הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הערכה של מאפייני תאי אנדותל באמצעות תרבית תאים 3D ושאינם-anticoagulated דם קרישה ואנטי דלקתיות

8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/56227

⸱

5 בספטמבר 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Clinical Research, University of Bern, 2Graduate School for Cellular and Biomedical Sciences, University of Bern, 3Immunology Research Centre, St. Vincent's Hospital Melbourne, 4Institute of Pathology, University of Bern, 5Institute of Molecular Animal Breeding and Biotechnology, Ludwig-Maximilian University

במאמר זה

סיכום

אנו מציגים במבחנה מודל המאפשר את מחקר וניתוח של קרישה בדם שאינו anticoagulated כולה,... בדיקות דם במערכת תלוי אפקט נוגד קרישה הטבעי של תאי אנדותל בריאים והתוצאה תא אנדותל הפעלת הקרישה.

תקציר

In vivo, תאי אנדותל מכריעים עבור בדיקות דם טבעי של כלי-דם. כתוצאה מכך, תאי אנדותל הפעלת מוביל דם קרישה. תופעה זו נצפית במצבים קליניים רבים, כמו השתלת איברים בנוכחות נוגדנים אנטי-תורם הקבועים מראש, כולל השתלת איברים מבעלי חיים, כמו גם איסכמיה/פגיעה reperfusion לפציעה. על מנת להפחית לניסויים בבעלי חיים על פי 3R סטנדרטים (צמצום, החלפה, עידון), במבחנה הדגמים כדי לחקור את ההשפעה של תאי אנדותל הפעלה על קרישת הדם יהיה רצוי מאוד. עם זאת, מערכות סטילס משותף התרבות תאי אנדותל מספקות יחס השטח לבנפח של 1-5 ס מ2 של אנדותל לכל מיליליטר דם, וזה לא מספיק עבור בדיקות דם טבעי, בתיווך אנדותל. Culturing תאי אנדותל על חרוזים microcarrier עשוי להגדיל את היחס בין השטח לבנפח 40-160 ס מ2/mL. יחס מוגבר זה מספיקה להבטיח את בדיקות דם "טבעי" של דם מלא, כך ניתן למנוע את השימוש תרופות נגד קרישת דם. כאן במבחנה microcarrier מבוססי מערכת מתואר לחקור את ההשפעות של ההנדסה הגנטית של תאי אנדותל חזירי על קרישת הדם של דם אנושי שלם, של אי-anticoagulated. ב וזמינותו המתואר, ראשי חזירי תאי אנדותל של אבי העורקים, או פראי סוג (WT) או הטרנסגניים האנושית CD46, thrombomodulin, היו גדל על microcarrier חרוזים, אז נחשפים דם אנושי טרי מצוירות בלתי-anticoagulated. דגם זה מאפשר מדידה של כימות של שחרור ציטוקינים, כמו גם הפעלת סמנים של המשלים קרישה בפלסמת הדם. בנוסף, הדמיה של תאי אנדותל מופעל, בתצהיר של immunoglobulins, חלבונים המשלים, קרישה על החרוזים endothelialized בוצעו על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. Assay הזה יכול לשמש גם כדי לבדוק תרופות אשר אמורים למנוע הפעלת תאי אנדותל ובכך, קרישת הדם. על הפוטנציאל שלו כדי להפחית את מספר בעלי החיים שבהם משתמשים לחקירות כאלה, וזמינותו המתואר הוא קל לביצוע, לשחזור באופן עקבי.

מבוא

אנדותל כלי הדם מורכב טפט של תאי אנדותל (EC) אשר קו לומן של כלי הדם. במצב פיזיולוגי, EC השבתה הדרגתית אחראים על קיום קרישה וסביבה אנטי דלקתיות. 1 זה מתווך על ידי הביטוי של קרישה, חלבונים אנטי דלקתיות על פני EC. לדוגמה, הפעלת EC הנגרמת על ידי פגיעה reperfusion/איסכמיה פציעה או כלי דם על ידי דחיית (קסנו-) מושתלים איברים תוצאות שינוי פני השטח אנדותל קרישה, מצב דלקתי של פרו-מקריש, הפרו דלקתיים המדינה. 1

ככל האפשר את האינטראקציה מרתק ומורכב בין הגורמים אנדותל, קרישה, מודלים במבחנה המחקות כמו המצב ויוו הם רצוי מאוד. מגבלה נפוצה המאפיינת קונבנציונאלי במבחנה מבחני קרישת הדם הוא השימוש של דם anticoagulated, מה שהופך את הניתוח של קרישת הדם בתיווך ההשפעות המפרך, אפילו recalcification של דם מלא citrated לא יכול להתרבות תוצאות השגה עם דם טרי ללא-anticoagulated. 2 . חוץ מזה, במערכות תרבות מסורתית תא שטוח-מיטה זה בלתי אפשרי לנצל את מאפייני אנדותל קרישה כמו משטח תא אנדותל מספיקות לכל נפח הדם לא יכול להגיע. המודל המוצג כאן מתגבר על מגבלות אלה על-ידי culturing EC על פני השטח של microcarrier כדורי חרוזים, כך יחס השטח-כדי-דם EC של > /mL216 ס"מ ניתן להגיע, בדומה למצב רבים קטנים או ורידים, ו אשר תוארה להיות מספיק כדי לאפשר בדיקות דם "טבעי" של הדם על ידי השטח EC. 3 , 4 דם יכול לשמש ללא קרישה נוסף בהגדרה זו. ניתן לאסוף דגימות דם במהלך הניסוי, ציטוקינים, פקטורי קרישה, סמני הפעלת המשלים מסיסים ועוזרת לכמת. יתר על כן, חרוזים מצופים EC microcarrier עשוי להיות מנותח התצהיר המשלים, אימונוגלובולינים, כמו גם הביטוי של EC הפעלה סמנים על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. יישום מעניין נוסף כולל בדיקה של תרופות אשר אמורים למנוע הפעלת תאי אנדותל ובכך, קרישת הדם. 5 . אף על פי מודל זה לחלוטין לא יכול להחליף ניסויים בבעלי חיים, הוא מציע שיטה לבדוק השערות ספציפיות תפקודית שמחוץ באמצעות תאים, ובכך להפחית את מספר בעלי החיים שבהם משתמשים במחקר בסיסי על איסכמיה/פגיעה reperfusion השתלת פציעה או (קסנו).

המודל שתואר שימש לחקות השתלת איברים מבעלי חיים הגדרת אילו חזירי תאי אנדותל של אבי העורקים (PAEC) גדל על החרוזים microcarrier, מודגרות עם דם אנושי שלם, ללא anticoagulated. PAEC הטרנסגניים שונים, נושאת מספר גנים אנושיים כגון CD46 הסדרת מערכת המשלים ו/או thrombomodulin (hTBM) הסדרת במערכת קרישת הדם, נותחו עבור מאפייניהם נוגד קרישה. מערכות הפעלה, המשלים, קרישה תא אנדותל הדוק נשלט, בינהם. 6 לכן חשוב להבין כיצד התאים הטרנסגניים שונים מתנהגים לאחר חשיפה דם אנושי ביחס אדהזיה מולקולה ביטוי ושחרור ציטוקינים, ששפך של glycocalyx ושל אובדן של חלבוני קרישה. 7

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

צמחי תרבות מסורתיים גרמנית חזירים (פראי סוג שחונך בבית חווה מקומיים ו הטרנסגניים bred המכון של גידול בעלי חיים מולקולרית, ביוטכנולוגיה, אוניברסיטת לודוויג-מקסימיליאן, מינכן, גרמניה), במשקל בין 30 ק ג עד 40 ק ג, שהיו בשימוש מחקר זה. כל החיות שוכנו בתנאים סטנדרטיים עם מים ומזון מודעה lib. כל הניסויים בוצעו על פי חוק חיות בבריטניה (וצפייה) המדריך NIH עבור הטיפול, שימוש של חיות מעבדה, כמו גם חוק שוויצרי. מחקרים שנעשו בבעלי חיים כל פעלו לפי ההנחיות יגיעו. הוועדה לניסויים בבעלי חיים של השירות הווטרינרי הקנטונים (קנטון של ברן, שווייץ) אישר כל ההליכים בבעלי חיים, רשות. לא. BE70/14. פרוטוקולים ניסיוני היו מעודנת על פי עקרונות 3R, המדינה-of-the-art הרדמה וניהול הכאב שימשו כדי לצמצם את מספר בעלי חיים, לצמצם את החשיפה של החיות מתח וכאב במהלך הניסויים.

דם אנשים בריאים שבסמל מערכת סגורה venipuncture על פי הנחיות השיפוט והאתיקה שוויצרי של בית החולים של אוניברסיטת ברן. הביטוי " הלא-anticoagulated דם " אומר כי הדם לא התייחסו עם קרישה לכל.

השלבים הבאים מבוצעות בתנאים סטריליים. היכרות עם התרבות התא הבסיסי סטרילי טכניקה נדרש.

1. בידוד של PAEC

הערה: אבי העורקים החזי מקטעים של 6 עד 10 ס מ, התקבלו לאללה חזירים גרמנית צמחי תרבות מסורתיים של 3 עד 6 חודשים של גיל (משמש לניסויים אחרים ב- vivo) ומיד הועבר לתוך בקבוק 500-מ"עמ המכיל אמצעי התעבורה (DMEM + 1% פניצילין/סטרפטומיצין).

  1. מראש מעיל צלחת 6-ובכן עם fibronectin 12.5 µg/mL ב- PBS 1 x ולמקם אותו באינקובטור ב 37 ° C עבור ה 1
  2. לחמם PBS עקר 1 x ותא תרבות בינוני (DMEM).
  3. להוציא את העורקים חזירי מאמצעי התחבורה.
  4. במקום אבי העורקים על צלחת פוליסטירן.
  5. לשטוף עם PBS חמה בעדינות מראש.
  6. לחתוך אבי העורקים longitudinally ותקן אותה באמצעות מחטים.
  7. להוסיף בינוני תרבות תא חמים על המשטח הפנימי כלי.
  8. תשאף בינוני התרבות תאים fibronectin ולהוסיף תא טריים תרבות בינוני (DMEM בתוספת 10% FBS, 1% פניצילין/סטרפטומיצין ו- 0.4% של תא אנדותל הצמיחה בינונית תוספת מיקס).
  9. לטבול מטלית כותנה אחד המדיום התרבות תאים. לנקות את ניצן צמר גפן על העליון של פני השטח הכלי הפנימי ובאיטיות באותו כיוון.
  10. לשפשף התאים באר אחת של 6-ובכן צלחת עגולה על ידי סיבוב.
  11. לעשות זאת גם עבור שאר הבארות.
  12. לבדוק תאים במיקרוסקופ ולמקם את הצלחת 6-ובכן חממה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
  13. לשנות את המדיום ביום השני ולשנות אותו שוב כל 2-3 ימים.
  14. כאשר תאים לא יהיו confluent, trypsinize תאים, זרע אותם לתוך בקבוקון T75 (PAEC P1).

2. אפיון PAEC

  1. מראש מעיל של chamberslide 8-ובכן עם fibronectin 12.5 µg/mL ב- PBS 1 x ולמקם אותו באינקובטור ב 37 ° C עבור ה 1
  2. זרע 5 x 10 4 תאים/טוב, דגירה בין לילה בחממה ב- 37 מעלות צלזיוס.
  3. לרחוץ את התאים פעמיים עם PBS ++ (PBS בתוספת CaCl 2 ו- MgCl 2), μL 300/טוב.
  4. לתקן תאים עם 3.7% paraformaldehyde 10 דקות בטמפרטורת החדר, μL 200/טוב.
  5. לרחוץ תאים 3 פעמים עם PBS ++, μL 300/טוב.
  6. להוסיף 300 μL של PBS 1 x-3_% BSA (מאגר חסימה) ולהשאיר 30 דקות בטמפרטורת החדר.
  7. להחיל נוגדנים הראשי (anti-VE-קדהרין, anti-CD31, אנטי-vWF) מדולל ב- PBS 1x-1%BSA-0.05% דטרגנט, μL 160/טוב, תקופת דגירה של h 1 בטמפרטורת החדר.
  8. לשטוף 3 פעמים עם PBS ++ (200 μL היטב).
  9. החל נוגדנים משניים, דאפי מדולל ב- PBS 1x-1%BSA-0.05% דטרגנט, μL 160/טוב, ולאחר תקופת דגירה של h 1 בטמפרטורת החדר.
  10. לשטוף 3 פעמים עם PBS ++ (200 μL היטב).
  11. הר שקופיות בינונית הרכבה המבוסס גליצרול ולוודא תא אנדותל ביטוי סמני תחת מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית.
    הערה: ניתן להגיע תרבות חזירי תאי אנדותל אבי העורקים בבקבוקון T175 (DMEM גלוקוז נמוך בינוני + 10% FBS, 1% פניצילין/סטרפטומיצין ו- 0.4% של תא אנדותל הצמיחה בינונית תוספת תערובת) עד 90% הנהרות. (זריעה צפיפות עונה 1 פרק 10 6 תאים, 90% הנהרות שיתאימו בערך 5 x 10 6 תאים).

3. ציפוי של חרוזים Microcarrier

  1. לערבב mL 7 של חרוזים microcarrier עם 42 מ של קולגן פתרון שפופרת 50-mL (100 μg/mL, מדולל ב- 0.2% חומצה אצטית פתרון), תקופת דגירה של h 1 בטמפרטורת החדר.
  2. לרחוץ חרוזים פעמיים עם 25 מ של PBS pH 7.4 (להוסיף 25 מ של PBS, מערבבים היטב עם pipet ולחכות עד החרוזים הם התיישבו ואז להשליך את תגובת שיקוע, חזור) פעם אחת עם 25 מיליליטר בינוני DMEM.
  3. מכסים את החרוזים לשפופרת 50-mL עם 10 מ"ל בינוני 199 בתוספת 10% FBS בסה כ, הפניצילין 1% / סטרפטומיצין, 1%-גלוטמין, 0.4% תא אנדותל הצמיחה בינונית תוספת תערובת ו 25 μL של הפארין (5000 IU/mL) ולאפשר equilibration 10 דקות לפני שימוש נוסף.

4. איסוף תאים

  1. להסיר המדיום התרבות תאים מן הבקבוק T175 המכיל PAEC ולהוסיף 5 מ של PBS pH 7.4.
  2. PBS להסיר מן הבקבוק T175.
  3. הוסף 5 מ של Trypsin-0.05% EDTA ואת תקופת דגירה של 3-4 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.
  4. לאסוף את התאים על ידי שטיפה את הבקבוק עם 15 מ"ל של התא תרבות בינוני ולהעביר את המתלים בשפופרת 50-mL-
  5. צנטריפוגה תאים ב g x 1,200 במשך 8 דקות בטמפרטורת החדר, הסר בינוני עודף, resuspend בגדר ב 5 מ של מדיום התרבות התא.

5. זריעה תאים לתוך הבקבוק קדירות

  1. להוסיף 20 מ של התא תרבות בינוני התליה תא, resuspend.
  2. להוסיף 20 מ"ל תא תרבות בינונית (ללא תאים) לתוך הבקבוק פלב מ 500-ל.
  3. להוסיף את התאים החרוזים microcarrier שטף מהשלב 3.3 ומערבבים היטב עם פיפטה סרולוגית 25-mL-
  4. להעביר את התערובת חרוזים/תא לתוך הבקבוק טווה מגנטי.
  5. שטוף הצינורית 50-mL עם 10 מ"ל של תא בינוני תרבות כדי לאסוף את התאים הנותרים.
  6. להוסיף אוטם 85 נוספים של התא תרבות בינוני הבקבוק טווה ולמקם אותו לתוך החממה ללון ב- 37 מעלות צלזיוס על מטרף (g 100 x, ערבוב מרווח: 3 דקות כל 45 min).
  7. להוסיף 50 מ של התא תרבות בינוני (נפח כולל 200 מ ל) ולהמשיך ערבוב במשך 24 שעות נוספות-37 מעלות צלזיוס על מטרף (g 100 x, ערבוב מרווח: 3 דקות כל 45 min).
  8. בינוני RPMI השקופה הוספה (בתוספת 10% FBS בסה כ, הפניצילין 1% / סטרפטומיצין, 1%-גלוטמין, 0.4% תא אנדותל הצמיחה בינונית תוספת תערובת ו 25 μL של הפארין) עד 320 מ של הנפח הכולל.
  9. להחליף את המדיום כל 48 ח': להסיר 100 מיליליטר המדיום הישן ולהוסיף 100 מ של טרי RPMI השקופה שהושלם.
  10. התרבות התאים במשך 5 עד 7 ימים. משך הזמן תלוי מצב זרימה של חרוזים מצופים תא.
< p class = "ג'וve_title "> 6. אימות הנהרות

  1. לאסוף μL 200 של חרוזים מצופים התא באמצעות פיפטה ולהעביר אותם לתוך צינור פוליפרופילן.
  2. לרחוץ את החרוזים 3 פעמים עם 600 μL של PBS 1 x (להוסיף PBS, להטות את שפופרת, מערבבים בעדינות כדי למנוע ניתוק של התאים, לחכות את החרוזים כדי להתיישב, למחוק את PBS וחזור).
  3. לתקן את החרוזים 10 דקות על-ידי הוספת μL 200 של חומצה parapicric.
  4. שטיפת 3 פעמים עם 600 μL של PBS 1 x.
  5. להוסיף דאפי מדולל ב- PBS 1 x דגירה במשך 10 דקות
  6. להעביר את החרוזים על משטח זכוכית ולהחיל את coverslip באמצעות המבוסס גליצרול הרכבה בינונית.
  7. להמחיש את החרוזים תחת מיקרוסקופ קונפוקלי.

7. ניתוח ניסיוני

  1. להסיר את החרוזים מצופים תא מן הבקבוק פגים (הליכים לא צריך להיעשות בתנאים סטריליים) עם פיפטה סרולוגית 10-mL ולהעביר אותם לתוך צינורות פוליפרופילן סיבוב המדרגה 12 mL-
  2. לתת החרוזים להתיישב (בסביבות 1-2 דקות) ולהסיר עודפי בינונית.
  3. להוסיף יותר חרוזים הצינורות עד כל שפופרת מכיל בדיוק 2 מ"ל של חרוזים.
  4. להוסיף 5-mL RPMI ברור כל שפופרת ומערבבים היטב בעזרת פיפטה סרולוגית 10-mL-
  5. לתת החרוזים להתיישב ולהסיר עודפי בינונית.
  6. חזור על הפעולות כביסה פעם נוספת עם RPMI ולהסיר כל עודף בינונית.

8. הדגירה בדם Non-anticoagulated

  1. לאט ובזהירות (באמצעות סילון וגם vacutainers) להוציא. דם מתנדבים בריאים ולאסוף זה 9 מ ל צינורות פוליפרופילן ניטרלי (לא נוגד קרישה).
  2. להעביר לאט 8 מ של דם עם פיפטה סרולוגית 10-mL לתוך כל צינורות פוליפרופילן המכיל 2 מ"ל של חרוזים מצופים תא (לנפח הכללי יהיה 10 מ ל). תמיד להימנע טיפול אגרסיבי של דם או חרוזים כדי למנוע הפעלת EC מוקדמת. ההליך לוקח 1-2 דקות
  3. בקפידה להטות את תערובת דם/חרוז כדי להבטיח ערבוב שווה. ואטמו את הכובע עם סרט פרפין.
  4. במקום הצינורות על טבלת הטיית אופקי (עם עדינה הגדרות הטיית בלבד) בתוך 37 ° C ואז הרשומה קרישת פעמים.
    1. במרווחי זמן קבועים, למשל אחרי 10, 20, 30, 50, 70, 90 דקות, להסיר לפחות 1.5-2 מ"ל של דם-חרוז תערובת לניתוח סרום או פלסמה.
      הערה: עבור 6 נקודות זמן אנו מציעים שיש יותר מ-3 משכפל בתוך קבוצה אחת של תאים, כפי שהדגימה הדם ייעשה צינורות שונים.
    2. אוסף של נסיוב, להשאיר את הדם והקרשה. כדי לאסוף הפלזמה, להוסיף EDTA או ציטראט 2 mL צינורות לפני הוספת דגימות דם.
    3. לאחסן הצינורות על קרח, צנטריפוגה ב g 2,500 x 10 דקות ב 4 ° C ו לאחסן סרום/פלזמה ב 80 ° C עד שימוש.
      הערה: פרטים על חומרים הינם מסופקים בכל טבלה של חומרים

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

לאחר 7-10 ימים של תרבות בתוך הבקבוק טווה (איור 1) התאים היו confluent, מכסה את כל המשטח של חרוזים microcarrier (איור 2). אימות של המדינה confluency היא צעד חשוב כי טפט הלא-confluent של EC-גרגרי יוביל ירידה ניכרת במסגרת זמן קרישת דם, בהתחשב microcarrier פני השטח של חרוזים היא חריפה פרו-מקריש (זמן הקרישה: 4 ± 1 דקות) ( איור 3).

נקודה חשובה נו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

המודל המוצג כאן מתאים קרישה הקשורות לימודי המאפשר הניתוח של היבטים שונים של קרישת הדם והאינטראקציה שלו עם לכלכלת 8 במחקר השתלת איברים מבעלי חיים, זוהי מערכת שימושי כדי לבדוק את מאפייני קרישה שונים ECs חזירי מהונדסים לאחר דגירה עם דם אנושי 9.

השלבים הקריטיים ביותר של הפרוטוקול הם אלה המבטיח כיסוי תא מלאה (confluency) של גרגרי לפני תחילת הניסוי ואלה הנוגעים האוסף זהיר וטיפול של כל הלא-anticoagulated הדם כדי להימנע מוקדמת הפעלת טסיות עקב גזירה גבוהה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

מחקר זה נתמך על ידי קרן המדע הלאומית השוויצרית (SNSF, 320030_156193 מענק מס). המחברים תודה ד ר בנואה Werlen למתן את החרוזים microcarrier Biosilon. אנו מודים גם פרופסור הנס פיטר קולר, פרופסור אנדרה Haeberli לקבלת עזרה בהתקנת הדגם חרוז microcarrier.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
PAECמבודד מאבי העורקים של חזיר
בחרוזי מיקרו-נשא במעבדה שלנו (Biosilon)Thermo Fisher Scientific160-250
Collagen I, בקרGibcoA10644-01
DMEMGibco21885-025
בינוני 199SigmaM7528
RPMIGibco32404-014
צינורות ניטרלייםSarstedt02.1726.001
צינורות פוליפרופילןSimportT406-2A
צלוחיות בוחשTecnomara
בוחש ביולוגיBrouwerMCS-104S
חולדה אנטי CD31R& D SystemsMAB33871דילול 1:100
דילול עיזים נגד חולדות IgG-Cy3Jackson Immuno Research112-166-003דילול 1:500
עיזים נגד VE-cadherinסנטה קרוזsc-6458דילול 1:100
ארנב נגד vWFDAKOA0082דילול 1:100
Dk anti Gt IgG – Alexa 488בדיקות מולקולריותA11055דילול 1:500
עיזים נגד ארנב - FITCSouthern Biotech4050-02דילול 1:500
DAPISigma32670-25MG-Fדילול 1 ומיקרו; גרם/מ"ל
0.05% טריפסין-EDTAGibco25300-054
FBSGibco10270-106ריכוז: 10% במדיום תרבית תאים
מתאםSarstedt14.1205
מיקרוסקופ קונפוקליCarl ZeissLSM 710
תוכנת ניתוח תמונהJזמין בחינם ב: https://imagej.net
תוסף תזונה בינוני לצמיחת תאי אנדותלMixPromoCellC-392162 מ"ל ב-500 מ"ל של DMEM
פניצילין סטרפטומיציןGibco15140-122ריכוז: 1% במדיום תרבית תאים
L-גלוטמיןGibco25030-024ריכוז: 1% במדיום תרבית תאים
Heparinun natricumDrossa Pharm AGריכוז מלאי: 5000 U.I./mL
ChamberslidesBioswisstec AG30108
CaCl2 x 2H2OMerck2382.0500
MgCl2 x6 H2OMerck1.5833.1000
Tween 20Axon Lab AG9005-64-5
אלבומין סרום בקר (BSA)SigmaA7030
מדיום הרכבה גליצרג'לDakoC0563

מקורות

  1. Rajendran, P., et al. The vascular endothelium and human diseases. Int. J. Biol. Sci. 9, 1057-1069 (2013).
  2. Rajwal, S., Richards, M., O'Meara, M. The use of recalcified citrated whole blood - a pragmatic approach for thromboelastography in children. Pediatric Anesthesia. 14, 656-660 (2004).
  3. Kohler, H. P., Muller, M., Mombeli, M., Mtraub, M. M., Maeberli, M. The Suppression of the Coagulation of Nonanticoagulated Whole-Blood in-Vitro by Human Umbilical Endothelial-Cells Cultivated on Microcarriers Is Not Dependent on Protein-C Activation. Thromb. Haemost. 73, 719-724 (1995).
  4. Biedermann, B., Rosenmund, A., Muller, M., Kohler, H. P., Haeberli, A., Straub, P. W. Human endothelial cells suppress prothrombin activation in nonanticoagulated whole blood in vitro. J. Lab. Clin. Med. 124, 339-347 (1994).
  5. Banz, Y., Cung, T., Korchagina, E. Y., Bovin, N. V., Haeberli, A., Rieben, R. Endothelial cell protection and complement inhibition in xenotransplantation: a novel in vitro model using whole blood. Xenotransplantation. 12, 434-443 (2005).
  6. Cowan, P. J., d'Apice, A. J. Complement activation and coagulation in xenotransplantation. Immunology and Cell Biology. 87, 203-208 (2009).
  7. Reitsma, S., Slaaf, D. W., Vink, H., van Zandvoort, M. A. M. J., oude Egbrink, M. G. A. The endothelial glycocalyx: composition, functions, and visualization. Pflugers Arch. 454, 345-359 (2007).
  8. Wiegner, R., Chakraborty, S., Huber-Lang, M. Complement-coagulation crosstalk on cellular and artificial surfaces. Immunobiology. 221, 1073-1079 (2016).
  9. Bongoni, A. K., et al. Transgenic Expression of Human CD46 on Porcine Endothelium: Effect on Coagulation and Fibrinolytic Cascades During Ex Vivo Human-to-Pig Limb Xenoperfusions. Transplantation. 99, 2061-2069 (2015).
  10. Miyazaki, Y., et al. High shear stress can initiate both platelet aggregation and shedding of procoagulant containing microparticles. Blood. 88, 3456-3464 (1996).
  11. Wuensch, A., et al. Regulatory Sequences of the Porcine THBD Gene Facilitate Endothelial-Specific Expression of Bioactive Human Thrombomodulin in Single-and Multitransgenic Pigs. Transplantation. 97, 138-147 (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

הערכה של מאפייני תאי אנדותל באמצעות תרבית תאים 3D ושאינם-anticoagulated דם קרישה ואנטי דלקתיות
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.