הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

דיסקציה של רקמות הזחל דג הזברה האשכים

10.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/55294

⸱

26 באפריל 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institutes of Brain Science, State Key Laboratory of Medical Neurobiology and Collaborative Innovation Center for Brain Science, Fudan University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד רקמת האשכים של דג הזברה הזחל, אשר יקל על חקירות של בידול מין דג הזברה ותחזוקה.

תקציר

למרות דג זברה פרא להחזיק מערכת ZZ / ZW מין להגדרה, דג זברה מבוית אבדה את כרומוזום המין. הם מנצלים מערכת קביעת הזוויג polygenic, שבו מספר גנים מופצים ברחבי הגנום קולקטיבי לקבוע את זהותם המין של דגים בודדים. נכון לעכשיו, את הגנים מעורבים בויסות התפתחות בלוטת מין וכיצד הם פועלים להישאר חמקמקים. בדרך כלל, לבודד רקמת אשכים הוא הצעד הראשון כדי לבחון את התהליכים ההתפתחותיים מין. כאן, אנו מציגים הליך לבודד רקמת אשכים מן 17 DPF (הפריה פוסט ימים) ו 25 DPF זחלי דג זברה. רקמת האשכים המבודדת עשויה להיבחן לאחר מכן על ידי פרופיל ביטוי מורפולוגיה גן.

מבוא

קובע המין הנשי המרכזי כרומוזום דג זברה פרא 4 אבד או שונה של דג הזברה המבויתת (זני מעבדה הנפוצים כלומר) 1. במקום זאת, יש להם מערכת קביעת הזוויג polygenic בליווי גורמים סביבתיים כגון טמפרטורה, היפוקסיה, זמינות המזון וצפיפות האוכלוסייה. המנגנונים המפורטים של התפתחות מין דג זברה אינם מובנים במלואם. שאלות יסוד כגון כאשר קביעת הזוויג דג זברה מתרחשת, מה אות קביעת המין העיקרית (ים) היא / הם, ואשר גנים להסדיר את הצעד הראשון של טרנספורמציה שַׁחֲלָה להישאר ייענה 2, 3.

בתהליך פיתוח מין דג זברה, בכמה שלבים חשובים הוכרו. בשלב מוקדם של הפיתוח, החל 4 hpf (הפריה פוסט שעות)-תאי נבט בראשיתי (PGCs) עוברים המפרט, הגירה אל הרכס גניטלישִׂגשׂוּג. מספרים PGC ואינטראקציות גומלין בין תאי הנבט תאים סומטיים חשובים בידול שַׁחֲלָה 4. בשעה 13 DPF (הפריה פוסט ימים), בלוטות המין נמצאים בשלב מובחן. עד 17 DPF, בלוטות המין להתפתח דו-פוטנציאל שחלות הן נקבות וזכרים בעתיד. המעבר תלוי-אפופטוזיס מן השחלה אל האשכים מתחילים בגיל 21 כדי 25 DPF ועשוי להימשך מספר שבועות. עד 35 DPF, המין של בלוטת המין נקבע וייצור תא מין ספציפי מין מתנהל בשני השחלות ואשכים 5, 6, 7.

נכון להיום, גנים ומנגנוני מועמד מגוונים של קביעת הזוויג הוצעו. פרוטאומיקה וניתוח transcriptomic הצליחו לבודד גנים רבים עם הביטוי דימורפית מינית גנים אלה נוצלו כדי ללמוד בידול מין דג הזברה 8, 9, 10. לדוגמה, ב דג הזברה הזחל, הגן cyp19a1a מתבטא במיוחד בשחלה אך לא את האשך 11, 12. בנוסף, גן AMH מתבטא בחולשה בתאי granulosa הזקיק בשחלה, אבל מאוד בתאי testis Sertoli 13. לעומת זאת, הגן ושה מתבטא באופן רציף בתאי הרבייה של שני דג הזברה הנשית והגברית, מה שהופך אותו סמן שַׁחֲלָה מתאים 14, 15.

חקירת רמות ביטוי הגנים האשכים הוא קריטי כדי להבין את המנגנון המולקולרי של קביעת הזוויג והבחנה במיוחד בשלב הדו-פוטנציאל השחלה 3, 9. עם זאת, גודלו הקטן של דג הזברה הזחל והאשכים קטנים בהתאמה לסבך את הבידוד של gonadal רקמות לניתוח מולקולרי נוסף. מחקרים קודמים השתמשו גזורים באזור תא מטען כולו בין opercula ואת הנקבוביות אנאליות 16. הכנה זו, למרות בלוטות מין המכיל, מורכבת של רקמות ואיברים מרובים. לחלופין, חיות טרנסגניות עם הביטוי GFP שַׁחֲלָה ספציפיים כגון ושה: EGFP שימשו לבידוד רקמת האשכים באמצעות תא מופעל הקרינה מיון (FACS) ו ללכוד לייזר דיסקציה מיקרו 17, 18. אבל היישום הנרחב שלהם מוגבל. כאן, אנו מתארים תהליך פשוט לבודד רקמת האשכים מן דג הזברה הזחל ב 17 DPF ו 25 DPF. אנחנו מדגימים את המיקום של בלוטות המין ביחס לאיברים אחרים ולבודד את בלוטות המין ללא פגע מורפולוגית הרקמות הסובבות. אנחנו מראים עוד את הגנים ספציפיים שַׁחֲלָה כגון ושה cyp19a1a מבוטאים מאוד בלוטות המין המבודדות לעומת רקמת תא המטען באמצעות PCR כמוני (ניתוח qPCR). הפרוטוקול הנוכחי מאפשר זיהוי, בידוד, טיהור RNA והגברה של גנים ספציפיים אשכים מן דג זברת זחל, ובכך מאפשר ניתוח מולקולרי הבא של רקמת אשכי 19.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

ניסויים הזברה אושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים אוניברסיטת פודאן ושימוש. זברה הועלתה וגדלה על פי נהלים קבועים 20.

1. הכנות

  1. טפחו 17 DPF ו 25 DPF דג הזברה הזחל
    1. העברה 2 זכרים ו 2 דג זברה מבוגר נקבה (בריאה, 3 עד 6 חודשים, זן מעבדת AB) ועד טנק המעבר בשעות אחר הצהריים המאוחרים לפני יום המעבר. להפריד בין זכרים לנקבות עם מחסום. למחרת בבוקר, לרענן את המים במיכל ולהסיר את המחסום כדי לאפשר להם להזדווג. אסוף ביצים 100 מ"מ פטרי מנות 1 עד 2 שעות לאחר ההפריה.
    2. שמור על 40 העוברים בתוך צלחת 100 מ"מ עם המדיום העובר 40 מ"ל (EM) ב 28.5 מעלות צלזיוס במהלך תקופת ההתפתחות המוקדמת (4 ימים) ולרענן את EM פעמיים ביום. עבר זחלי 1 טנקי L (40 זחלים למי מערכה 300 מיליליטר) ולהאכיל עם rotifers החי (אספקה ​​מלאה, פעמים ביום) לאחר 5 DPF.Feed ארטמיה חיה במקום דיאטה rotifer לאחר 10 DPF. מעבירים את הדג לתוך מערכת המים במחזור מחדש ב 14 DPF 21.
    3. תרים דג הזברה הזחל במערכת המים במחזור מחדש עד 17 DPF או 25 DPF. ודא מחזור אור / חושך הוא 14/10 h ו pH ערך של מים במערכת הוא על 7.2. מדדו את אורך הגוף של 17 DPF (5.5 כדי 6.8 מ"מ) ו 25 DPF (8 עד 11 מ"מ) זחלי 22.
  2. כן 2% צלחות אגרו לנתיחה.
    1. הוספת אגר 4 גרם ל 200 מ"ל מים סטריליים. מחממים את התערובת במיקרוגל עד שהוא הופך שקוף.
    2. מצנן את הפתרון אגר במשך כ 15 דקות, ואז לשפוך אותו לתוך 60 מנות מ"מ קוטר פטרי (כ 1/3 נפח של הצלחת). אחסן את הצלחות אגרו הקרושה ב 4 מעלות צלזיוס.

2. פרוטוקול 1: לנתח את רקמת האשכים של 17 ו 25 DPF זחלים

  1. להוסיף קרח כתוש לתוך הטנק כדי להרדים 17 זחלי DPF. העברתזחלים הרדימו עד 100 מ"מימ מקוררים צלחת פטרי עם 30 הפתרון של המ"ל הקר Ringer. שמור את הדגים וטופחו על ידי פתרון של מקורר Ringer עבור 15 דקות לפחות כדי להרדים את זחלי במלואה.
  2. מעבירים את הזחלים לצלחת אגר precooled בכפית פלסטיק קטנה. לצלול הגוף דג שלם 10 מ"ל מקורר בתמיסת רינגר בעדינות ולהניח אותה על צדה.
  3. לעשות את הפעולות הבאות מתחת לשדה הראייה של מיקרוסקופ סטריאו 25x. הצמד את תא המטען דגים עם פינצטה עבור ייצוב. תולשים את הבטן אורכית מפי הטבעת אל הלב עם זוג אחר של פינצטה. הסר בעדינות את העור והשרירים בצד אחד של הגוף על מנת לחשוף את האיברים הפנימיים.
  4. הסר את מסת איברי גחון בשלפוחית ​​השחייה בזהירות. למנוע נזק שַׁחֲלָה המצורפת בשלפוחית ​​השחייה.
  5. חותך את הקשר בין בשלפוחית ​​השחייה והגוף קדמי. משוך החוצה בשלפוחית ​​השחייה כולו רקמות האשכים בעדינות.
    הערה: ברוב המקרהים, רקמת האשכים ב 17 DPF מכיל לרקמות אפיתל protonephridium. הם אינם מופרדים בקלות זה מזה, אבל 25 DPF זה ניתן להפריד בקלות. אֶשֶׁך מחובר גם אל פי הטבעת. צומת עם אשך שמאל וימין מחוברים זה לזה על פי הטבעת תהיה גלויה בבירור.
  6. להשתמש בפינצטה כדי להפריד את רקמת האשכים בקפידה מתוך בשלפוחית ​​השחייה ולנקות את רקמות השומן שמסביב.
  7. מיד להעביר את רקמת האשכים מבודדת כדי צינור צנטריפוגות prechilled 1.5 מ"ל המכיל 200 הפתרון של μL Ringer. שמור את הצינור על קרח עד שכל רקמות האשכים מופרדות מן הזחלים.
  8. לנתח את בלוטות המין של 25 DPF זחלי כמתואר בשלבים 2.1 - 2.7.

3. פרוטוקול 2: לנתח ביטוי גנים של רקמות האשכים המבודדות

  1. חלץ RNA הכולל רקמות אשכי הזחל.
    1. העברת רקמות אשכים המבודדות עד 1 חדש RNase חינם.5 מ"ל צינור ולהסיר בתמיסת רינגר. להוסיף 100 פתרון תמס μL. וורטקס עד הרקמות הם lysed לחלוטין.
    2. בצע את הליך חילוץ RNA הכולל על פי הוראות היצרן.
    3. להוסיף 1/10 נפח DNase 10x ואני חיץ 1 μL של DNase אני לפתרון RNA ומערבבים בעדינות. דגירה של 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
    4. הוספת ריאגנט איון DNase 1/10 נפח לפתרון RNA. דגירה של 10 דקות ב 70 מעלות צלזיוס. מדדו את הריכוז של RNA הכולל באמצעות ספקטרופוטומטר. חנות ב -20 מעלות צלזיוס.
  2. בצע סינתזה cDNA הראשון גדיל
    1. השתמש אוליגו (DT) תחל -linker לבצע סינתזה cDNA הראשון גדיל בעקבות פרוטוקול של ייצור. להוסיף 1 עד 2 מיקרוגרם של RNA לנפח התגובה הכולל 20 μL.
    2. דגירת פתרון התגובה עבור 90 דקות ב 45 מעלות צלזיוס. לסיים את התגובה על ידי חימום על 70 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
    3. להוסיף 1 μL RNase H אל cDNA כךlution להסרת RNA שיורית. מערבבים בעדינות צנטריפוגות במשך 10 שניות על ~ 13,000 g x. דגירה של 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. להוסיף 20 μl מים חינם nuclease. חנות ב -70 מעלות צלזיוס.
  3. בצע פלורסנט PCR כמותי
    1. בצעו qPCR על מערכת Cycler עם צבע פלואורסצנטי. השתמש תנאי אופני PCR הבאים: 35 מחזורים ב 95 מעלות צלזיוס למשך 15 s, C ° TM-5 עבור 15 s, 68 מעלות צלזיוס למשך 30 s. השתמשו רצפים פריימר כדלקמן: AMH (FWD: GTGGATGGCAGCAGTACGAC; rev: GCGGAGAGGTGGAAGAGAGAATG), cyp19a1a (FWD: GTCCTGTTGTCTCCTACTGTCG; rev: CATTTGAGTTGAATATGATGCCCTG), nanos3 (FWD: GCTCGGTGTACGCCAAATCAACAT; rev: CCAAGTGAAAACACAACACCAGTGC), ושה (FWD: ATCGCATAGGAAGAACTGGACGCT; rev: CCAAGTGAAAACACAACACCAGTGC) ו β-אקטין (FWD: AGTGCGACGTGGACATCCGTA; rev: GCACTTCCTGTGGACGATGGA) 19.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

והניתוחים של בלוטות המין בוצעו על דג הזברה הזחל זן AB. איור 1 מציג רקמת האשכים טיפוסית של דג הזברה הזחל ב 17 DPF ו 25 DPF. ראשית, העור והשרירים של צד אחד של הבטן הוא חתכו לחשוף את האיברים הפנימיים. לאחר הסרת המסה של איברים פנימיים, בשלפוחית ​​השחייה יחד עם האשך להישאר בתא המטען. שַׁחֲלָה צורף בצד הגחון של שלפוחית השחייה (החץ באיור 1B '). בשעה 17 DPF, את בלוטת המין היה ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

דג הזברה הפכה מודל עוצמה והוא משמש באופן נרחב בפיתוח ומחקר הקשורות למחלה. השיטות לבידוד איברי דג זברה מבוגרת כגון מוח, לב, בלוטת מין, ו בכליות, תועדו היטב 23, 24, 25. בשל גודלו הקטן שיפוץ דינמי של הרקמות האשכים של דג הזברה הזחל, הבידוד של רקמת האשכים היא משימה מאתגרת. מחקרים קודמים השתמשו ברקמות גזע גזור כולו או ושה מהונדס: תא המבוססת EGFP מיון microdissection לייזר לבחון את בלוטות המין ה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

אנו מודים C ג'אנג לטיפול דגים. עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע הטבע של סין (31171074, 31371099 ו 31571067 כדי GP) ועל ידי פרויקט Talent ופאג'יאנג (09PJ1401900 כדי GP).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צלחת תרבית תאים 100 מ"מקורנינג430167לדגירת עוברים
20x EMעבור 1 ליטר נדרש: הוסף 17.5 גרם NaCl, 0.75 גרם KCl ו-2.9 גרם CaCl· 2H2O; לאחר מכן הוסף 0.41 גרם KH2PO4, 0.412 גרם Na2HPO4 נטול מים ו-4.9 גרם MgSO4· 7H2O.
1x EMדילול 20x EM במים מזוקקים
AGAROSE G-10Gene121985להכנת צלחות אגר 2%
Trizol ReagentInvitrogen15596-026לבידוד RNA
מד זכוכיתשן בו250 מ"ללהכנת צלחות אגר 2%
תנור מיקרוגלMidea M1-211Aלחימום האגר
פינצטה DUMONT#5INOXמכשיר דיוק עולמי500341לדיסקציה
סטריאומיקרוסקופמוטיקSMZ168לדיסקציה
ציוד מים טהוריםMillipore
Ringer' תמיסהל-1 ליטר נדרש: יש להוסיף 6.78 גרם NaCl, 0.22 גרם KCl, 0.26 גרם CaCl2 ו-1.19 גרם Hepes; ואז למלא ל-1 ליטר; התאם את ה-pH ל-7.2. יש לעקר על ידי סינון ולשמור במיכל פוליקרבונט שקוף שעבר חיטוי.
העברת פיפטהSamco202, 204
אמבט מתכתQiLinbeierדגם GL-150
מיקרוסקופLeica M205 FAפוטומיקרוגרף
Eppendorf5417R
ערכת בידוד RNA בקנה מידה מיקרואמביוןAM1931לבידוד RNA מרקמות בלוטת המין
Dnase ISigmaAMPD1-1KTלעיכול DNA בתמיסת RNA
RevertAid ערכת סינתזת cDNA גדיל ראשוןThermo Scientific#K1631לסינתזת cDNA גדיל ראשון
Rnase HThermo Scientific#EN0202לעיכול שאריות ה-RNA בתמיסת ה-cDNA.
SYBR Green Realtime PCR Master MixTOYOBOQPK-201מוצר זה הוא תערובת מאסטר 2x מבוססת Taq DNA פולימראז עבור PCR בזמן אמת ו  ישים לבדיקת אינטרקלציה עם SYBR Green I.
ספקטרופוטומטרNe DropOD-2000 +מדידת הריכוז של פרופיל ביטוי הגנים הכולל של RNA
MastercyclerEppendorfAG 22331 Hamburg
לצנטריפוגה

מקורות

  1. Wilson, C. A., et al. Wild sex in zebrafish: loss of the natural sex determinant in domesticated strains. Genetics. 198 (3), 1291-1308 (2014).
  2. Liew, W. C., Orban, L. Zebrafish sex: a complicated affair. Genomics. 13 (2), 172-187 (2014).
  3. Orban, L., Sreenivasan, R., Olsson, P. Long and winding roads: Testis differentiation in zebrafish. Mol. Cell. Endocrinol. 312 (1-2), 35-41 (2009).
  4. Blaser, H., et al. Transition from non-motile behaviour to directed migration during early PGC development in zebrafish. J. Cell Sci. 118, 4027-4038 (2005).
  5. Wang, X. G., Orban, L. Anti-Müllerian hormone and 11 β-hydroxylase show reciprocal expression to that of aromatase in the transforming gonad of zebrafish males. Dev. Dynam. 236 (5), 1329-1338 (2007).
  6. Siegfried, K. R., Nüsslein-Volhard, C. Germ line control of female sex determination in zebrafish. Dev. Biol. 324 (2), 277-287 (2008).
  7. Uchida, D., Yamashita, M., Kitano, T., Iguchi, T. Oocyte apoptosis during the transition from ovary-like tissue to testes during sex differentiation of juvenile zebrafish. J. Exp. Biol. 205 (Pt 6), 711-718 (2002).
  8. Groh, K. J., Schönenberger, R., Eggen, R. I. L., Segner, H., Suter, M. J. F. Analysis of protein expression in zebrafish during gonad differentiation by targeted proteomics. Gen. Comp. Endocr. 193, 210-220 (2013).
  9. Siegfried, K. R. In search of determinants: gene expression during gonadal sex differentiation. J. Fish Biol. 76 (8), 1879-1902 (2010).
  10. Small, C. M., Carney, G. E., Mo, Q., Vannucci, M., Jones, A. G. A microarray analysis of sex- and gonad-biased gene expression in the zebrafish: evidence for masculinization of the transcriptome. BMC Genomics. 10, 579(2009).
  11. Chiang, E. F., Yan, Y. L., Guiguen, Y., Postlethwait, J., Chung, B. Two Cyp19 (P450 aromatase) genes on duplicated zebrafish chromosomes are expressed in ovary or brain. Mol. Biol. Evol. 18 (4), 542-550 (2001).
  12. Kishida, M., Callard, G. V. Distinct cytochrome P450 aromatase isoforms in zebrafish (Danio rerio) brain and ovary are differentially programmed and estrogen regulated during early development. Endocrinology. 142 (2), 740-750 (2001).
  13. Rodríguez-Marí, A., et al. Characterization and expression pattern of zebrafish anti-Müllerian hormone (amh) relative to sox9a, sox9b, and cyp19a1a, during gonad development. Gene Expr.Patterns. 5 (5), 655-667 (2005).
  14. Krovel, A. V., Olsen, L. C. Expression of a vas::EGFP transgene in primordial germ cells of the zebrafish. Mech Dev. 116 (1-2), 141-150 (2002).
  15. Krovel, A. V., Olsen, L. C. Sexual dimorphic expression pattern of a splice variant of zebrafish vasa during gonadal development. Dev. Biol. 271 (1), 190-197 (2004).
  16. Tzung, K. W., et al. Early depletion of primordial germ cells in zebrafish promotes testis formation. Stem Cell Reports. 4 (1), 61-73 (2015).
  17. Hsiao, C., Tsai, H. Transgenic zebrafish with fluorescent germ cell: a useful tool to visualize germ cell proliferation and juvenile hermaphroditism in vivo. Dev. Biol. 262 (2), 313-323 (2003).
  18. Jorgensen, A., Nielsen, J. E., Morthorst, J. E., Bjerregaard, P., Leffers, H. Laser capture microdissection of gonads from juvenile zebrafish. Reprod Biol Endocrinol. 7, 97(2009).
  19. Chen, S., Zhang, H., Wang, F., Zhang, W., Peng, G. nr0b1 (DAX1) mutation in zebrafish causes female-to-male sex reversal through abnormal gonadal proliferation and differentiation. Mol. Cell. Endocrinol. 433, 105-116 (2016).
  20. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for The Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , Eugene: University of Oregon Press. University of Oregon. (2000).
  21. Liew, W. C., et al. Polygenic sex determination system in zebrafish. PLoS One. 7 (4), e34397(2012).
  22. Parichy, D. M., Elizondo, M. R., Mills, M. G., Gordon, T. N., Engeszer, R. E. Normal table of postembryonic zebrafish development: staging by externally visible anatomy of the living fish. Dev Dyn. 238 (12), 2975-3015 (2009).
  23. Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of Organs from the Adult Zebrafish. J. Vis Exp. (37), (2010).
  24. Arnaout, R., Reischauer, S., Stainier, D. Y. R. Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications. J. Vis Exp. (94), (2014).
  25. Gerlach, G. F., Schrader, L. N., Wingert, R. A. Dissection of the Adult Zebrafish Kidney. J. Vis Exp. (54), (2011).
  26. Yoon, C., Kawakami, K., Hopkins, N. Zebrafish vasa homologue RNA is localized to the cleavage planes of 2- and 4-cell-stage embryos and is expressed in the primordial germ cells. Development. 124 (16), 3157-3165 (1997).
  27. Braat, A. K., Speksnijder, J. E., Zivkovic, D. Germ line development in fishes. Int. J. Dev. Biol. 43 (7), 745-760 (1999).
  28. Huang, H. Y., Ketting, R. F. Isolation of zebrafish gonads for RNA isolation. Methods Mol Biol. 1093, 183-194 (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

RNAQPCR
דיסקציה של רקמות הזחל דג הזברה האשכים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.