמדה ריקה.
  10. בחר באופן ידני רוחב השער של 4 ns על ממשלת ישראל לצורך הניסוי כולו.
  11. רוכש את נתוני תמונת IRF:
    1. באמצעות GUI μManager, להבטיח כי אין מטרת מיקרוסקופ בנתיב הקרן על ידי בחירת עמדה ריקה. באופן ידני למקם בלוק קרן אנודייז שחור מעל הצריח האובייקטיבי כדי למנוע בריחת ליזר אור וזווית אותו כדי למזער את השתקפות חזרה לתוך מסגרת מיקרוסקופ.
    2. שימוש GUI μManager, להגדיר את המסננים CSUX (עירור, Dichroic, פליטה) כך את החלק היחסי של אור עירור מפוזרים מן גלגל ניפקו ספינינג ניתן הדמיה אך להבטיח את עוצמת אינה מספיקה כדי להרוות את המערכת עבור 200 ms CCD זמן אינטגרציה. זאת על מנת למנוע חשיפה של photocathode ממשלת ישראל כדי יותר מדי אור, אשר עלולים להזיק photocathode.
    3. שימוש בפונקציה מצא MaxPoint על מלוא הטווח של העיכובים המכוסים על ידי תיבת העיכוב לתכנות המהירה. בדוק בתרשים הפלט מוצג ולאחר מכן להתאים את תיבת עיכוב כמובן ידנית על ידי לחיצה על כפתור קדימה כך שהפרופיל IRF מלא נמצא בטווח הסריקה של תיבת עיכוב מהר.
    4. כוון את פרמטרי הרכישה (צפיפות ניטראלית, זמן חשיפה, הצטברות מסגרת) כך CCD אינו רווי בזמן-שער מבריקי זמן שילוב היעיל הוא> 200 ms.
    5. צעדי עיכוב סט 25 ps על העיכוב המלא צלצלדואר ( "שליטת FLIM: תיבת עיכוב מהירה: אכלס עיכובים").
    6. סריקתתמונה IRF ידי לחיצה על "תמונה הצמד FLIM".
    7. רוכש תמונת רקע על ידי חסימת הליזר ( "שליטת נתיב אור: צפיפות ניטראלית: חסום"), צמצום מספר העיכובים ( "שליטת FLIM: תיבת עיכוב מהירה: הגדרת עיכוב נוכחית (PS)"), לעזוב את כל תכונות האחרות ללא שינוי עיתונות "תמונת FLIM Snap".
  12. רוכש את הנתונים לצבוע אסמכתא:
    1. בחר היטב H4 באמצעות GUI μManager ( "שליטה XYZ: עבור אל היטב: H4").
    2. באמצעות GUI μManager, מסננים בחר (עירור 434/17 ננומטר, Dichroic, פליטה 482/25 ננומטר) הדמיה mTqFP.
    3. שימוש בפונקציה מצא MaxPoint על מלוא הטווח של תיבת העיכוב מהר ולאחר מכן להתאים את תיבת העיכוב הגסה ולכן פרופיל הריקבון המלא נמצא בטווח העיכוב של תיבת העיכוב מהר.
    4. לכוון את זמן ההשהיהעד כדי בעוצמה מקסימלית על ידי שינוי "שליטה FLIM: תיבת עיכוב מהיר: הגדרת עיכוב נוכחי (PS)". כוון את פרמטרי הרכישה (צפיפות ניטראלית, זמן חשיפה) כך CCD אינו רווי.
    5. צעדי עיכוב סט 25 ps פני טווח עיכוב המלא ( "שליטת FLIM: תיבת עיכוב מהירה: אכלס עיכובים).
    6. רוכש את הנתונים לצבוע התייחסות ידי לחיצה על "תמונת הצמד FLIM".
    7. לרכוש תמונת מצלמת CCD שני רקע ידי חסימת ליזר העירור (ראה 2.11.7)
  13. רוכש את נתוני FLIM של מדגם צלחת multiwell באמצעות תוכנת רכישת μManager:
    1. סט אשר בארות צריכות להיות צלמו ומספר FOV להירכש לכל טוב ( "רכישת רצף HCA התקנה: עמדות XYZ").
    2. ידני לבחור FOV מופת המכיל המדגם להיות צלם. השתמש FOV זה כדי לקבוע את מסנן צפיפות ניטרלי אופטימלי, רוחב השער על ממשלת ישראל ועלאינטגרציה הזמן של המצלמה כדי להגיע 75% של הטווח הדינמי של מצלמת CCD.
    3. פוקוס אוטומטי גדר ( "שליטת XYZ: מיקוד אוטומטי"): לחץ על "מוקד שליטה השבות בלבד", ולאחר מכן להתמקד באופן ידני על התאים או המבנה של עניין. גדר "טווח חיפוש מיקוד אוטומטי" עד 2000 מיקרומטר ולחץ "Enter". לחץ "AF עכשיו" ליזום הליך אוטומטי. ערך הסטה יופיע בשדה "FocusOffset (מיקוד אוטומטי)".
    4. הזן את הערך לקזז שהושג 2.13.3 לתוך "AF לקזז" לחזור על תהליך הפוקוס האוטומטי פעמים ( "AF עכשיו") כדי לבדוק שהערך לקזז עכשיו אפס, המציין לתפקוד תקין של מערכת הפוקוס האוטומטי.
    5. השתמש בפונקצית "AutoGate" בתוכנת רכישת OpenFLIM-HCA לבחור דגימת לוגריתמים של נקודות הדיחוי. לחלופין, ניתן אלה ייבחרו באופן ידני, ראה להפנותence 36 לקבלת פרטים נוספים.
    6. גדר "צבור מסגרות" לערך תשואות רצויות זמן רכישת נתונים כולל. הגדלת מספר המסגרות שנצברה מגבירה יחס אות לרעש של נתוני FLIM על החשבון גם זמן רכישת נתוני FLIM הכולל גובר.
    7. הפעל את רכישת FLIM של הצלחת multiwell ידי לחיצה על "רצף HCA התחל" כפתור.
  14. לרכוש תמונת מצלמת CCD רקע נוספת על ידי חסימת עירור הליזר (ראה 2.11.7) עם הגדרות רכישה זהות כפי שמוצג לרכישת נתוני FLIM.

3. ניתוח נתונים openFLIM-HCA שימוש FLIMfit

  1. בדוק קבצים נלווים הדרושים לניתוח נתונים FLIM נוכחים (כלומר, IRF ומדידה לצבוע הפניה).
  2. טענו את הנתונים מן הבאר הריקה (H1), מדיום התרבות המכיל גם (H2) לבין התאים ללא תווית המכילים גם במדיום התרבות (H3) לתוך FLIMfit( "קובץ: נתוני FLIM טען") כדי לבדוק אם ישנן תרומות רקע גדול מ -1% של האות מ תאי מבטאים "תורם בלבד", כלומר, בבארות A1-G3.
  3. הכן קובץ רקע משתנה בזמן (TVB) על ידי טעינת מדיום תרבות עם היטב לתוך FLIMfit ( "קובץ: נתוני FLIM טען"). טען את נתוני רקע המצלמה רכשו בסעיף 2.14 ( "רקע: רקע טען") ולהשתמש "כלים: צור מפת צפיפות TVB" אפשרות FLIMfit כדי ליצור את TVB. ראה התייחסות 31 לקבלת פרטים נוספים על TVB.
  4. הכן את מפת Shift מרחבית משתנית IRF ידי טעינת נתוני IRF רכשו בסעיף 2.11 ולחסר ברקע מצלמת CCD רכש בסעיף 2.11.7. השתמש באפשרות FLIMfit "כלים: צור IRF Shift מפה" כדי לחשב את מרחבית משתנה IRF Shift מפה. ראה התייחסות [31] לפרטים נוספים על מפת Shift IRF.
  5. להתאים monoexponential ריקבון לנתונים לצבוע התייחסות רכשו בסעיף 2.12. לצבוע הפניה טען ומפת משתנים IRF מרחבית מחושב בסעיף 3.4, פרמטרים לנכון להגדיר ( "לכל החיים: מס 'Exp: 1") עם t 0 סט כפרמטר מצויד ( "לכל החיים: Shift IRF FIT: מצויד"). שווי t 0 השיגו מדווח אז בטבלה מוצגת בלשונית "הפרמטרים".
  6. לנתח את נתוני FLIM ידי טעינת נתוני FLIM ניסיוני רכשו בסעיף 2.13, מפת מרחבית משתנית IRF מחושבת בסעיף 3.4, ברקע המצלמה רכש בסעיף 2.14, קובץ TVB מוכן בסעיף 3.3 ולהקליד את הערך השלילי של t 0 מתקבל בסעיף 3.5 ( "IRF: משמרת IRF: t 0"). ואז להתאים את נתוני הניסוי למודל ריקבון הרצוי באמצעות FLIMfit 36 בהתאם לדרישות של הניסוי.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי להמחיש את היכולות של מכשור openFLIM-HCA, אנו מציגים שלושה יישומי סריג מופת. הראשונה נוגע סריג בונה כי מעובדי מנתונים בונה מודל הסריג שפותח על ידי המעבדה של סטיבן פוגל 38. הם מהווים סדרה של מבני ניאון expressible הגנטית שבה חלבון פלואורסצנטי תורם (mTurquoise) מקושר fluorophore acceptor (ונוס) על ידי אורכים נשלטו קצר של 5, 17 ו -32 חומצות אמינו (mTq5V, mTq17V, mTq32V). אורכי המקשר השונים בין fluorophores תורם acceptor לגרום יעילות סריג שונה ולכן גלגולים תורמים שונים. כדי לספק שליטה שלילית, ונוס בתוך מבנה 5-אמינו חומצת מקשר הקצר מוחלף אמבר - מוטציה ללא ניאון של YFP (mTq5A) כי לא יכול לשמש acceptor סריג 38. החלפנו Cerulean ב וקטורי pCXV ו pC5A המקוריים על ידי הגבלה לעכל את vectORS עם אנזימים NheI ו BglII ושברי mTurquoise ligating מתעכל באמצעות אותו אנזימים מן וקטור pmTurquoise-N1. האזור המקשר היה ללא שינוי על ידי החלפה זו.

איור 6 מציג FLIM מופת סריג assay באמצעות מערכת מודל זה לידי ביטוי בתאי Cos, שבו צלחת multiwell היא ערוכה עם 3 עמודות כל תאי transfected עם השליטה השלילית (עמודות 1-3), ומקשר חומצת 5-אמינו הסריג לבנות (עמודות 4-6), ומקשר חומצת 17-אמינו הסריג לבנות (עמודות 7-9) ומקשר החומצה 32 אמינו סריג לבנות (עמודות 10-12). שורת H מכיל בארות לאמידת TVB. איור 6 (א) מציג דוגמאות של תמונות לכל חי קרינת רכש אוטומטית של שדות טיפוסיים מבט בכל טוב. ניכר כי הביקורת השלילית (עמודות 1-3) להציג את תקופות החיים הארוכות ביותר וכי החיים התורמים הוא נמוך ביותר עבור הסריג לבנות עם המקשר הקצר lenGTH (עמודות 4-6). איור 6 (ב) מראה כיצד החיים הממוצעים בממוצע לכל כל FOVs בכל טוב משתנה על פני צלחת multiwell. איורי 6 (ג) ו- (ד) להראות מפות בחיים עוצמות ממוזג קרינת תורם מופת עבור FOV של mTq5A ו mTq17V בהתאמה. איור 6 (ה) מראה את הריקבון עוצם קרינת תורם הפרופיל כממוצע של כל התאים צלמו היטב A1, יחד עם ההתאמה למודל ריקבון monoexponential ואת IRF (אשר נשלטת על ידי רוחב שער ממשלת ישראל). איור 6 (ו) מציג את החיים הקרינה הממוצעת עבור כל עמודה של הצלחת multiwell המתקבל בכושר monoexponential-חכם פיקסל. שולחן של החיים תוחלת וסטיית תקן (STD) ניתן למצוא בטבלה 1 להלן. רכישת הנתונים עבור התמונות שמוצגות באיור 6 לקחה בערך 160 דקות לרכוש. הניתוח לקח 92 שניות במחשב 2.6 GHz עם 10 ליבות ו -64 GB של RAM.

את assay מופת השני מדגים את היישום של FLIM סריג לקרוא את oligomerization של Gag HIV-1 במהלך רכבת virions HIV-1 כאמצעי לבחון מעכבים של תהליך זה 25,42. בעת Gag HIV-1 בתאי מארח מתאימים מספק מערכת מודל בשלב זה של מחזור החיים של HIV-1 שכן הוא מוביל להיווצרות של חלקיקים נגיפיים דמויים (VLPs) דומים אינה בוגרים virions HIV-1. עבור assay זה, הבענו HIV-1 חלבון Gag התמזג עם CFP בתאים הלה והשווה את הפעולה של מעכבים שונים באמצעות השפיע על אות הסריג שנבעה oligomerization Gag. פרטים של המעכבים בשימוש מסופקים ביחס 42.

הפרטים של הכנת המדגם ומדידות ניסיוני מתוארים באופן מקיף ביחס 25, שם הראינו שאנחנו יכולים להשתמש FLIM להקריא boה heteroFRET בין צבירה חלבונים Gag שכותרתו stochastically עם CFP ועם YFP, וגם homoFRET בתאים המבטאים Gag רק שכותרתו עם CFP. למרות homoFRET אינו נוהגים להציג שינוי בחיים תורמים, שזה מעיד על מידת מקרה המיוחד של CFP שבו fluorophore קיים בשני איזומרים עם גלגולי קרינה ממוצעים שונים 40,41. את ההודעה הומו-סריג CFP יש את היתרונות של הכנת המדגם פשוטה לעומת סריג הטרו CFP / YFP והוא יותר ספקטרלי יעיל, אשר יכול להיות חשוב עבור readouts סריג מרובב.

העבודה הקודמת שלנו להחיל FLIM סריג כדי assay את oligomerization Gag בנוכחות של N-myristoyltransferase (NMT) מעכב 42. מעכב זה משבש את האנזימים אנדוגני אחראי תוספת של חומצה myristic כדי Gag, המאפשרת חלבונים Gag להיקשר הממברנה פלזמה היא תנאי הכרחי 43 להיווצרות virions HIV אוVLPs. הראינו כי הן readouts heteroFRET ו homoFRET יכולה להשיג Z "של> 0.6 במחקרי מנת תגובה עם מעכב NMT. Z 'הוא פרמטר המשמש בתעשיית התרופות כדי לציין את האיכות של assay ומייצג את ההבדלים הערכים הממוצעים של בקרות חיוביות ושליליות וממרחים היחסי כדי ליצור מטרי ערך יחיד של איכות assay - עם Z "> 0.5 נשקל "מצוין" עבור assay תרופות 44. נציין כי ביצועים מצוינים הושגו עם דגימות לגביהם בוצעו השינוי בחיים תורמים ממוצעים היה בסדר גודל של 300 נ.ב. - הוכחת הכח הסטטיסטי של ניתוח נתוני FLIM עבור מספר גדול של תאים, המאפשר readouts השימושי להתממש באמצעות הרבה יותר קטן שינויים בחי קרינה מאשר אפשרי עם המספרים הטיפוסיים של תאי הדמיה בניסויים מיקרוסקופיה ידניים.

כאן, אנו מציגים FLIM צלחת multiwell נתוני הסריג להגדיר השוואת 4 תרכובות מעכבות עבור oligomerization HIV Gag (המיועד ICL13, ICL14, ICL15 & ICL16). לצורך ניסוי זה, השתמשנו את ההודעה homoFRET עם תאים הלה transfected זמני עם הפלסמיד Gag-CFP. סך של תשע מנות שונות של כל מעכב יושם בעקבות הפרוטוקול בתקן המפורט התייחסות 32, מתן שתי בארות חוזרות לכל מצב. כביקורת חיובית, עמודה 1 מציג תאים המבטאים MYR-Gag, חלבון Gag מוטציה חסר מחצית חומצה myristic שאינו יכול להתארגן VLPs וכך המדמה עיכוב מוחלט. כביקורת שלילית סופקה על ידי תאי מינון להביע Gag-CFP רק עם רק הרכב המשמש כדי לספק את המעכבים במדורי אחרים (עמודת 11). בסך הכל שמונה FOV נרכשו לכל טוב.

נתונים היו מצויד מודל דעיכה מעריכית יחיד על בסיס פיקסל אחר פיקסל ואת plat חי קרינהמפת הדואר המראה את החיים הממוצעים היטב (מעל כל הפיקסלים מעל הסף העוצם פני השמונה שדות מבט) מוצגת למטה באיור 7 (א). איור 7 (ב) מציג את העלילה של פעם בחי קרינה המתאימה כפונקציה של ריכוז מעכב. שלושה של מעכבי להראות השפעה מעכבת (ICL13, ICL15 & ICL16) כאשר מודגרות עם תאים המבטאים Gag-CFP. מעכב אחת (ICL14) אין השפעה בכל מנה הנבדקת. The Z 'שחושב צלחת זה היה 0.51. הערכים המתקבלים עבור בקרות חיוביות ושליליות מוצגים על איור 7 (ב) כנקודות בשחור ב 100 מיקרומטר ו 0.1 ננומטר.

עקומות מנה תגובה עבור ICL13, ICL15 ו ICL16 שמוצג באיור 7 (ב) צוידו אז עד 4 מודל רגרסיה ליניארית לוגיסטי פרמטר עם מקדם היל קבוע 1 45 עם מקסימלית גלגולים מינימום מקובעהערכים המתקבלים חיובית (עמודה 1) והשלילי (עמודה 11) שולט בהתאמה. ערכי 50 IC חזרו במשך שלוש העקומות היו אז: 38 ננומטר, 24 ננומטר ו -116 ננומטר עבור ICL13, ICL15 ו ICL16 בהתאמה. לשם השוואה עם 50 ערכים IC שהושג באמצעות FLIM תאיים סריג מדידות, קבענו IC 50 עבור עיכוב של הפעילות האנזימטית של NMT1 אנושי רקומביננטי ב assay האנזים ביוכימיים שדווח בעבר שלנו 42. שלוש התרכובות נמצאו פעילה ידי FLIM סריג הם גם הפעילים ביותר assay זה (IC 50 ערכים של 17 ננומטר, 51 ננומטר ו -39 ננומטר עבור ICL13, ICL15 ו ICL16, בהתאמה), עם ICL14, אשר לא זכו לתגובה כלשהי משמעותית ב assay סריג FLIM, להיות בקירוב 100-לקפל פחות פעילים נגד NMT1 (IC 50 של 1700 ננומטר). עבור תרכובות הפעילות, ערכי 50 IC שהושגו באמצעות שיטות assay העצמאיות אלה דומים להפליא, עם שינויים קלים סביר המיוחס דifferences ספיגה או מטבוליזם של המתחם בתאים.

מחקר קטן זה מדגיש את היכולת של HCA FLIM להפלות את העצמה של תרכובות שונות אשר פועלות על אותו היעד של עניין. אנו מאמינים כי זוהי ההפגנה הראשונה של מסך באמצעות FLIM האוטומטי בהקשר תכול גבוה כדי ליצור עקומות מינון תגובת מספר וממחיש את פוטנציאל FLIM לחול על מסך ו / או לאפיין תרכובות טיפוליות שימושיות.

ניסוי FLIM סריג המופת השלישי נוגע biosensor גנטי הביע סריג עבור חלבון Exchange מופעל על ידי monophosphate אדנוזין המחזורי (cAMP (EPAC)), אשר מהווה גורם חילופי גואנין ראפ-1 כי נקשר ספציפית למחנה. EPAC זה biosensor סריג (EPAC-S H188) מנצל חלבון פלואורסצנטי mTurquoise2 (mTq2FP) כמו fluorophore התורם משלבת שני ונוס-FP ליישם שיתוףmposite acceptor 46. cAMP הוא שליח שני נמצא בכל מקום והוא מעורב שפע של תהליכים תאיים ברחבי אורגניזמים שונים. הוא מסונתז על ידי cyclase adenylate מהמרת ATP על קרום התא. כאן אנו מדגימים את היכולת שלנו הקריא ולכמת פעילותה בתאים חיים HEK293T בעקבות תוספת של forskolin, גידול מפעיל cyclase adenylate כי upregulates הייצור תאיים של cAMP ולכן מגביר ריכוז ציטופלסמית שלה. חיישן EPAC זה עובר סריג במצבו המומת (המאוגד) ועליות בחיים התורמות שלה עם ריכוז cAMP כמחנה מוביל פתיחת biosensor. פרופיל הריקבון מונה מעריכים של mTq2FP עושה biosensor זה מתאים יותר לניתוח חי כמותיים מ biosensors המבוסס CFP 45. איור 8 הציג דוגמא של קורס היסטוריה המתועד באמצעות מיקרוסקופ FLIM צלחת multiwell האוטומטי שבו יש לנו להתוות את השינויבגלגול ממוצע ושינוי שבר האוכלוסייה התורם FRETing לאורך זמן בעקבות התוספת של 100 forskolin מיקרומטר. לשם פשטות, נניח כי האות כולל יכול להיות מתואר על ידי תערובת של FRETing monoexponential ותורמים שאינם FRETing ואת החלק מאוכלוסיית biosensor מופעל EPAC הסריג הושג על ידי תואמת פרופיל דעיכה מעריכית כפול על פני סדרת הזמן.

לרכישת נתונים של cAMP (EPAC) חמישה עיכובים השער, עם רוחב השער של 4,000 ps, ​​נבחרו עם זמן השהיה מוגדר 1,300 ps, ​​4,300 ps (עוצמת שיא), 4919 ps, 6656 ps, 8035 PS, 1, 0391 PS ו 16,000 PS. שעת אינטגרצית מצלמה עבור כל עיכוב הייתה 250 ms. באחת היטב, רכשנו זמן מנות FLIM עם תמונות שנרכשו כל 10 שניות במשך 10 דקות. נקודות הנתונים רכשו בזמנים 120 s ו 130 s הוסרו בגלל התוספת של forskolin גרמה לשינוי קטן במצב מוקדי המדגם בעבורםדואר של עוצמת הקרינה שנרשמו במהלך הרכישות FLIM בנקודות זמן אלה.

לניתוח נתונים התמונות הועמסו FLIMfit ו מפולח לכל תא. הנתונים לכל חי קרינה היה מצויד מודל ריקבון כפול מעריכים באמצעות IRF וערך t 0 קבוע המתקבל לצבוע הפניה (75 מיקרומטר Coumarin 6). הקרינה התורם מתכוון בחיים כממוצע של כל התאים מוצג באיור 8 (א). איור 8 (ב) מראה את השינוי בשבריר אוכלוסיית FRETing לאורך הזמן מחושב על ידי התאמת אותם נתוני FLIM למודל אותו ריקבון פעמים המעריכים

figure-results-1

שם β הוא שבריר תורם FRETing. אנו מניחים תערובת של FRETing והלא FRETing elements עבור נקודות זמן לפני תוספת של forskolin. כדי להשיג חיים אלה, בכושר מעריכים כפול היה מוחל על המועדים לפי שעון השלושה הראשונים נותנים גלגולים של τ 1 = 3,964 ± 21 ps עבור התורם הלא FRETing, ו τ 2 = 3,022 ± 27 ps עבור תורם FRETing. אלה נפתרו עבור בכושר הבא של הנתונים כולו מוגדרים לקבל את ערכי β בכל נקודת זמן.

לסיכום, הצגנו תוצאות HCA FLIM ולמופת שלוש דגימות ניסוי. הראשון היה צלחת 96 באר ערוך עם תאי Cos להביע סריג בונה הכוללת תורם mTqFP הצמוד אחת מעמד acceptor ונוס FP או אמבר לא פלורסנט לבנות על ידי שינוי אורכי מקשר פפטיד. שינוי סריג יעיל ולכן חיים תורמים עם אורך מקשר ניכר בבירור ואת סטיית ההתקן של החיים הממוצעים של כל מבנה הייתה פחות מ -36 ps. אסא המופת השניy היה "מסך" של ארבעה מעכבי פוטנציאל myristoylation של חלבון HIV Gag עבורו עיכוב% חושב מתוך הווריאציה של פעם בחי קרינת תורם ממוצעת עם ריכוז מעכב נמדד תאים הלה לבטא חלבון Gag שכותרתו עם CFP. הודעה זה מבוסס על homoFRET, אשר בדרך כלל לא היה נוכח שינוי בחיים תורמים אבל עושה עבור CFP כי זה קיים איזומרים מרובים עם גלגולים שונים ניאון. זה יכול להיות שימושי מבחינת יעילות ספקטרלית, למשל, עבור readouts סריג השונה ריבוב 25. את assay המופת השלישי היה קורס ניטור בזמן תאי חי HEK293T המבטאים את biosensor סריג cAMP, EPAC. זה אפשר לראות את התגובה הצפויה בעקבות טיפול עם forskolin והיישום של FLIMfit באמצעות מודל דעיכה מעריכית כפולה עם מספר הפוטונים זוהה להיות בקנה אחד עם הדמיה תא חי - כפי שהראינו בעבר עם biosen LIBRA סריגסור עבור IP3 47.

figure-results-2
איור 1. סכמטי של FLIM זמן מגודר רחב בתחום באמצעות מגבר תמונה אופטי מגודר (ממשלת ישראל). בצד שמאל, מראה סכמטי של המערכת הניסיונית. בחלק עליון מימין, סכמטי של דופק עירור, עמדת תמונות מגודרת זמן ובכושר monoexponential לנתונים. צד ימין למטה, קריקטורה בה נראה דעיכת הקרינה משני האובייקטים המוצגים המערכת הניסיונית. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-3
איור 2. סכמטי של השדה הרחב openFLIM-HCA באמצעות מגבר תמונה אופטי מגודר (ממשלת ישראל). ראה טקסט עיקרי עבור תיאור מפורט יותר שלרכיבי המערכת. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-4
איור 3. סכמטי של מחולק אופטי-HCA openFLIM באמצעות מגבר תמונה אופטי מגודר (ממשלת ישראל) עם יחידת סורק גלגל נפק. ראה טקסט עיקרי עבור תיאור מפורט יותר של מרכיבי המערכת. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-5
איור 4. סכמטי של זרימת נתוני תמונה מתכנית רכישת Manager כדי OMERO שרת או דיסק מחשב ולתוך FLIMfit לניתוח. זרימת נתונים מתחילה ב l העליון בפינת EFT שבו נתוני תמונת גלם נרכשים תוכנת רכישת μ-מנהל. הפריטים הנמצאים בתיבה המקווקות מייצגים את שלבי ניתוח נתוני FLIM, בעוד אלה שמחוץ מתאימים רכישת הנתונים והאחסון. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-6
תמונת מסך איור 5. של ממשק המשתמש FLIMfit. למעלה משמאל, רשימה של שדות של נוף טעון כעת ותמונת עוצמת קרינה של השדה הנבחר הנוכחי של נוף. צד שמאל למטה, בחירה של מודל הולם ותנאים הולמים. בחלק עליון מימין, ריקבון קרינה עבור אזור הנוכחי של ריבית (עיגולים כחולים), לנכון נתונים (קו אדום), IRF (אדום קו מקווקו) עם שאריות לנכון להלן (קו כחול).g5large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-7
FLIM צלחת איור 6. multiwell של מודל סריג בונה mTq5V, mTq17V, mTq32V לידי ביטוי בתאים Cos. (א) תמונות לכל חי קרינת מופת של FOV בכל טוב עבור מבני סריג שונים לידי ביטוי בתאי Cos כפי שפורטו טקסט. (ב) מפת החום של חי קרינה ממוצעים ונוס כממוצע של כל התאים בכל טוב. (ג) תמונה עוצמת אמבר mTurquoise ועליהן מפת החיים (סרגל קנה מידה 20 מיקרומטר). (ד) תמונה עוצמת mTurquoise ונוס (17 חומצות אמיניות) ועליהן מפת החיים (סרגל קנה מידה 20 מיקרומטר). (ה) פרופיל עוצם ריקבון נמדד (עיגולים כחולים) של mTq5A לבנות (שליטה שלילית) קרינה כממוצעת של כל התאים צלמו באר1, יחד עם התאמה של הנתונים כדי ריקבון monoexponential (קו מוצק כחול) IRF (הקו הכתום מקווקו). (ו) גרף של חיים ממוצעים בממוצע לכל כל עמודה פני צלחת multiwell, במוטות שגיאה מראות את סטיית ההתקן בחי קרינה בין שדות ראייה. לקבלה (אד) ערכי חיים מיוצגים באמצעות סולם צבעי סרק במגבלות המצוינות פיקושניות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-8
איור 7. מסך FLIM צלחת multiwell Exemplar של מעכבי Gag באמצעות תאים הלה להביע Gag-CFP. (א) מפת חום של פעם בחיים הקרינה התורם ממוצעת לכל טוב עבור צלחת multiwell ערוכים עם 1 טור תאים מציגי טרנספקציה עם MYR-Gag-CFP בתור positiv שליטת דואר עבור עיכוב, טור 11 הצגת תאי transfected עם Gag-CFP נחשפה רכב בלבד, ואת הריבועים הצבעוניים המקווקוים המציינים את הבארות שהיו במינון עם אחד מארבעה המעכבים שונים עם ריכוזים הנעים בין טור מינון גבוה 2 לעמודה במינון נמוכה 10 . סולם הצבעים שווא מייצג את החיים הקרינה הממוצעת החל 2,200 ps 3,100 ps. (ב) מגרשי חי קרינה עבור כל מעכב במוטות שגיאה מראות את סטיית ההתקן בין בארות חוזרות. נקודות בשחור ב 2 ו -4 על הציר האופקי הן נקודות שליטה החיוביות ושליליות השיגו בהתאמה מ עמודות 1 ו -11 בהתאמה. קווי המוצק מצביעים על התאמה לנתונים עקומים מנת התגובה עבור המעכבים השונים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 8 "src =" / files / ftp_upload / 55,119 / 55119fig8.jpg "/>
איור 8. שימוש Exemplar של FLIM לקרוא את biosensor סריג EPAC במדידה זמן לשגות באמצעות תאים HEK293T. שינוי (א) אומר בחי קרינה ו (ב) חלק של תורם FRETing כפונקציה של זמן לאחר תוספת של forskolin שמציין את הפס הירוק. הברים שגיאה להראות את סטיית התקן לכל תא. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

לכל טוב STD לִטְעוֹת לכל טוב STD לִטְעוֹת
mT5A 4008 32 12 mT17V 3004 26 10
mT5V 2717 35 13 mT32V 3133 30 11

חי לוח 1. ממוצע וסטיית תקן (STD) של מבני הסריג.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תיארנו מיקרוסקופ צלחת multiwell אוטומטי המיועד HCA באמצעות FLIM מגודרת אמת. מכשיר זה נשלט באמצעות תוכנת קוד פתוח שנכתב μManager עם אפשרות של שמירת הנתונים לשרת OMERO ועל ניתוח נתונים FLIM המתבצע באמצעות 36 FLIMfit, תוכנת קוד פתוח שנכתב ב- Matlab וזמין כלקוח OMERO 32 המכשיר μManager תוכנות שליטה, openFLIM-HCA, זמינה 33 מקוונים עם רשימה של רכיבי מערכת 48 כדי לאפשר לחוקרים אקדמיים לבנות מכשירי HCA FLIM משלהם.

על מנת להשיג נתוני FLIM חזקים, יש צורך לייעל את גדרות רכישת ממשלת ישראל ו CCD, ולהביא בחשבון של הבדלים כלשהם t 0. כמתואר 3.8.2, מצלמת הגדרת רווח ממשלת ישראל ו CCD זמן האינטגרציה צריך להיות מוגדר להגיע ~ 75% של הטווח הדינמי CCD. Uלשיר מתחי הצטברויות מסגרת CCD מרובות ממשלה ישראל גבוהים בכל עיכוב שער הזמן מגדיל את יחס האות לרעש 49 אבל זה מאריך את זמן רכישת FLIM הכולל (מאז פוטוני קרינה פחות נרכשים לכל מסגרת לפני מרווית מצלמת CCD ולכן מספר הצטברויות מסגרת צריך להיות מוגבר) וכך trade-off זה יש להכריע עבור כל ניסוי. הכיול של הגנרטור עיכוב תלוי שיעור החזרת ליזר וזה לכן, יש להבטיח כי קובץ הכיול הנכון עבור שיעור ההחזרה בשימוש הוא נטען לתוך תוכנת הרכישה. הליך כיול תיבת העיכוב ניתן למצוא בוויקי openFLIM-HCA 33.

אם autofluorescence הסלולר הוא נמוך לעומת אות הקרינה, אנו משתמשים האות מ מדיום תרבות רק המכיל היטב כדי לספק את הרקע משתנה בזמן (TVB). כדי למזער קרינת רקע ממדיום תרבית תאים, נמנענומדיה המכילה פנול אדום. אם autofluorescence הסלולר הוא משמעותי, אז TVB עשויה להיגזר מדידות של תאים ללא תווית. עם זאת, בטיפול במקרה זה יש לנקוט, כמו זה מבוסס על ההנחה כי הרקע autofluorescence הוא זהה עבור כל פיקסל בתמונה. הנחה זו לא תהיה תקפה אם autofluorescence משתנה באופן משמעותי על פני תא או שקורה העירור או רגישות זיהוי אינו אחיד על פני שדה הראייה.

רכישת תמונה IRF באמצעות פולסים אור עירור מפוזרים מספק את פרופיל IRF הזמני כי הוא ומפותל עם מודל הנתונים בתהליך הולם וגם מספק מפה של וריאציה המרחבית של IRF פני שדה הראייה. IRF, ניתן למדוד על ידי הדמית מדגם פיזור כגון השעית colloidal אם כי, המכשיר שלנו, באמצעות אור העירור המפוזר מן הגלגל נפק מספק מדידה נקיה של IRF. קביעה מדויקת של עיתוי of IRF, חשוב כי טעויות השהיית הזמן בין העירור והזמן-gating יכולות להשפיע בצורה משמעותית את התהליך ההולם, במיוחד כאשר הולם מורכבי מודלי דעיכה מעריכית. IRF, רכש באמצעות אור העירור מפוזר לא בדיוק מה שדרוש עבור התהליך ההולם כי היא רשמה על גל העירור ולא על גל פליטת קרינה, אשר יכול להשפיע על עיתויה, למרות הווריאציה המרחבית של IRF צריכה להיות זהה בשני אורכי הגל. בנוסף, IRF המפוזר עשויים להיות מוזז גלובלי יחסית בזמן אל IRF הנכון בשל מרחק אופטי שונה מאובייקט הפיזור, כפי שנהוג עבור IRF רכשה מן הגלגל נפק ב FLIM המחולק אופטי. תיקון זה, t 0, המהווה את המשמרת הזמנית העולמית הדרושה שאמורים להיות מיושמת על IRF אור העירור המפוזרת רכש, מחושב מנתוני monoexponential לצבוע התייחסות כמצוין Protocol צעד 4.4. הצבעים הבאים יכולים לשמש עבור אורכי גל עירור שונים: 75 מיקרומטר Coumarin 153 פתרון מתנול (τ ~ 4.3 ns 50) יכול לשמש עירור בטווח 295-442 ננומטר; פתרון מיקרומטר Coumarin 6 75 באתנול (τ ~ 2.43 ns 37) יכול לשמש עירור בטווח 430-500 ננומטר; ופתרון Rhodamine B 75 מיקרומטר במים (τ ~ 1.7 ns 37) יכול לשמש עירור ננו בטווח 488-575. נציין כי, למרות שזה אפשרי FLIMfit להשתמש IRF שונה עבור כל פיקסל של המערכת, בדרך כלל סביר להפוך את ההנחה כי משתנה IRF מרחבית יש אותו הפרופיל זמני עבור כל פיקסל בתמונה אבל מציג מגוון של משתנה קיזוז זמני מרחבית ביחס t 0 העולמי. אנו מתארים זה כמפת משמרת IRF, אשר נקבעה בהתאם IRF האור המפוזרת. יחד, פרופיל IRF, t 0 ומפת IRF המשמרת משמשים enפיקסל בטוח שכל ב FOV מצויד IRF המתאים. חשוב לציין, t 0 יכול להשתנות באיטיות לאורך זמן כך זה צריך להימדד לפני כל רכישת נתונים FLIM.

המשתמש צריך להחליט כיצד לטעום את פרופילי ריקבון פלואורסצנטי נדרש להגדיר את הרוחב של שערים בזמן והעיכובים היחסיים לאחר עירור. באופן כללי, רצוי להשתמש רוחב שער רחב על מנת למקסם את האות זוהה ובדרך כלל אנו משתמשים רוחב שער מוגדר כ -4 ns עבור FLIM של תאים שכותרתו עם חלבוני קרינה. מספר עיכובי זמן שער צריך להיות מספיק כדי לטעום את פרופיל ריקבון הניאון (כולל שער אחד להגדיר למדוד את האות רק לפני דופק העירור) בהתחשב במורכבות של מודל ראוי כי תשמש בניתוח. הערך האופטימלי יכול לסמוך על הגלגולים ואמפליטודות יחסיים של מרכיבי הריקבון. באופן כללי, 4 שערים מספיקים monoexponential הולם דועך תוך 7 או יותר שערים רשאילשמש מודלי ריקבון מורכבים יותר.

נציין כי FLIM יכול להיות מיושם באמצעות מגוון של טכניקות תחום תחום בזמן או תדירות HCA FLIM האוטומטית של מערכי צלחת multiwell יושמה לראשונה מזה readouts (לא חתך) רחב בתחום מיקרוסקופ באמצעות חיים במישור תדר של סריג 51. קורא צלחת multiwell FLIM חתך האופטי האוטומטי הראשון עבור HCA ניצול רחב בתחום הדמית זמן מגודר 28 נמסר אז. בהמשך, רחב בתחום HCA FLIM תחום תדר (לא חתך) יושמה למסך פוסט שינויי translational (זירחון טירוזין) על פני ספרייה גן באמצעות סריג 52 ו HCA FLIM מגודר זמן הוחל על סריג מבחנים של HIV-1 Gag oligomerization 53 ושל SUMOylation של FOXM1 54 ושל Raichu RhoA ו biosensors Rac1 33. כמו כן ניתן להשתמש TCSPC עבור FLIM צלחת multiwell 26 אבל עד כה הוא הוכיח מאתגר להתאים tהוא התפוקה של טכניקות ניצול גילוי רחב בתחום. גישה המתעוררים אחד שיכול לטפל בבעיה זו היא השימוש במערכים של גלאי ספירת פוטון יחידים כגון מערכי SPAD 55.

נציין כי כל מונה המציין הסריג באמצעות חלבוני ניאון ומחייב זהירות כי הערכים המוחלטים של פרמטרים המתקבלים FLIMfit או כל תוכנה לניתוח FLIM אחרת יהיה תלויים בהנחות המשויך למודל ההולם. לדוגמא, שם תורם הסריג יש מרכיב ריקבון שני משמעותי, השימוש במודל biexponential כדי להתאים את נתוני FLIM הסריג יכול לגרום תרומה של רכיב הריקבון מהר, הקשורות בדרך כלל אוכלוסיית FRETing להופיע במיקום גבוהה יותר ממה שהוא צריך. לכן רצוי להשתמש תורמים עם חיים שלמים מונו מעריכים כגון mTq2FP. גם אז, מחקרים שנעשה לאחרונה הראו כי ניתוח סריג עדיין יכול להיות מושפע מדינות אפלות של חלבוני קרינת acceptor או על ידיההטרוגניות של גורם אורינטצית κ 2 עקב חלוקה של תצורות fluorophore עם מגוון רחב של זוויות כרומופור ומרחיקה 56. אף על פי כן, אנו ואחרים הראינו שקריאות חי קרינה של סריג לעשות להניב תוצאות שימושיות המתואמים עם מדידות ביוכימיות יכול לשמש מסך עבור אינטראקציות חלבון או לעקוב דינמיקה של חיישנים ביולוגיים. לפיכך פלטפורמת HCA openFLIM זה יכול להיות מיושמת על מגוון רחב של מבחני קרינה מבוסס חי ניצול סריג או הסלולר autofluorescence 8, כמו גם מתן readouts כמוני של בדיקות מבוססות צבען 25.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף. למממנים לא היה כל תפקיד בתכנון המחקר, איסוף וניתוח נתונים, החלטה לפרסם או הכנת כתב היד.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים בתודה על מימון ממועצת המחקר לביוטכנולוגיה ומדעי הביולוגיה בבריטניה (BBSRC BB/E003621/1, BB/H00713X/1 ו-BB/M006786/1), מועצת האסטרטגיה הטכנולוגית הבריטית (פרס הטכנולוגיה CHBT/007/00030, EP/C54269X, בשותפות עם AstraZeneca, GE Healthcare, GSK, Kentech Instruments Ltd) ו-Wellcome Trust (WT 095931/Z/11/Z). FG מכיר בסטודנט לדוקטורט ממועצת המחקר להנדסה ומדעי הפיזיקה בבריטניה (EPSRC). DA, DK ו-SW מכירים במלגות דוקטורט מהמכון לביולוגיה כימית במימון EPSRC.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
מסגרת מיקרוסקופאולימפוסIX81
http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf פוקוס אוטומטי אופטיאולימפוסZDC
שלב מיקרוסקופ ממונע http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf (xyz) Marzhauser00-24-565-0000עירור בקרת Corvus
FianiumSC400-4לייזר Supercontinuum http://www.nktphotonics.com/product/sc400-4-compact-supercontinuum-laser/
מגביר אופטי מגודר  KentechHigh Rate Imager (HRI)
Kentech---See מחולל עיכוב זריז ומצלמת מחולל עיכוב מדויקת
HamamatsuORCA-ER-II
Nipkow יחידת סורק דיסקים CSU-X1 http://www.yokogawa.com/solutions/products-platforms/life-science/confocal-scanner-unit-csu/csu-x1/
מפזר כובע עליוןThorlabsED1-S20-MDמפזרים מהונדסים
mTq5V Oxford GeneticsP3850mמבנה ונוס טורקיז עם 5 חומצות אמינו
מקשר mTq17VOxford GeneticsP3847mמבנה ונוס טורקיז עם 17 חומצות אמינו
מקשר mTq32VOxford GeneticsP3848mמבנה ונוס טורקיז עם 32 מקשר חומצות אמינו
mTq5AOxford GeneticsP3849mמבנה ענבר טורקיז
HEK293T---סוג תא --- בשימוש
פנול ללא אדום HBSSSigma Aldrich55021C-1000MLמדיה
מדיה תרבית DMEM + 10% FBS + 0.5% אנטיביוטיקה
DMEMסיגמא אולדריץ'D6046-500MLלמדיה תרבית
FBSSigma Aldrich12003C-500MLלמדיית תרבית
xTremeGene9Sigma Aldrich6.37E+09לטרנספקציה, עקוב אחר הפרוטוקול המקוון של La Roche
trypsin/EDTA SolutionThermo FischerR001100לניתוק תאים, עקוב אחר הפרוטוקול המקוון של Thermo Fischer
שלב עם מקור לייזר מחוללי עיכוב הדמיה

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zanella, F., Lorens, J. B., Link, W. High content screening: seeing is believing. Trends Biotechnol. 28 (5), 237-245 (2010).
  2. Bastiaens, P. I., Squire, A. Fluorescence lifetime imaging microscopy: spatial resolution of biochemical processes in the cell. Trends Cell Biol. 9 (2), 48-52 (1999).
  3. Skala, M. C., et al. In vivo multiphoton microscopy of nadh and fad redox states, fluorescence lifetimes, and cellular morphology in precancerous epithelia. PNAS. 104 (5), 19494-19499 (2007).
  4. Datta, R., Alfonso-Garcıa, A., Cinco, R., Gratton, E. Fluorescence lifetime imaging of endogenous biomarker of oxidative stress. Sci Rep. 5, 9848(2015).
  5. König, K., Uchugonova, A., Gorjup, E. Multiphoton fluorescence lifetime imaging of 3d-stem cell spheroids during differentiation. Microsc. Res. Tech. 74 (1), 9-17 (2011).
  6. Wright, B. K., et al. Nadh distribution in live progenitor stem cells by phasor-fluorescence lifetime image microscopy. Biophys. J. 103 (1), 7-9 (2012).
  7. Fite, B. Z., et al. Noninvasive Multimodal Evaluation of Bioengineered Cartilage Constructs Combining Time-Resolved Fluorescence and Ultrasound Imaging. Tissue Eng Part C Methods. 17 (4), (2011).
  8. Kelly, D. J., et al. An automated multiwell plate reading FLIM microscope for live cell autofluorescence lifetime assays. J. Innov. Opt. Health Sci. 7 (5), 1-15 (2014).
  9. Owen, D. M., et al. Fluorescence lifetime imaging provides enhanced contrast when imaging the phase-sensitive dye di-4-ANEPPDHQ in model membranes and live cells. Biophys. J. 90 (11), 80-82 (2006).
  10. Suhling, K., et al. Imaging the environment of green fluorescent protein. Biophys. J. 83 (6), 3589-3595 (2002).
  11. Nezu, A., Tanimura, A., Morita, T., Shitara, A., Tojyo, Y. A novel fluorescent method employing the FRET-based biosensor "LIBRA" for the identification of ligands of the inositol 1,4,5-trisphosphate receptors. BBA-Gen Subjects. 1760 (8), 1274-1280 (2006).
  12. Nishioka, T., et al. Rapid Turnover Rate of Phosphoinositides at the Front of Migrating MDCK Cells. Mol. Biol. Cell. 19 (10), 4213-4223 (2008).
  13. Stockholm, D., et al. Imaging Calpain ProteaseActivity by Multiphoton FRET in Living Mice. J. Mol. Biol. 346 (1), 215-222 (2005).
  14. Miyawaki, A., et al. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388 (6645), http://www.nature.com/nature/journal/v388/n6645/full/388882a0.html 882-887 (1997).
  15. Mank, M., et al. FRET-Based Calcium Biosensor with Fast Signal Kinetics and High Fluorescence Change. Biophys. J. 90 (5), 1790-1796 (2006).
  16. Ueyama, H., Takagi, M., Takenaka, S. A novel potassium sensing in aqueous media by synthetic oligonucleotide derivative. Fluorescence resonance energy transfer associated with guanine quartet-potassium ion complex formation. J. Am. Chem. Soc. 124 (48), 14286-14287 (2002).
  17. Kuner, T., Augustine, G. J. A Genetically Encoded Ratiometric Indicator for Chloride: Capturing Chloride Transients in Cultured Hippocampal Neurons. Neuron. 27 (3), 447-459 (2000).
  18. Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. Imaging molecular interactions in living cells by FRET microscopy. Curr. Opin. Chem. Biol. 10 (5), 409-416 (2006).
  19. Gadella, T. W. J. Editor, FRET and FLIM Techniques, Volume 33. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology. , Elsevier. http://www.sciencedirect.com/science/bookseries/00757535 (2009).
  20. Ciruela, F. Fluorescence-based methods in the study of protein-protein interactions in living cells. Curr. Opin. Biotech. 19 (4), 338-343 (2008).
  21. Aoki, K., Kiyokawa, E., Nakamura, T., Matsuda, M. Visualization of growth signal transduction cascades in living cells with genetically encoded probes based on Förster resonance energy. Phil. Trans. R. Soc. B. 363 (1500), 2143-2151 (2008).
  22. Welch, C. M., Elliott, H., Danuser, G., Hahn, K. M. Imaging the coordination of multiple signalling activities in living cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (11), 749-756 (2011).
  23. Vogel, S. S., Thaler, C., Koushik, S. V. Fanciful FRET. Sci. Signal. 2006 (331), 2(2006).
  24. Hoppe, A., Christensen, K., Swanson, J. A. Fluorescence resonance energy transfer-based stoichiometry in living cells. Biophys. J. 83 (6), 3652-3664 (2002).
  25. Kumar, S., et al. FLIM FRET technology for drug discovery: automated multiwell plate high content analysis, multiplexed readouts and application in situ. ChemPhysChem. 12 (3), 627-633 (2011).
  26. Barber, P. R., et al. The Gray Institute "open" high-content, fluorescence lifetime microscopes. J. Microsc. 251 (2), 154-167 (2013).
  27. Matthews, D. R., et al. A high-content screening platform utilizing polarization anisotropy and FLIM microscopy. Proc. of SPIE. 6859, 1-12 (2008).
  28. Matthews, D. R., et al. A Multi-Functional Imaging Approach to High-Content Protein Interaction Screening. PLOS ONE. 7 (4), e33231(2012).
  29. Talbot, C. B., et al. High speed unsupervised fluorescence lifetime imaging confocal multiwell plate reader for high content analysis. J. Biophotonics. 1 (6), 514-521 (2008).
  30. Grant, D., et al. High speed optically sectioned fluorescence lifetime imaging permits study of live cell signaling events. Opt. Express. 15 (24), 15656-15673 (2007).
  31. Warren, S. C. Rapid global fitting of large fluorescence lifetime imaging microscopy datasets. PLOS ONE. 8 (8), e70687(2013).
  32. OpenMicroscopy.org. , Available from: http://www.openmicroscopy.org/site/products/omero (2016).
  33. Github.com. , Available from: https://github.com/imperial-photonics/openFLIM-HCA/wiki (2016).
  34. Edelstein, A. D., Tsuchida, M. A., Amodaj, N., Pinkard, H., Vale, R. D., Stuurman, N. Advanced methods of microscope control using μManager software. J. of Biol. Methods. 1 (2), 11(2014).
  35. Pelet, S., Previte, M., Laiho, L., So, P. A fast global fitting algorithm for fluorescence lifetime imaging microscopy based on image segmentation. Biophys J. 87 (4), 2807-2817 (2004).
  36. FLIMFit webpage. , Available from: http://www.flimfit.org (2016).
  37. Kristoffersen, A. S., Erga, S. R., Hamre, B., Frette, Ø Testing Fluorescence Lifetime Standards using Two-Photon Excitation and Time-Domain Instrumentation: Rhodamine B, Coumarin 6 and Lucifer Yellow. J. Fluoresc. 24 (4), 1015-1024 (2014).
  38. Koushik, S. V., Chen, H., Thaler, C., Puhl, H. L., Vogel, S. S. Cerulean, Venus, and VenusY67C FRET Reference Standards. Biophys. J. 91 (12), 99-101 (2006).
  39. Ono, A. HIV-1 assembly at the plasma membrane: Gag trafficking and localization. Future Virol. 4 (3), 241-257 (2009).
  40. Rizzo, M. A., Springer, G. H., Granada, B., Piston, D. W. An improved cyan fluorescent protein variant useful for FRET. Nat. Biotechnol. 22, 445-449 (2004).
  41. Koushik, S. V., Vogel, S. S. Energy migration alters the fluorescence lifetime of Cerulean: implications for fluorescence lifetime imaging Forster resonance energy transfer measurements. J. Biomed. Opt. 13 (3), 031204(2008).
  42. Goncalves, V., et al. A fluorescence-based assay for N-myristoyltransferase activity. Anal. Biochem. 421 (1), 342-344 (2012).
  43. Lindwasser, O. W., Resh, M. D. Myristoylation as a target for inhibiting HIV assembly: Unsaturated fatty acids block viral budding. PNAS. 99 (20), 13037-13042 (2002).
  44. Iversen, P. W., Eastwood, B. J., Sittampalma, G. S., Cox, K. L. A Comparison of Assay Performance Measures in Screening Assays: Signal Window, Z'Factor, and Assay Variability Ratio. J Biomol Screen. 11 (3), (2013).
  45. Alibhai, D. Fluorescence lifetime imaging applied to multiwell plate FRET assays for high content analysis. , Imperial College London. PhD thesis, https://spiral.imperial.ac.uk:8443/handle/10044/1/26843 (2013).
  46. Klarenbeek, J., Goedhart, J., van Batenburg, A., Groenewald, D., Jalink, K. Fourth-Generation Epac-Based FRET Sensors for cAMP Feature Exceptional Brightness, Photostability and Dynamic Range: Characterization of Dedicated Sensors for FLIM, for Ratiometry and with High Affinity. PLOS ONE. 10 (4), 0122513(2015).
  47. Martins, M., et al. Activity of phospholipase C epsilon contributes to chemotaxis of fibroblasts towards platelet-derived growth factor. J. Cell Sci. 125, 5758-5769 (2012).
  48. Github.com. , Available from: https://github.com/imperial-photonics/openFLIM-HCA/wiki/2-Hardware-reference (2016).
  49. McGinty, J., et al. Signal-to-noise characterization of time-gated intensifiers used for wide-field time-domain FLIM. J. Phys. D: Appl. Phys. 42, 135103(2009).
  50. Boens, N., et al. Fluorescence Lifetime Standards for Time and Frequency Domain Fluorescence Spectroscopy. ACS. 79 (5), 2137-2149 (2007).
  51. Esposito, A., Dohm, C. P., Bähr, M., Wouters, F. S. Unsupervised Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy for High Content and High Throughput Screening. Mol. Cell. Proteomics. 6 (8), 1446-1454 (2007).
  52. Grecco, H. E., et al. In situ analysis of tyrosine phosphorylation networks by FLIM on cell arrays. Nat Meth. 7 (6), 467-472 (2007).
  53. Alibhai, D., et al. Automated fluorescence lifetime imaging plate reader and its application to Förster resonant energy transfer readout of Gag protein aggregation. J. Biophotonics. 6 (5), 398-408 (2012).
  54. Kelly, D. J., et al. Automated multiwell fluorescence lifetime imaging for Főrster resonance energy transfer assays and high content analysis. Anal. Methods. 7 (10), 4071-4089 (2015).
  55. Poland, S. P., et al. A high speed multifocal multiphoton fluorescence lifetime imaging microscope for live-cell FRET imaging. Biomed. Opt. Exp. 6 (2), 277-296 (2015).
  56. Vogel, S. S., Nguyen, T. A., Van der Meer, B. W., Blank, P. S. The impact of heterogeneity and dark acceptor states on FRET: implications for using fluorescent protein donors and acceptors. PLOS ONE. 8 (1), e49593(2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Fluorescence Lifetime ImagingAutomated Multiwell PlateOpen Source SoftwareFRET BiosensorsProtein OligomerizationFLIM AnalysisInstrument Response FunctionReference Die DataFLIMfit SoftwareHIV Gag Protein

Related Articles