מאמר שיטה

זרמים שלמים-תא המושרה על ידי יישום עלים של GABA במוח פרוסות

DOI:

10.3791/56387

⸱

12 באוקטובר 2017

 ,  ,  , 
1School of Psychology, South China Normal University, 2School of Life Sciences, South China Normal University, 3Brain Science Institute, South China Normal University, 4Center for Studies of Psychological Application, South China Normal University, 5Guangdong Key Laboratory of Mental Health and Cognitive Science, South China Normal University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים את הטכניקה פאף, שלפיו ריאגנטים תרופתי יכול להינתן במהלך ההקלטה תאים כל תיקון-קלאמפ, להאיר היבטים שונים של תכונות חיוניות להצלחתו.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניהול תרופתי הוא נפוץ בעת עריכת תיקון שלם-תא-הקלטה לפרוסות המוח קלאמפ. אחת השיטות הטובות ביותר של יישום סמים במהלך ההקלטה אלקטרופיזיולוגיות היא הטכניקה פאף, אשר יכול לשמש כדי לחקור את ההשפעה של ריאגנטים תרופתי על הפעילות העצבית במוח פרוסות. היתרון הגדול ביותר של יישום פאף הוא כי ריכוז התרופה סביב האתר הקלטה מגביר במהירות, ובכך למנוע הפחתת רגישות של קולטני ממברנה. שימוש מוצלח של יישום עלים כרוך תשומת-לב רבה הרכיבים הבאים: ריכוז התרופה, הפרמטרים של micropipette עלים, המרחק בין הקצה של micropipette עלים, נוירון מוקלט, וכן את משך הזמן ואת הלחץ נהיגה אצלם (פאונד לאינץ ' מרובע, psi). מאמר זה מתאר הליך שלב אחר שלב עבור הקלטה זרמים שלמים-תא המושרה על-ידי נשיפת גאמא אמינו בוטירית (GABA) אל נוירון פרוסת קליפת המוח הקדם חזיתית. ראוי לציין, ניתן להחיל את ההליך עם שינויים מזעריים באזורים אחרים במוח כגון ההיפוקמפוס סטריאטום את, תכשירים שונים, כגון תרביות תאים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הטכניקה תיקון-קלאמפ, כלי ראשי עבור חוקרים אותות חשמליים בנוירונים, פותחה בשנות ה-701,2. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא שהיא מספקת ידע על טיפולים כמה ספציפית (למשל, תרופתי) רשאית לשנות פונקציות עצביים או ערוצים בזמן אמת3. תרופתי הערכה של תפקוד במהלך הקלטת בפרוסה במוח תאים כל דורש היישום של תרופות, כגון אגוניסטים או היריבים של רצפטורים ספציפיים, כדי הנוירונים מוקלטת. שיטה זו מאפשרת זיהוי שינויים עצביים להתרחש בעקבות בקשה של תרופה ספציפית, ובכך מוביל הבנה טובה יותר של מאפיינים פיזיולוגיים ופתולוגיים של נוירונים4. למרות ניהול תרופתי יכול להתבצע באמצעות גם זלוף5 או עלים6, האחרון הוא טכניקה מעולה. בפרט: (i) פחזנית יישומים במהירות מגביר סמים ריכוז סביב מוקלטת הנוירון לרמה כזאת הפחתת רגישות של קולטני ממברנה נמנעת; (ii) את עוצמת הקול של סמים נשענתי הוא נמוך ביותר, כך שקיימת השפעה מועטה על הפתרון אמבט, ולפיכך מפחית תופעות בלתי רצויות של הכימיקלים מנוהלת על פרוסות המוח; (iii) פרוטוקול עלים ניתן להגדיר ונשמר, ביצוע הניסוי ברמת דיוק גבוהה ביותר לשחזור; (iv) עלים יישום מייצג שימוש חסכוני אגוניסטים/antagonists, במיוחד כאלה ריאגנטים איפה יקר או קשה להשיג.

כאן, אנו נתמקד להקליט זרמים שלמים-תא המושרה על-ידי נשיפת גאבא פרוסות המוח בחריפות מוכן, הכנה זה יש את היתרון של מעגלים המוח יחסית שמור היטב. התנהלותינו פאף-induced זרמי מעכבות7 שמתואר במאמר זה. באמצעות צסיום (Cs+)-מבוסס פתרונות פנימי, והחזקת הנוירונים ב 0 mV, תציג לנו גאבא. פאף עורר זרמי postsynaptic מעכבות (eIPSCs) עם הפרטים הטכניים המתאימים. באמצעות מודל של העכבר של דיכאון הנגרם על ידי הזרקת ליפופוליסכריד (LPS)8, אנו מראים את eIPSC משרעת עורר על ידי שאיפה גאבא פוחת באופן משמעותי בפרוסות של הזרקת LPS עכברים לעומת הרכב שולט. הכוונה שלנו היא כי מאמר זה צריך להראות איך הטכניקה עלים ישימה באופן נרחב על מחקרים שמטרתם הערכת ההשפעה של כימיקלים, תרכובות או סמים על הפעילות העצבית במוח פרוסות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דיור חיה ובהמה כל הניסויים נערכו בהתאם לנהלים אושרו על ידי ועדת האתיקה לחקר בעלי חיים באוניברסיטה רגילה סין דרום, על פי הנחיות חיה אכפת שהוקם על ידי המכון הלאומי של בריאות-

1. ההכנה של פתרונות

  1. להכין 500 מל סטנדרטי מלאכותי השדרתי (כלנית חדד) המכיל את הרכיבים שמתואר שלנו עבודה שפורסמה 7 כמפורט בטבלה 1.
    1. זכוכית נקי שימוש בקבוקונים עם מים יונים להכין פתרון חנה המבר טריים. יבש לפני השימוש כדי להוסיף NaH NaCl, אשלגן כלורי, ונקי שפכטלים עם מים יונים 2 PO 4, NaHCO 3, MgSO 4, D-גלוקוז, ולהוסיף את CaCl 2 לאחר נתקל מבעבע הפתרון עם 95% O 2 / 5% CO 2 התערובת ~ 20 דקות (כמו טבלה מפורטת ב 1) 500 מ של מים יונים. מערבבים עד להתמוססות מלאה.
    2. ודא חנה המבר אינו לגמרי נקה ללא משקעים כלשהם. ואז להתאים את ה-pH ל 7.2-7.4. בועה עם תערובת גז המורכבת של 95% O 2 ו- 5% CO 2 ~ 20 דק...
  2. להכין 250 מ של פתרון חיתוך פרוסה המכיל כימיקלים 7 המתוארות בטבלה 2.
    1. להוסיף אשלגן כלורי, MgCl 2, 2 PO NaH 4, NaHCO 3, choline·Cl, D-גלוקוז, להוסיף CaCl 2 אחרונה כמצוין ב 1.1.1, 250 מ של מים יונים, להתמוסס כפי שמתואר ב 1.1.1 ו 1.1.2.
    2. לאחר שמבעבע עם 95% O 2 / 5% CO 2, המקום הפתרון במקפיא למשך 15-20 דקות כך הפתרון חיתוך הופך קר כקרח, קפוא חלקית.
      הערה: אנו משתמשים פתרון חיתוך זה בעת ביצוע פרוסות מהחודש 1-2-עכברים הישן; הנוסחה עשויים להיות שונים עבור עכברים שגילן עולה על 2 חודשים-
    3. LPS להכין פתרון על ידי המסת בתוך תמיסת מלח ללא אנדוטוקסין מול סטרילי (0.9% NaCl). LPS הוא מנוהל intraperitoneally (0.5 מ ג/ק ג) ולהתחיל הקלטה שעתיים מאוחר יותר.

2. הכנה של פרוסת קליפת המוח הקדם חזיתית

  1. הפתרון חיתוך מוציאים מהמקפיא, homogenize כדי להשיג את הרפש. למקם את הפתרון על קרח, בועה כל הזמן עם 95% O 2 / 5% CO 2.
  2. באמצעות מספריים גדולים, חדה, במהירות לערוף עכבר כפי שמתואר 9, מיד לשים את הראש לתוך גביע מלא קפואים (0-4 ° C) חיתוך פתרון.
  3. העליון של הגולגולת לאורך הקו האמצעי בכיוון סימטרית-כדי-אפיים עם מספריים בסדר גזורה להסיר את החלקים הגולגולת לרוחב. מסירים את המוח עם מרית בסדר, ירידה אל תוך קר כקרח חיתוך פתרון.
    הערה: השלבים 2.2-2.3 חייב להיעשות במהירות (אידיאלי < 1 דקות).
  4. במקום את המוח על המכסה של צלחת פטרי 9 ס מ מלא קרח. יש לשטוף את המוח עם פתרון חיתוך קר כקרח. לחתוך את המוח ואת הריח הנורה עם סכין גילוח.
    5. מחזיק
  5. החל הדבק דבק מגע אל הדגימה vibratome. בזהירות המקום הרחוב המוח על המסירה של דבק, rostral לקצה, ואני מיד לטבול בתמיסה קרה כקרח חיתוך.
  6. להתאים בעל להב vibratome כדי זווית של 15° ביחס במישור האופקי ולהכין 350-מיקרומטר פרוסות המוח הילתית (תדר הרטט להב = 85 הרץ, מהירות = 0.1 מ מ/s).
  7. משתמש של פיפטה, העברת הפרוסות לחדר התאוששות מלאה כלנית חדד, דגירה עבור 1 h (RT) עם בעבוע מתמדת של 95% O 2 / 5% CO 2.

3. הקלטה תיקון שלם-תא

micropipettes
  1. להפוך זכוכית בורוסיליקט עבור משתמשים כמו הקלטה אלקטרודות או פחזנית micropipettes על פי הנחיות ספציפיות במדריך מבצע פולר. הקלטה אלקטרודות, עצה התנגדויות הן בטווח 4-6 מ' Ω, בעוד עלים micropipettes יש עצה קטרים בטווח של 2-5 מיקרומטר.
  2. להוסיף חוסם ערוץ Na + (TTX, 1 מיקרומטר), רחוב Na + מהיר ערוץ ובכך פוטנציאל פעולה, כדי כלנית חדד, לשמור על קצב זרימה מתמדת של פתרון זה של 2-3 mL/min בתא ההקלטה, על ידי משאבת סחרור לתוך החדר שאיפה מזה. בועה של כלנית חדד עם 95% O 2 / 5% CO 2 כל הזמן כדי להבטיח את הכדאיות של הפרוסות.
  3. העברת פרוסה המוח אל החדר הקלטה באמצעות פיפטה פסטר ששונה עצה בסדר אשר נחתך כדי להתאים את גודל הפרוסה. לכסות את הפרוסה עם עוגן פרוסה פלטינה עם חוטי ניילון מקבילים במרווחים ≥ 2 מ מ לגזרים, להחזיק את הפרוסה על הרציף.
  4. למלא את micropipette הקלטה עם הפתרון הפנימי 7 (טבלה 3), ולמלא את micropipettes עלים עם GABA-10 מיקרומטר, 50 מיקרומטר, ו 100 מיקרומטר (מומס כלנית חדד), או חנה המבר כפקד הרכב.
  5. כדי למנוע סתימה עם פסולת, החל לחץ חיובי קל באמצעות מזרק 1 מ"ל לפני הטבעית האלקטרודה הקלטה ב חנה המבר. שימוש של micromanipulator תחת מיקרוסקופ (עדשה המטרה x 4), מקם את ההקלטה אלקטרודה ואת פאף micropipette כך הטיפים מופיעים במרכז של תמונת הוידיאו על המסך ( איור 1 א').
  6. להתאים את המוקד מיקרוסקופ (40 x עדשה המטרה) תוך כדי הנמכת בהדרגה את micropipette עלים ומניחים אותו מעל נוירון הקלטה בזווית של 45°. שמור על המרחק בין קצה micropipette עלים נוירון שנרשם בין 20-40 µm ( איור 1 B). לאט ובזהירות לגשת הנוירון עם האלקטרודה הקלטה ולאחר מכן שחרר את הלחץ. החלת יניקה חלש ולא קצרה דרך הצנרת מחובר למחזיק אלקטרודה ליצירת גושפנקה גיגה אוהם.
  7. שמור על המתח ב 0 mV. לאחר היווצרות החותם גיגה אוהם, לפצות על מהר ולאט קיבוליות באופן ידני או אוטומטי. לאחר מכן החל יניקה קצר וחזק דרך הצנרת הנ ל כדי להגיע למצב השלם-תא.
    8. מצב
  8. eIPSC רשומה במתח-קלאמפ. חלות לחץ דלק נמוך (חנקן, 4-6 psi) micropipette עלים באמצעות Picospritzer הנשלט על-ידי גנרטור שלב מתח מאסטר 8 כדי לספק יחיד או מזווג גאבא פחזניות ( איור 2).
  9. לשנות את המשך עלים כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר eIPSC ( איור 3) ולמדוד את eIPSC במודל דיכאון LPS-induced ( איור 4).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הטכניקה עלים מאפשר לחוקרים לחקור את השפעת הסמים על קולטנים מסוימים על פני השטח של נוירון מסוים. במאמר זה, אנו מתמקדים זרמי מתווך על ידי קולטני GABA. איור 1 מציג את micropipettes הקלטה של עלים. כדי למנוע השפעה על נוירונים מוקלטות של הלחץ הפיזי שנוצר על ידי והגראס, חנה המבר ומשמשים פחזניות סוכרוז (איור 2א) כפקדים. התגובה המושרה על ידי שאיפה גאבא (שחור) יכול להיחסם על ידי מעכב קולטן GABA, כגון picrotoxin כמו שדווח

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עלים היישום נעשה שימוש נרחב כדי להעריך את קולטן postsynaptic פונקציה3,4,7, אך דורש שליטה מדויקת ניסוי. נתאר כאן הליך לערב שלם-תא תיקון מחבר חובק למעקה, אשר מדגים ש-GABA-פאף המושרה IPSCs (קרי eIPSCs) פרוסות המוח הקדם חזיתית בקליפת המוח. התנגדותם של האלקטרודה הקלטה MΩ כ-5, בעוד הקוטר עצה של עלים micropipettes היא על 2-5 מיקרומטר. פאף לחץ הוא בין 4-6 psi: טווח זה הוא קריטי, כמו לחץ גבוה עלול לגרום נזקים עצביים, בזמן לחץ נמוך יכול ל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים רוצה להודות הארגונים הבאים: הלאומי מדעי הטבע קרן של סין (31171018, 31171355), מדע, טכנולוגיה החלוקה של גואנג-דונג (2013KJCX0054), בסיס מדעי הטבע של בפרובינצית גואנג-דונג ( 2014A030313418, 2014A030313440), ואת גואנגג'ואו מדע, טכנולוגיה הלשכה (201607010320).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מכשירי תריסמיקרופיפטות בורוסיליקט מזכוכיתBF150-86-10קוטר חיצוני 1.50 מ"מ; 0.86 מ"מ קוטר פנימי
מכשירי תריסחולץ מיקרופיפטהדגם P-97 חולץ מיקרופיפטה בוער/גבות
מיקרומניפולטוריםמכשירי תריסMP-285
מגבר נשלט על ידי מחשב     התקנים מולקולרייםMulticlamp 700B
מערכת רכישה דיגיטלית התקנים מולקולרייםDigidata 1440A
מצלמת הדמיהNikon 2115001מכשור פיקוח
מיקרוסקופיה ניקון ליקוי חמה FN1 
מאסטר 8A.M.P.I.Master-8 ממריץ
ויברטום פורסLeicaVT 1000S
סכין גילוחג'ילט74-Sפליינג איגל
צג וידאוPanasonicWV-BM 1410
502 דבקמעדנייה7146ציאנואקרילט דבק
משאבה פריסטלטיתשנחאי JIA PENG CorporationBT100-1F
מצלמת וידאואולימפוס אמריקה רפואיתOLY-150
פיפטס העברהBiologix30-0138A1
דופק

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).
  2. Sakmann, B., Edwards, F., Konnerth, A., Takahashi, T. Patch clamp techniques used for studying synaptic transmission in slices of mammalian brain. Q J Exp Physiol. 74 (7), 1107-1118 (1989).
  3. Eyo, U. B., et al. Neuronal hyperactivity recruits microglial processes via neuronal NMDA receptors and microglial P2Y12 receptors after status epilepticus. J Neurosci. 34 (32), 10528-10540 (2014).
  4. Dickinson, G. D., Parker, I. Factors determining the recruitment of inositol trisphosphate receptor channels during calcium puffs. Biophys J. 105 (11), 2474-2484 (2013).
  5. Lee, J., et al. Columnar distribution of activity dependent gabaergic depolarization in sensorimotor cortical neurons. Mol Brain. 5, 33(2012).
  6. Glykys, J., Mody, I. The main source of ambient GABA responsible for tonic inhibition in the mouse hippocampus. J Physiol. 582, (Pt 3) 1163-1178 (2007).
  7. Chen, M., et al. APP modulates KCC2 expression and function in hippocampal GABAergic inhibition. Elife. 6, (2017).
  8. Dunn, A. J., Swiergiel, A. H. Effects of interleukin-1 and endotoxin in the forced swim and tail suspension tests in mice. Pharmacol Biochem Behav. 81 (3), 688-693 (2005).
  9. Engel, D. Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons. J Vis Exp. (117), (2016).
  10. Wondolowski, J., Frerking, M. Subunit-dependent postsynaptic expression of kainate receptors on hippocampal interneurons in area CA1. J Neurosci. 29 (2), 563-574 (2009).
  11. Yang, L., Wang, Z., Wang, B., Justice, N. J., Zheng, H. Amyloid precursor protein regulates Cav1.2 L-type calcium channel levels and function to influence GABAergic short-term plasticity. J Neurosci. 29 (50), 15660-15668 (2009).
  12. Huo, Q., et al. Prefrontal Cortical GABAergic Dysfunction Contributes to Aberrant UP-State Duration in APP Knockout Mice. Cereb Cortex. , (2016).
  13. Zhou, W. L., Gao, X. B., Picciotto, M. R. Acetylcholine Acts through Nicotinic Receptors to Enhance the Firing Rate of a Subset of Hypocretin Neurons in the Mouse Hypothalamus through Distinct Presynaptic and Postsynaptic Mechanisms. eNeuro. 2 (1), (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Patch clampGABAVoltage ClampIPSC

מאמרים קשורים