מאמר שיטה

סינתזה של ביולוגית Liquid Crystal אלסטומר קצף כמו פיגומים Cell עבור תא תרבויות מרחבי 3D

DOI:

10.3791/55452

⸱

11 באפריל 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Liquid Crystal Institute, Kent State University, 2Chemical Physics Interdisciplinary Program, Liquid Crystal Institute, Kent State University, 3Department of Biological Sciences, Kent State University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה מציג מתודולוגיה להכין 3D, מתכלים, פיגומי תא דמוי קצף המבוססים על אלסטומרים גביש נוזלי ביולוגיים בצד שרשרת (LCEs). ניסויי מיקרוסקופיה Confocal מראים כי LCEs דמוי קצף לאפשר התקשרות תא, התפשטות, ואת היישור הספונטני של myoblasts C2C12s.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים צעד-אחר-צעד בהכנת פיגום תא 3D, מתכלה, כמו קצף. פיגומים אלה הוכנו על ידי גוש כוכב cross-linking שיתוף פולימרים שמציעות יחידות כולסטרול כמו קבוצה צדדית צד-שרשרת, וכתוצאה מכך-A smectic (SMA) אלסטומרים גביש נוזלי (LCEs). קצף דמוי פיגומים, שהוכנו באמצעות תבניות מתכת, וכוללים microchannels ביניהם, מה שהופך אותם למתאימים כמו פיגומי תרבית תאי 3D. המאפיינים המשותפים של המבנה הרגיל של קצף המתכת של תוצאת אלסטומר ב פיגום תא 3D מקדם לא רק התפשטות תאים גבוהה בהשוואה לסרטי templated הקונבנציונליים נקבוביים, אלא גם לניהול טוב יותר של תחבורה המונית (כלומר, מזינים, גזים, פסולת , וכו '). האופי של תבנית המתכת מאפשר מניפולציה הקלה של צורות קצף (כלומר, לחמניות או סרטים) ועל הכנת הפיגומים בגדלים נקבוביים שונים ללימודי תאים שונים תוך שמירה על interconnecטבע נקבובי טד מהתבנית. תהליך התחריט אינו משפיע על הכימיה של אלסטומרים, שימור הטבע הביולוגי מתכלה שלהם. אנו מראים כי LCEs smectic אלה, כאשר גדלו במשך תקופות זמן נרחבות, לאפשר לימוד בונת רקמות רלוונטית ומורכבת קליניים תוך קידום הצמיחה וההתפשטות של תאי.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ישנן מספר דוגמאות של חומרים סינטטיים ביולוגיים ביולוגיים מיועדים ליישום במחקרי תא לשחזור רקמות המכוונים מצורף תא התפשטות 1, 2, 3, 4, 5. היו כמה דוגמאות של חומרים ביולוגיים, המכונים אלסטומרים גביש נוזליים (LCEs), שיכול להגיב לגירויים חיצוניים עם אנאיזוטרופיות מולקולרי מזמין 6, 7. LCEs הם חומרי גירויים-היענות המשלבים את התכונות המכאניות אלסטי של אלסטומרים עם פונקציונליות האופטית והזמנה מולקולרית של גבישים נוזליים 8, 9. LCEs יכול לחוות שינויים בכושר, עיוות מכאנית, התנהגות אלסטית, ואת תכונות אופטיות בתגובת Stim החיצוניUli (כלומר., חום, מתח, אור, וכו ') 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16. מחקרים קודמים הראו כי גבישים נוזליים (LCS) יכולים לחוש את הצמיחה ואת הנטייה של תאים 4, 17. יתכן ואז להניח LCEs עשוי להיות מתאים ליישומים ביולוגיים רפואיים רלוונטיים, כוללים תא פיגומים ויישור. דיווחנו בעבר בהכנת הסרטים ביולוגי, מתכלה, יצוק יצוק, ורזה LCEs smectic שמציעה "סוג שוויצרי-גבינה" מורפולוגיה נקבובית 6, 18. גם הכנו LCEs הביולוגית Nematic עם מורפולוגיה כדורית כמו פיגומי צמיחת תאים 19 , 20. העבודה שלנו נועדה כוונון התכונות המכאניות של חומרים כדי להתאים לאל של הרקמה של עניין 21. כמו כן, מחקרים אלה מתמקדים בהבנת אינטראקציות תא אלסטומר, כמו גם תגובה תאית כאשר אלסטומרים כפופים גירויים חיצוניים.

האתגרים העיקריים היו בחלקם להתאים את נקבוביות של LCEs כדי לאפשר התקשרות תא חלחול דרך המטריצה ​​אלסטומר ועבור להסעת המונים יותר. הנקבובי של שכבות דקות אלה 6 מותר חלחול תא דרך הארי של מטריקס, אבל לא כל הנקבוביות היו מחוברות באופן מלא או היה גודל הנקבוביות קבוע יותר (הומוגנית). אז דיווחנו לאלסטומרים LCE Nematic הביולוגיים עם מורפולוגיות כדוריות. אלסטומרים Nematic אלה שאפשרו את הקובץ המצורף ושגשוגם של תאים, אך הגודל הנקבובי נע רק 10-30 מיקרומטר, אשר מנע או הגבילו את השימוש הללואלסטומרים עם מגוון רחב יותר של שורות תאים 19, 20.

עבודות קודמות של ואח קונג. בנוגע להיווצרות קצף גרפן באמצעות תבנית מתכת "הקרבה" הראה כי קצף גרפן שהיה מתקבל אילו מורפולוגיה נקבובית סדירה מאוד מוכתבת על ידי תבנית המתכת נבחרה 22. מתודולוגיה זו מציעה שליטה מלאה על גודל הנקבובי הנקבובי. במקביל, הסגילות וגמישות של תבנית מתכת לאפשר היווצרות של תבנית שונה המעצב לפני הכנת קצף. טכניקות אחרות, כגון שטיפת חומר 23, בניית תבנית גז 24, או סיבים סובבים אלקטרו 25, 26 מציעות גם הפוטנציאל להכנת חומרים נקבוביים, אבל הם יותר זמן רב, במקרים מסוימים, את הגודל הנקבובי מוגבל רק כמה מיקרומטרים. קֶצֶף-כמו LCEs 3D מוכן באמצעות תבניות מתכת לאפשר עומס תא גבוה; שיעור התפשטות משופר; שיתוף culturing; ו, ואחרון אחרון חביב, ניהול תחבורה המונית טוב יותר (כלומר, מזינים, גזים, ופסולת) כדי להבטיח התפתחות מלאה רקמות 27. קצף דמוי LCEs 3D להופיע גם לשפר יישור התא; זהו ככל הנראה ביחס תליוני LC חישת צמיחת תאים וכיוון תא. הנוכחות של moieties LC בתוך LCE מופיע כדי לשפר יישור התא ביחס למיקום התא בתוך הפיגום LCE. תאים ליישר בתוך תמוכות של LCE, בעוד שום אוריינטציה ברורה שנצפה בהם תמוכות להצטרף יחד (צמתים) 27.

בסך הכל, פלטפורמת פיגום תא LCE שלנו כמדיום תמיכת תא מציעה הזדמנויות לכוון את מורפולוגיה אלסטומר ואת תכונות אלסטיות כדי במיוחד לכוון את היישור (בודדים) סוגי תאים ליצור הורה, סידורים מרחביים oF תא דומה למערכות חיים. מלבד מתן פיגום מסוגל לתמוך ולכוון לצמיחת תרבות תאים לטווח ארוך, LCEs גם לבצע ניסיונות דינמיים, שבו נטייה ואינטראקציות תא ניתן לשנות על לטוס.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: השלבים הבאים להכנת קצף דמוי LCE 3D באמצעות קופולימר לחסום כוכב 3-זרוע מוצגות באיור 1. עבור תהודה מגנטית גרעינית (NMR) אפיון, ספקטרה נרשמות כלורופורם deuterated (CDCl 3) בטמפרטורת החדר על מכשיר ברוקר DMX 400-MHz ו פנימי הפניה פסגות שיורי ב 7.26. התמר ספקטרום אינפרא אדום (FT-IR) נרשמים באמצעות ספקטרומטר Bruker וקטור 33 FT-IR באמצעות מצב החזרה הכולל מוחלש. לכל שלב של הפרוטוקול הבא, חשוב ללבוש ביגוד מגן אישי מתאים (PPE).

1. סינתזה של α-כלורו-ε-caprolactone (מונומר) (על פי נוהל באל ז'רום et. 28)

  1. לפני תחילת הסינתזה, לטהר 27 גרם של חומצה 3-chloroperbenzoic כדלקמן:
    1. בשנת 800 מ"ל של מים מזוקקים, להוסיף 1.28 גרם של נתרןמונוהידראט monobasic פוספט ו 8.24 גרם של heptahydrate dibasic פוספט נתרן. התאם את ה- pH 7.4 (באמצעות נתרן הידרוקסידי או חומצה הידרוכלורית) ושמור 30 מיליליטר של פתרון זה; זהו פתרון החיץ.
    2. באמצעות משפך separatory, לפזר חומצה 3-chloroperbenzoic ב 35 מ"ל של אתר diethyl. לשטוף את הפתרון אורגני עם 10 מ"ל של תמיסת חיץ (מוכן בשלב 1.1.1.). חזור על לשטוף שלוש פעמים.
    3. להוסיף 3 גרם של נתרן גופרתי ישירות הפתרון האורגני; סוכן ייבוש זה סופג מים מן הפתרון האורגני.
    4. סנן הפתרון להסיר את סוכן ייבוש. תתרכז התסנין בלחץ מופחת באמצעות מאייד סיבובי ב 850 mbar ו 40 מעלות צלזיוס.
  2. Solubilize 18.5 גרם של חומצה 3-chloroperbenzoic מטוהרים ב 150 מ"ל של dichloromethane יבש ידי ערבוב באמבטיה קולי; תהליך זה בדרך כלל לוקח 20 דקות. מניח את הפתרון בתוך משפך separatory.
  3. בתוך בקבוק שני-צוואר, מסביב לתחתית,להתמוסס 13.1 גרם של 2-chlorocyclohexanone ב 15 מ"ל של dichloromethane יבש באמצעות בוחש מגנטי תחת גז חנקן. שמור בחישה.
  4. התאימו את המשפך separatory המכיל פתרון חומצה 3-chloroperbenzoic (משלב 1.2) על הבקבוק שני-צוואר בשלב 1.3. לרוקן את המערכת עם גז חנקן. התאם את הפתיחה של משפך separatory כך שפתרון חומצת chloroperbenzoic נופל dropwise לתוך פתרון 2-chlorocyclohexanone (1 טיפה בכל שנייה אחרת) וממשיך לבחוש את התערובת תחת גז חנקן עבור 96 h.
  5. מצננים את תערובת התגובה ל- C ° -20 עבור 1 h כדי לזרז את חומצת מ -chlorobenzoic תוצר לוואי (מ -CBA).
  6. סנן את החומצה מ -chlorobenzoic (-CBA מ ') ולשטוף את הפתרון נותר עם פתרונות רוויים של נתרן תיוסולפט, סודיום ביקרבונט, ומלח.
  7. הסר את הממס בלחץ מופחת באמצעות מאייד סיבובי ב 850 mbar ו 40 מעלות צלזיוס. לטהר את לסבון נוזלי צהוב, צמיג חיוורid ידי זיקוק בלחץ מופחת ב 2.3 Torr ו 96 מעלות צלזיוס.
  8. מעקב אחר הצליחו הסינתזה באמצעות פסגות 1 H NMR הבא. 1 H NMR (400 MHz, 3 CDCl, [ppm] δ): 4.75-4.68 (מ ', 1H, C H ClCO), 4.37-4.26 (מ', 1H, C H 2 O), 4.18-4.05 (מ ', 1H , O C H 2), ו 2.06-1.58 (מ ', 6 שעות, -C H 2 -) 6, 27.

2. סינתזה של α-שלושה זרוע קופולימר בלוק סטאר (SBC-αCl) על ידי copolymerization פתיחה רינג (שארמה et al. 6 ו Amsden et al. 29)

  1. לפני הסינתזה, silanize כמוסת 20 מ"ל במילויו פתרון 2% (v / v) של 1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyltriethoxysilane ב טולואן ערבוב במשך כ 24 שעות. לשטוף עם אלכוהול איזופרופיל ולייבש אותו על ידי הצבתו בתנור על 140 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  2. להוסיף 30.64 גרם של ε-caprolactone מזוקקים, 0.5 גרם של α-כלורו-ε-caprolactone, ו 0.25 מ"ל של גליצרול כדי אמפולה. מערבבים בעזרת מערבולת עבור 1 דקות.
  3. מוסיפים 4.90 גרם של D, L -lactide אל אמפולה ולטהר אותו עם חנקן. מניחים את אמפולה בתנור על 120 מעלות צלזיוס כדי להמיס את -lactide D, L; תהליך זה בדרך כלל לוקח בערך 2 h. מערבבים שוב בעזרת מערבולת לוודא שכל התוכן הם גם מעורבים ולהוסיף 66 μL של פח (II) 2-ethylhexanoate (SN (אוקטובר) 2) אל אמפולה.
    הערה: D, L -lactide יהיה להתקרר במהלך תהליך זה יהיה צורך מחדש מחומם בתנור להינמס.
  4. בתוקף לערבב בפעם האחרונה באמצעות מערבולת ולשטוף עם חנקן.
  5. סגור את אמפולה עם פקק גומי. מניח מחט המחוברת צינור ואקום (ריק הבית הוא בדרך כלל מספיק) באמצעות פקק הגומי. הפעילו את הוואקום, באמצעות להבה, להמיס את הצוואר הארוך של הזכוכית, מסובב לאט עד gנַעֲרָה מתמוטטת על עצמו. היזהר שלא להמיס את פקק גומי. לאחר אמפולה היא להבה-אטום, ולמקם אותו באמבט חול, תנור, או גוף חימום מתאים ב 140 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות.
  6. קח את אמפולה ולתת לו להתקרר בטמפרטורת החדר.
  7. לשבור את האמפולה על הסימן האטום ו לפזר את הנוזל צמיג מאוד על ידי הוספת 10 מיליליטר של dichloromethane. עבר פתרון משפך separatory.
  8. הכן בקבוק המכיל 100 מ"ל של מתנול קר (מקורר באמצעות אמבטיית קרח יבש / אצטון בטמפרטורה סביב -78 ° C). תקן את המשפך separatory (שלב 2.7) על גבי הבקבוק. התאם את הפתיחה של משפך separatory כך כשתי טיפות נופלות כל (dropwise) השני אחר.
  9. אסוף את המשקע הלבן על ידי סינון (באמצעות מסנן נייר) ומייבשים אותו בתנור ואקום בין C 50 ו 60 מעלות.
  10. מעקב אחר הצלחת סינתזה באמצעות פסגות 1 H NMR ו- FT-IR הבאים. 1 H NMR (400 MHz, CDCl 3, [Ppm] δ): 5.29-5.03 (מ ', COC H C H 3), 4.43-4.25 (מ', ג H Cl), 4.24-4.12 (m, O C H 2), 4.11-4.03 (t, J = 4.6 הרץ, C H 2 O), 3.80-3.68 (מ ', ג H C H 2), 3.09-2.64 (רחבה, s, O H), 2.39 (t, J = 4.5 הרץ, H α-), 2.33 (t, J = 5.1 הרץ, H α-), ו 1.77-1.25 (מ ', ג H 2, C H 3); FT-IR (1 / λ [ס"מ -1]): 2932 (ים), 2869 (מ '), 1741 (ים), 961 (ים), 866, ו 735 (מ') 6, 27.
    הערה: כדי להכין LCE 3D הידרופילי יותר, להכין קופולימר גוש ליניארי (LBC) במקום SBC, בעקבות copolymerization פתיחת הטבעת (ROP) ההליך המתואר לעיל.
    1. להוסיף 0.3 גרם של פוליאתילן גליקול (PEG), 3.15 גרם ε-caprolactone, 1.0 גרם של α-כלורו-ε-caprolactone, ו 5.0 גרם של D, L-lactide לתערובת בקבוקון silanized.

3. שינוי סינטטי של α-Cl-שלוש זרועות SBC כדי αN 3 -Three זרוע SBC (SBC-αN 3) (על פי שתרמה et al. 6)

  1. בבקבוק מסביב לתחתית ותחת חנקן, לפזר 5 גרם של SBC-αCl ב 30 מ"ל של יבש N, -dimethylformamide "N.
  2. מוסיפים 0.22 גרם של אזיד הנתרן ולאפשר להגיב הלילה בטמפרטורת החדר.
    זהירות: אזיד הנתרן הוא רעיל; ללבוש ביגוד מגן אישי מתאים (PPE).
  3. הסר את N, -dimethylformamide "N בלחץ מופחת באמצעות מאייד סיבובי ב 11 mbar ו 40 מעלות צלזיוס. ממיסים את תערובת ב 30 מ"ל של טולואן. צנטריפוגה הפתרון שלוש פעמים ב 2800 XG במשך 15 דקות כדי להסיר את המלח יצר. לאדות את טולואן בלחץ מופחת באמצעות מאייד סיבובי ב 77 mbar ו 40 מעלות צלזיוס.
  4. לעקוב אחר הצלחת ההחלפה תזיד באמצעות 1 H NMR ופסגות FT-IR.
    הערה: 1 ספקטרום NMR H היה דומה להורה SBC-αCl, למעט ההופעה לשיא ב 3.90 ppm הקשורים לקבוצה תזיד; FT-IR (1 / λ [ס"מ -1]): 2928, 2108 (ים, אזיד), 1754 (ים), 1450 (ים), 960 (מ '), 865 (ים), 733 (s), ו 696 (M).

4. סינתזה של cholesteryl 5-Hexynoate (LC מחצית) (על פי שארמה et al. 6 ו דונלדסון et al. 30)

  1. בבקבוק מסביב לתחתית, לערבב 3 גרם של חומצה 5-hexynoic ו 130 מ"ל של dichloromethane. מצננים 0 ° C באמצעות אמבט קרח.
  2. בעוד בקבוק מסביב לתחתית, לערבב 8.28 גרם של N, -dicyclohexylcarbodiimide "N, 10.3 גרם של כולסטרול, ו 0.2 גרם של 4-dimethylaminopyridine.
  3. העברת dropwise פתרון חומצה 5-hexynoic הבקבוק המכיל את תערובת הכולסטרול ולשמור את התערובת הסופית על 0 מעלות צלזיוס למשך 1 שעה.
  4. אפשר לתערובת להתחמם לטמפרטורת החדר למשך הלילה.
  5. הסר את משקע dicyclohexylurea וכתוצאה ידי סינון באמצעות מסנן נייר כיתת 415 וזורק אותו.
  6. תתרכז התסנין בלחץ מופחת באמצעות מאייד סיבובי ב 850 mbar ו 40 מעלות צלזיוס. ממיסים את שאריות שנאספו 150 מ"ל של הקסאן.
  7. לאדות את הממס בלחץ מופחת באמצעות מאייד סיבובי ב 335 mbar ו 40 מעלות צלזיוס. מוסיפים 350 מ"ל של אתנול שאריות שמן כדי לאסוף את המוצר הסופי. שטוף את יצר מחוץ לבן מוצק עם אתנול ולייבש המוצר המוצק תחת ואקום ב 50 מעלות צלזיוס.
  8. צג את הסינתזה באמצעות פסגות 1 H NMR ו- FT-IR הבאים. 1 H NMR (400 MHz, 3 CDCl, [ppm] δ): 5.39 (ד, י = הרץ 4.7, 1H, C H = C), 4.70-4.58 (מ ', 1H, C H OCO), 2.44 (t, J = 2.5 הרץ, 2H, C H 2 CO), 2.34 (מ ', 2H, C H 2 -C H =), 2.31 (מ', 2H, C H 2 C H 2 -COO), 2.28 (ים, 1H, HC≡C), 2.27 (ד, י = 2.3 הרץ, 2H, ≡CC H 2), 2.07-1.06 (מ ', 2H, 2 C H, C H), 0.94 (ים, 3H, C H 3), 0.89 (ד, י = 1.8 הרץ, 3H, C H 3 C H), ו 0.88 (ד, י = 1.8 הרץ, 6H, C H 3 -C H), 0.67 (ים, 3H, C H 3). FT-IR (1 / λ [ס"מ -1]): 2,830-2,990 (רחבה השיא חזק), 2104 (מ '), 1695 (ים), 1428 (מ'), 1135 (מ '), 999 (ים), 798 (ים), ו 667 (ים).

5. שינוי סינטטי של α-N 3 SBC זרוע -Three כדי אלפא-cholesteryl-שלוש זרועות SBC (SBC-αCLC) באמצעות תגובה תזיד-אלקין Huisgen סקל-כן ( "לחץ" תגובה) כדי להשיג SBC-צ'ול (פי שארמה et al. 6)

  1. בבקבוק מסביב לתחתית, לפזר 1 שווה טוחנת של 3 SBC-αN (1.5 גרם) ב 100 מ"ל של tetrahydrofuran מזוקקים טרי (THF). להוסיף 1.2 equivalen טוחנתt של cholesteryl 5-hexynoate (1.94 גר '), 0.1 שווה ערך טוחן של הנחושת (I) יודיד (0.06 גרם), ו 0.1 מקבילה טוחנת של triethylamine (0.03 גר'). מערבבים את התערובת לילה בשעה 35 ° C תחת חנקן.
  2. לאדות את הממס בלחץ מופחת באמצעות מאייד סיבובי ב 357 mbar ו 40 מעלות צלזיוס.
  3. ממיסים את תערובת שיורית 80 מ"ל של dichloromethane צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 2800 XG בטמפרטורת החדר כדי להסיר חומרים unreacted ומוצרי לוואי.
  4. צג את הסינתזה באמצעות פסגות 1 H NMR ו- FT-IR הבאים. 1 H NMR (400 MHz, 3 CDCl, [ppm] δ): 7.54 (ים, CH = C-triazole), 5.43-5.34 (מ ', כולסטרול C = CH), 5.10-5.06 (מ', COCHCH 3), 4.68 -4.55 (m, O-CH כולסטרול), 4.24-4.19 (מ ', CH 2 O), 4.18-4.13 (t, J = 5.0 הרץ, CH 2 O), 4.11-4.05 (t, J = 4.4 הרץ, CH 2 O), 2.47-2.41 (t, J = 4.9 הרץ, COCH 2), 2.31-2.25 (מ ', COCH 2), 2.07-1.02 (מ', CH 2 , CH 3), 1.05-1.03 (ים, 2 CH, CH 3), 0.96-0.92 (ד, י = 3.3 הרץ, 2 CH, CH 3), 0.91-0.87 (dd, J = 1.9 הרץ, J = 1.8 הרץ, CH 3), ו 0.71-0.68 (ים, CH 3). FT-IR (1 / λ [ס"מ -1]): 3260 (ים), 2920 (ים), 1710 (ים), 1460 (ים), 1370 (ים), 1240 (מ '), 1190 (ים), 733 (ים), ו 668 (ים).

6. סינתזה של 2,2-Bis (1-caprolactone-4-י.ל) פרופאן (crosslinker, BCP) (על פי גאו et al. 27 ו Albertsson et al. 31)

  1. בבקבוק מסביב לתחתית, להכין תמיסה המכילה 10.8 גרם של 2-BIS (4-הידרוקסי-cyclohexyl) פרופן 52 מ"ל של חומצה אצטית.
  2. הכן תמיסה המכילה 11 גרם של trioxide כרום ב 50 מ"ל של חומצה אצטית ו 8 מ"ל של מים מזוקקים. הוספת dropwise פתרון זה הפתרון מוכן בשלב 6.1, תוך שמירה על טמפרטורת התערובת בין 17 לבין 20 ° C (למשל, בתוךאמבטיית מים); תהליך dropwise זה לוקח 2 h. לאחר השלמת התהליך, ולאפשר הפתרון ומערבבים במשך כ 30 דקות.
  3. להוסיף 50 מ"ל של 2-פרופנול. מערבבים את הפתרון הלילה בטמפרטורת החדר.
  4. תתרכז הפתרון הסגול הכהה בלחץ מופחת באמצעות מאייד סיבובי ב 137 mbar ו 40 מעלות צלזיוס. מוסיפים 300 מ"ל מים מזוקקים כדי לזרז; המשקע צריך להיות אור סגול.
  5. תסנין המוצר הגולמי באמצעות מסנן נייר כיתת 415. לשטוף את החומר המוצק עם ~ 250 מ"ל של מים מזוקקים או עד מוצק הופך לבן.
  6. ממיסים את החומר המוצק ב 15 מ"ל של בנזן על 40 ° C ולתת לו recrystallize ב 25 מעלות צלזיוס.
  7. מוסיפים 8.34 גרם של יבש diketone מומס dichloromethane יבש בתמיסה המכילה 6.0 גרם של חומצה 3-chloroperbenzoic ב 75 מ"ל של dichloromethane אל הבקבוק.
  8. ריפלוקס הפתרון ב 40 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
  9. מצננים את התערובת התגובה -20 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי לזרז את מ ' תוצר לוואי חומצת -chlorobenzoic.
  10. הסר חומצה מ -chlorobenzoic ידי סינון (באמצעות מסנן נייר) ולרכז הפתרון בלחץ מופחת.
  11. לשטוף את המוצר הגולמי ויסקוזה עם 200 מ"ל של 2-heptanone ולייבש המשקע תחת ואקום ב 50 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  12. צג את הסינתזה באמצעות פסגות 1 H NMR ו- FT-IR הבאים. 1 H NMR (400 MHz, 3 CDCl, [ppm] δ): 4.42-4.37 (dd, J = 14.2, 7.4 הרץ, 2H, C H 2 OC = O), 4.21-4.15 (t, 2H, J = 11.3 הרץ, C H 2 OC = O), 2.80-2.75 (DDT, J = 14.3, 6.5, 1.6 הרץ, 2H, COO C H 2), 2.63-2.57 (TT, J = 13.3, 2.1 הרץ, 2H, C H COO 2), 2.04-1.93 (M, 4H, -C H 2 CH 2 OC = O), 1.70-1.56 (מ ', 4H, -C H 2 C H 2 COO), 1.48-1.38 (מ', 2H, - C H C (CH 3) 2), ו 0.84 (ים, 6H, C H 3 C-).

7. יצירת הפיגום אלסטומר 3D נקבובי שימוש או Hexamethylene diisocyanate (HDI) או 2,2-Bis (1-caprolactone-4-י.ל) פרופאן (BCP) 27 כפי crosslinkers (על פי גאו et al. 27)

  1. הכן תערובת אלסטומר תלת הזרוע באמצעות 0.75 גרם של SBC-αCLC ידי הוספת 0.25 מ"ל של HDI (או 0.45 מ"ל של BCP) ו 0.24 מ"ל של מונומר ε-caprolactone מזוקקים. להוסיף 60 μL של Sn (אוקטובר) 2. אם באמצעות BCP במקום HDI, לערבב SBC-αCLC ו BCP בעזרת מערבולת למקם אותם בתנור על 140 מעלות צלזיוס עד BCP מלא נמס ומתפוגג (שלב זה יכול להימשך עד 2 h). לאחר BCP כבר מומס, לקחת אותה מהתנור ו, את המספר הסידורי (אוקטובר) 2, ו מערבולת.
  2. הכין תבנית קצף ניקל "הקרבה" על ידי חיתוך פיסת מתכת סנטימטר 1 x 4. מרדד אותו מאחד הקצוות הקצרים כך הרול הסופי היא כ פיסת מתכת 1 x 1 סנטימטר (ראה איור 4).
  3. שים את קצף ניקל בתוך אריזת אלומיניום בקבוקון או אלומיניום זכוכית ויוצק את התערובת המוכנה בשלב 7.1 כדי לכסות את הקצף מלא עבור 2 דקות. הסר את התערובת העודפת עם pipet פסטר. עזוב את זה לכל הלילה בתנור על 80 מעלות צלזיוס.
  4. לקלף את רדיד האלומיניום או לשבור את הכוס. באמצעות סכין גילוח, לגלח אלסטומר ברחבי קצף מתכת לחשוף את המתכת ניקל.
  5. כן 1 ברזל M (III) כלוריד (FeCl 3) פתרון 100 מ"ל מים. מניחים את הקצף בבקבוק ולהוסיף 70 מ"ל של תמיסת 3 FeCl. מערבבים במשך שלושה ימים בטמפרטורת החדר ולשנות הפתרון FeCl 3 כל יום. לפני כל שינוי, לעורר את הקצף עם מים מיוננים, 0.5 h.
    הערה: תהליך האיכול מושלם בדרך כלל לאחר שלושה ימים. כדי להבטיח כי תהליך האיכול יושלם, לבצע בדיקות דחיסת מישוש עד הקצף מרגיש רך. התנגדות קצף כדי בדיקות דחיסת מישוש מעידה על קיומו של תבנית מתכת שיורית.
  6. יש לשטוף את Elastעומר קצף עם אתנול ומקום בחלל ריק בתנור הלילה בשעה 40 ° C.
  7. לאפיין את החומרים באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM), סריקה calorimetry דיפרנציאלי (DSC), בדיקות דחיסת מכני, ו גרווימטריה תרמית (TGA) 27.
    הערה: להכנת LCE 3D הידרופילי יותר, להחליף את SBC עם LBC (מוודא כי LBC מכיל גם מחצית LC) ביצוע השלבים המתוארים בשלב 7.5.

8. זריעה של הפיגום אלסטומר עם SH-SY5Y נוירובלסטומה תאים והתרבות שימוש בטכניקות סטריליות

  1. לעקר את אלסטומר ידי שטיפה פעמיים עם 1 מ"ל של אתנול 70%. בצעו קרינה UV במשך 10 דקות ולשטוף עם 1 מ"ל של אתנול 70%. יש לשטוף אותו פעמיים עם 1 מ"ל של מים סטריליים ו 1 מ"ל של פוספט שנאגרו מלוחים (PBS). מניחים את אלסטומרים צלחות תרבות 24-היטב.
  2. הכן בינוני צמיחת תאים עבור-SY5Y SH המכיל 90% Dulbecco השתנה הנשר בינוני (DMEM) supplemented עם 10% בסרום שור העובר (FBS) ו 1% פניצילין, סטרפטומיצין (עט-סטרפטוקוקוס).
  3. לאחר ספירת תאים באמצעות hematocytometer, להכין 1.5 x 10 5 תאים SH-SY5Y מושעה ב 100 μL של מדיום הגידול (פתרון זרע). מוסיפים את הפתרון על גבי אלסטומרים, והקפד ליצור ירידה.
  4. דגירה אלסטומרים זורעים C 37 ° ו 5% CO 2 עבור 2 h כדי לקדם את הידבקות התא. להוסיף 0.5 מ"ל של מדיום הגידול. דגירה שוב ב- C ° 37 עם 5% CO 2.
  5. שינוי המדיום פעם ביומיים לאחר שטיפה עם 1 מ"ל של PBS.

9. הדמיה מיקרוסקופית של Construct אלסטומר

  1. תקן את התאים גדלו לאלסטומרים עם 4% paraformaldehyde (PFA) ב PBS עבור 15 דקות. לשטוף עם 3 מיליליטר של שלוש פעמים PBS עבור 5 דקות כל אחד והמקום אלסטומר עם התאים הקבועים בצלוחית-תרבית עם coverslip מצורפת.
    זהירות: PFA הוא רעיל. ללבוש ביגוד מגן אישי מתאים (PPE).
  2. Staבדגימות קבוע עם 0.1% של 4' , 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ב 500 μL של PBS עבור 10 דקות ולשטוף פעמיים עם 1 מ"ל של PBS עבור 5 דקות.
  3. מייד תמונה אלסטומרים באמצעות מיקרוסקופיה confocal עם קרינת DAPI, רכישת ערימות תמונה שמשתרעות המדגם.
    הערה: כאן, ערימות תמונה נרכשו באמצעות אובייקטיבי 20X ו 60X מטרה.
  4. נתח את ערימות תמונת confocal האופטית באמצעות ImageJ 32.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דוח זה מציג את שיטת ההכנה של LCE 3D נקבובי כמו פיגום עבור תרבית תאים באמצעות תבנית מתכת ניקל. LCE 3D המתקבל מדגים רשת ערוץ ביניהם מורכבת המאפשרת חדירה לתא קל, כמו גם 27 להסעת המונים מתאים יותר. נמצא כי תאים מסוגלים לחדור לרשת הערוץ המחוברת באופן מלא והם גם מסוגלים ליישר בתוך LCE. הנה, קצף ניקל מטאל (99% ניקל, צפיפות של 860 גרם / ס"מ 2) נבחר בעקבות בגישה דומה להכנת קצף גרפן שפורסמו בעבר על ידי קונג ו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אלסטומרים גבישי נוזלים נחקרו לאחרונה כמו פיגומי תא ביולוגיים עקב היענות הגירויים שלהם. הם הוכחו להיות פלטפורמות אידיאליות כמו פיגומי תא. עם זאת, גורם חשוב לזכור בעת הכנה ועיצוב פיגום LCE חדש הוא נקבובי. השילוב של מוצקי leachable 23 או גזים לא תמיד לגרום נקבוביות הומוגנית או נקבובי מחובר באופן מלא. השימוש בתבנית מתכת שניתן משורטטת לא רק מציע את ההזדמנות להיות בעל מבנה פנימי יותר מאורגן רגיל, אלא גם מאפשר את הבחירה של גודל נקבובי וצפיפות. זה קשור ישירות לתבני...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

החוקרים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מבקשים להודות קנט סטייט (מענק מחקר שיתופי התמיכה ביוזמת רפואה רגנרטיבית באוניברסיטת קנט - ReMedIKS) עבור תמיכה כספית של הפרויקט הזה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyltriethoxysilaneAlfa AesarL16606חומר סילניזציה
2-bis(4-hydroxy-cyclohexyl)propaneTCIa href="http://www.tcichemicals.com/eshop/en/us/commodity/B0928/">B0928מגיב
2-chlorohexanone אלפא AesarA18613ריאגנט
2-הפטנון Sigma AldrichW254401ממס
2-פרופנול Sigma Aldrich278475Solvent
3-chloroperbenzoic acid, m-CPBASigma Aldrich273031Reagent
4-dimethylaminopyridineAlfaAesar A13016Reagent
4',6-diamidino-2-phenylindole, DAPI InvitrogenD1306כתם גרעיני
5-חומצה הקסינואית אלפא AesarB25132-06מגיב
חומצה אצטיתVWR36289ממס
אצטוןסיגמא אולדריץ'34850אלכוהול ממס
200 הוכחה ACS כיתה VWR71001-866מגיב
בנזןאלפא AesarAA33290 ממס
&אפסילון;-קפרולקטון Alfa AesarA10299-0Eמגיב
כלורופורםVWRBDH1109
כולסטרולסיגמא אולדריץ'C8503מגיב
תחמוצת כרום (VI)סיגמא אולדריץ'232653מגיב
נחושת (I) יודידStrem Chemicals100211-060ריאגנט
D,L-לקטיד Alfa AesarL09026מגיב
דיכלורומתאןסיגמא אולדריץ'320269ממס
דיאתיל אתר Emd MilliporeEX0190Solvent
N, N-DimethylformamideSigma Aldrich270547
Solvent Dulbecco' s מדיום נשר שונה, DEME CORNING Cellgo10-013מדיה תאית
אתנולאלפא Aesar33361ממס
פורמלדהיד SIGMA Life ScienceF8775
סרום בקר עוברי מקבע לעובר, FBS HyCloneSH30071.01רכיבי מדיה
, דרגה 415, איכותי, קרפVWR28320סינון
גליצרולסיגמא אולדריץ'G5516צומת מרכזי (3 זרועות)
הקסמתילן דיסוציאנט, HDISigma Aldrich52649Crosslinker
ברזל (III) כלוריד Alfa Aesar12357חומר תחריט
איזופרופיל אלכוהולVWRBDH1133ממס
מתנולAlfa AesarL13255Solvent
N, N'-dicyclohexylcarbodiimideAldrichD80002Solvent
N, N-DimethylformamideSigma Aldrich270547Solvent
תבנית מתכת ניקלאלמנטים אמריקאיםNi-860תבנית קצף
תאי נוירובלסטומה (SH-SY5Y)ATCCCRL-2266קו תאים
פניצילין סטרפטומיצין Thermo SCIENTIFIC15140122אנטיביוטיקה
פוליאתילן גליקול 2000, PEGAlfa AesarB22181מגיב
נתרן אזיד VWR97064-646מגיב
נתרן ביקרבונטAMRESCO865מלח ייבוש
נתרן כלוריBDHBDH9286מלח ייבוש
נתרן פוספט דו-בסיסי הפטהידראטפישר סיינטיפיקS-374ייבוש מלח
נתרן פוספט מונוהידראט מונו-בסיסיסיגמא אולדריץ'S9638ייבוש מלח
נתרן גופרתיSigma Aldrich239313מלח ייבוש
TetrahydrofuranAlfa Aesar41819ממס
Thiosulfate de נתרןAMRESCO393מלח ייבוש
פח (II) 2-אתיל הקסנואטAldrichS3252מגיב
טולואןאלפא Aesar22903ממס
טריאתילאמיןסיגמא אולדריץ'471283מגיב
טריפסיןHyCloneSH30042.01ניתוק תאים
אולימפוס FV1000
< ממס נייר סינון

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Khor, E., Lim, L. Y. Implantable applications of chitin and chitosan. Biomaterials. 24 (13), 2339-2349 (2003).
  2. Chung, H. J., Park, T. G. Surface engineered and drug releasing pre-fabricated scaffolds for tissue engineering. Adv. Drug Deliv. Rev. 59 (4-5), 249-262 (2007).
  3. Yakacki, C. M., Gall, K. Shape-Memory Polymers for Biomedical Applications. Shape-Memory Polymers. 226, 147-175 (2010).
  4. Agrawal, A., et al. Stimuli-responsive liquid crystal elastomers for dynamic cell culture. J. of Mat. Res. 30 (4), 453-462 (2015).
  5. Agrawal, A., Yun, T. H., Pesek, S. L., Chapman, W. G., Verduzco, R. Shape-responsive liquid crystal elastomer bilayers. Soft Matter. 10 (9), 1411-1415 (2014).
  6. Sharma, A., et al. Biodegradable and Porous Liquid Crystal Elastomer Scaffolds for Spatial Cell Cultures. Macromol. Biosci. 15 (2), 200-214 (2015).
  7. Yakacki, C. M., et al. Tailorable and programmable liquid-crystalline elastomers using a two-stage thiol-acrylate reaction. RSC Adv. 5 (25), 18997-19001 (2015).
  8. deGennes, P. G., Hebert, M., Kant, R. Artificial muscles based on nematic gels. Macromolecular Symposia. 113, 39-49 (1997).
  9. Fleischmann, E. -K., Zentel, R. Liquid-Crystalline Ordering as a Concept in Materials Science: From Semiconductors to Stimuli-Responsive Devices. Angew. Chem. Int. Ed. 52 (34), 8810-8827 (2013).
  10. Finkelmann, H., Kim, S. T., Munoz, A., Palffy-Muhoray, P., Taheri, B. Tunable mirrorless lasing in cholesteric liquid crystalline elastomers. Adv. Mater. 13 (14), 1069-1072 (2001).
  11. Artal, C., et al. SHG characterization of different polar materials obtained by in situ photopolymerization. Macromolecules. 34 (12), 4244-4255 (2001).
  12. Camacho-Lopez, M., Finkelmann, H., Palffy-Muhoray, P., Shelley, M. Fast liquid-crystal elastomer swims into the dark. Nat. Mater. 3 (5), 307-310 (2004).
  13. Yamada, M., et al. Photomobile polymer materials: Towards light-driven plastic motors. Angew. Chem. Int. Ed. 47 (27), 4986-4988 (2008).
  14. Ohm, C., Brehmer, M., Zentel, R. Liquid Crystalline Elastomers as Actuators and Sensors. Adv. Mater. 22 (31), 3366-3387 (2010).
  15. Fleischmann, E. -K., et al. One-piece micropumps from liquid crystalline core-shell particles. Nat. Commun. 3, (2012).
  16. Herzer, N., et al. Printable Optical Sensors Based on H-Bonded Supramolecular Cholesteric Liquid Crystal Networks. J. Am. Chem. Soc. 134 (18), 7608-7611 (2012).
  17. Lockwood, N. A., et al. Thermotropic liquid crystals as substrates for imaging the reorganization of matrigel by human embryonic stem cells. Adv. Funct. Mater. 16 (5), 618-624 (2006).
  18. Sharma, A., et al. Effects of structural variations on the cellular response and mechanical properties of biocompatible, biodegradable, and porous smectic liquid crystal elastomers. Macromol. Biosci. , In press (2016).
  19. Bera, T., et al. Liquid Crystal Elastomer Microspheres as Three-Dimensional Cell Scaffolds Supporting the Attachment and Proliferation of Myoblasts. ACS Appl. Mater. Interfaces. 7 (26), 14528-14535 (2015).
  20. Bera, T., Malcuit, C., Clements, R. J., Hegmann, E. Role of Surfactant during Microemulsion Photopolymerization for the Creation of Three-Dimensional Liquid Crystal Elastomer Microsphere Spatial Cell Scaffolds. Front. Mater. 3 (31), (2016).
  21. McKee, C. T., Last, J. A., Russell, P., Murphy, C. J. Indentation Versus Tensile Measurements of Young's Modulus for Soft Biological Tissues. Tissue Eng. Part B Rev. 17 (3), 155-164 (2011).
  22. Kung, C. -C., et al. Preparation and characterization of three dimensional graphene foam supported platinum-ruthenium bimetallic nanocatalysts for hydrogen peroxide based electrochemical biosensors. Biosens. Bioelectron. 52, 1-7 (2014).
  23. Amsden, B. Curable, biodegradable elastomers: emerging biomaterials for drug delivery and tissue engineering. Soft Matter. 3 (11), 1335-1348 (2007).
  24. Sinturel, C., Vayer, M., Morris, M., Hillmyer, M. A. Solvent Vapor Annealing of Block Polymer Thin Films. Macromolecules. 46 (14), 5399-5415 (2013).
  25. Riboldi, S. A., et al. Skeletal myogenesis on highly orientated microfibrous polyesterurethane scaffolds. J. Biomed. Mater. Res. A. 84 (4), 1094-1101 (2008).
  26. Chung, S., Moghe, A. K., Montero, G. A., Kim, S. H., King, M. W. Nanofibrous scaffolds electrospun from elastomeric biodegradable poly(L-lactide-co-epsilon-caprolactone) copolymer. Biomed. Mater. 4 (1), 9(2009).
  27. Gao, Y. X., et al. Biocompatible 3D Liquid Crystal Elastomer Cell Scaffolds and Foams with Primary and Secondary Porous Architecture. ACS Macro Lett. 5 (1), 14-19 (2016).
  28. Lenoir, S., et al. Ring-opening polymerization of alpha-chloro-is an element of-caprolactone and chemical modification of poly(alpha-chloro-is an element of-caprolactone) by atom transfer radical processes. Macromolecules. 37 (11), 4055-4061 (2004).
  29. Younes, H. M., Bravo-Grimaldo, E., Amsden, B. G. Synthesis, characterization and in vitro degradation of a biodegradable elastomer. Biomaterials. 25 (22), 5261-5269 (2004).
  30. Donaldson, T., Henderson, P. A., Achard, M. F., Imrie, C. T. Chiral liquid crystal tetramers. J. Mater. Chem. 21 (29), 10935-10941 (2011).
  31. Palmgren, R., Karlsson, S., Albertsson, A. C. Synthesis of degradable crosslinked polymers based on 1,5-dioxepan-2-one and crosslinker of bis-epsilon-caprolactone type. J. Pol. Sci. A Polym. Chem. 35 (9), 1635-1649 (1997).
  32. Rasband, W. S. ImageJ. , National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, USA. Available from: http://imagej.nih.gov/ij/ (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

A

מאמרים קשורים